Summary
Denne protokollen beskriver den obligatoriske fôringsanalysen for å evaluere den potensielt toksiske effekten av et fytokjemikalie på lepidopteraninsektlarver. Dette er en svært skalerbar insektbioassay, lett å optimalisere den subletale og dødelige dosen, avskrekkende aktivitet og fysiologisk effekt. Dette kan brukes til screening av miljøvennlige insektmidler.
Abstract
Helicoverpa armigera, et lepidopteran insekt, er et polyfagøst med en verdensomspennende distribusjon. Dette plantelevende insektet er en trussel mot planter og landbruksproduktivitet. Som svar produserer planter flere fytokjemikalier som negativt påvirker insektets vekst og overlevelse. Denne protokollen demonstrerer en obligatorisk fôringsanalysemetode for å evaluere effekten av et fytokjemisk (quercetin) på insektvekst, utvikling og overlevelse. Under kontrollerte forhold ble de nyfødte opprettholdt til den andre stjernen på en forhåndsdefinert kunstig diett. Disse andre instar larver fikk lov til å mate på en kontroll og quercetin-inneholdende kunstig diett i 10 dager. Insektenes kroppsvekt, utviklingsstadium, frassvekt og dødelighet ble registrert annenhver dag. Endringen i kroppsvekt, forskjellen i fôringsmønster og utviklingsfenotyper ble evaluert gjennom analysetiden. Den beskrevne obligatoriske fôringsanalysen simulerer en naturlig inntaksmodus og kan skaleres opp til et stort antall insekter. Det tillater en å analysere fytokjemikaliers effekt på vekstdynamikken, utviklingsovergangen og den generelle kondisjonen til H. armigera. Videre kan dette oppsettet også brukes til å evaluere endringer i ernæringsparametere og fordøyelsesfysiologiske prosesser. Denne artikkelen gir en detaljert metodikk for fôringsanalysesystemer, som kan ha anvendelser i toksikologiske studier, insekticid molekylscreening og forståelse av kjemiske effekter i plante-insektinteraksjoner.
Introduction
De biotiske faktorene som påvirker avlingens produktivitet er hovedsakelig patogene midler og. Flere forårsaker 15% til 35% av avlingstapet i landbruket og påvirker økonomisk bærekraftspraksis1. Insekter som tilhører ordrene Coleoptera, Hemiptera og Lepidoptera er de viktigste ordrene av ødeleggende. Miljøets svært tilpasningsdyktige natur har vært til nytte for lepidopteraner i utviklingen av flere overlevelsesmekanismer. Blant lepidopteraninsekter kan Helicoverpa armigera (bomullsbollorm) spise rundt 180 forskjellige avlinger og forårsake betydelig skade på reproduksjonsvevet2. På verdensbasis har H. armigera-angrep resultert i et tap på rundt 5 milliarder dollar3. Bomull, kikerter, duerter, tomater, solsikker og andre avlinger er verter for H. armigera. Den fullfører livssyklusen på forskjellige deler av vertsplanter. Egg lagt av kvinnelige møll blir klekket på bladene, etterfulgt av deres fôring på vegetativt vev under larvestadier. Larvestadiet er det mest ødeleggende på grunn av sin glupske og svært tilpasningsdyktige natur 4,5. H. armigera viser en global distribusjon og inngrep i nye territorier på grunn av sine bemerkelsesverdige egenskaper, som polyfagi, gode trekkevner, høyere fruktbarhet, sterk diapause og fremveksten av motstand mot eksisterende insektkontrollstrategier6.
Ulike kjemiske molekyler fra terpener, flavonoider, alkaloider, polyfenoler, cyanogene glukosider, og mange andre er mye brukt for kontroll av H. armigera angrep7. Imidlertid gir hyppig bruk av kjemiske molekyler negative effekter på miljøet og menneskers helse på grunn av oppkjøpet av rester. De viser også en skadelig effekt på ulike skadedyrsrovdyr, noe som resulterer i en økologisk ubalanse 8,9. Derfor er det nødvendig å undersøke sikre og miljøvennlige alternativer for kjemiske molekyler av skadedyrsbekjempelse.
Naturlige insektdrepende molekyler produsert av planter (fytokjemikalier) kan brukes som et lovende alternativ til kjemiske plantevernmidler. Disse fytokjemikaliene inkluderer forskjellige sekundære metabolitter som tilhører klassene alkaloider, terpenoider og fenoler 7,10. Quercetin er en av de mest tallrike flavonoider (fenolforbindelse) som finnes i forskjellige korn, grønnsaker, frukt og blader. Det viser fôring avskrekkende og insekticid aktivitet mot insekter; Det er heller ikke skadelig for naturlige fiender av11,12. Dermed demonstrerer denne protokollen fôringsanalysen ved bruk av quercetin for å vurdere dens toksiske effekt på H. armigera.
Ulike bioassay-metoder er utviklet for å evaluere effekten av naturlige og syntetiske molekyler på et insekts fôring, vekst, utvikling og atferdsmønstre13. Vanlige metoder inkluderer bladskiveanalysen, valgfôringsanalysen, dråpefôringsanalysen, kontaktanalysen, diettdekkende analyse og obligatorisk fôringsanalyse13,14. Disse metodene er klassifisert basert på hvordan plantevernmidler brukes på insekter. Den obligatoriske fôringsanalysen er en av de mest brukte, sensitive, enkle og tilpasningsdyktige metodene for å teste sannsynlige insektmidler og deres dødelige dose14. I en obligatorisk fôringsanalyse blandes molekylet av interesse med et kunstig diett. Dette gir konsistens og kontroll over diettsammensetningen, og genererer robuste og reproduserbare resultater. Viktige variabler som påvirker fôringsanalyser er insektets utviklingsstadium, valg av insektmiddel, miljøfaktorer og prøvestørrelse. Varigheten av analysen, intervallet mellom to dataregistreringer, frekvens og mengde diett matet, helsen til insekter og håndteringsferdigheter hos operatørene kan også påvirke utfallet av fôringsanalyser14,15.
Denne studien tar sikte på å demonstrere den obligatoriske fôringsanalysen for å evaluere effekten av quercetin på H. armigera overlevelse og kondisjon. Vurdering av ulike parametere, som insektets kroppsvekt, dødelighet og utviklingsdefekter, vil gi innsikt i de insekticide effektene av quercetin. I mellomtiden vil måling av ernæringsparametere, inkludert effektiviteten av konvertering av inntatt mat (ECI), effektivitet av konvertering av fordøyd mat (ECD) og omtrentlig fordøyelighet (AD), fremheve antifeedantegenskapene til quercetin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
H. armigera larver ble kjøpt fra ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), Bangalore, India. Totalt 21 andre instar larver ble brukt til denne studien.
1. Forberedelse av kikærtbasert kunstig diett
MERK: En liste over ingredienser som kreves for å forberede en kunstig diett er nevnt i tabell 1.
- Vei alle fraksjonene separat i et beger, som listet opp i tabell 1, og lag en homogen blanding ved hjelp av en slikkepott / magnetomrører.
- Kok fraksjon C ved rundt 100 °C ved hjelp av mikrobølgeovn i 5 minutter, tilsett fraksjon A og bland den grundig.
- Etter grundig blanding, la den blandede fraksjonen avkjøles litt før du tilsetter fraksjon B (fraksjon B inneholder varmelabile komponenter).
- Hell i en gjennomsiktig, polystyren, 150 mm x 150 mm petriskål.
2. Fremstilling av quercetinholdig kunstig diett
- Vei riktig mengde (1000 ppm) quercetinhydrat (se materialtabellen) og oppløs det ordentlig i minimumsvolumet av organiske løsningsmidler, slik som etanol (2 mg / ml), dimetylsulfoksid (DMSO; 30 mg / ml) eller dimetylformamid (DMF). Her brukes DMSO til å oppløse quercetin.
- Tilsett oppløst quercetin i fraksjon B, etterfulgt av tilsetning i blandingen av fraksjonene A og C (volumet av vann redusert fra fraksjon B er lik volumet av DMSO tilsatt).
- Tilsett et likt volum organisk løsningsmiddel som brukes til å oppløse quercetin i kontrolldietten.
MERK: Figur 1 viser den skjematiske fremstillingen av å forberede kunstige og quercetinholdige dietter.
3. Oppdrett og vedlikehold av H. armigera-kulturen
MERK: Bruk passende rengjorte og steriliserte materialer for insektoppdrett og vedlikehold. Håndter insektene forsiktig ved å følge alle sterilitets- og sikkerhetsrelaterte standard driftsrutiner 16,17,18.
- Oppbevar H. armigera-egg i avlskammeret (plastkrukke dekket med musselinduk) med vedlikeholdte forhold, som beskrevet i trinn 3.3. Deretter overfører du forsiktig nyfødte ved hjelp av en fin pensel på en nylaget kikertbasert kunstig diett.
- Bruk en kunstig diett for oppdrett av larver, og 20% (w / v) sukroseløsning med 1% (w / v) multivitamin (se materialtabell) for voksne møll19,20.
MERK: Siden tredje og eldre stjernelarver av H. armigera viser en kannibalistisk tendens, er det nødvendig å oppdra hver larve i et eget hetteglass. - Hold temperaturen på 25 ± 1 °C og relativ luftfuktighet på 70 % i insektkulturrommet, med 16 timers lys:8 timers mørk fotoperiode21.
- Bak en generasjon insekter i laboratoriet for homogenitet og bruk den deretter til fôringsanalyse.
- Eventuelt kan du øke temperaturen i insektkulturrommet til 28 °C for å øke veksten av larver og pupper22.
4. Oppsett for fôringsanalyse
- Samle 21 andre instar larver for hvert sett (kontroll og behandling) og hold dem borte fra kostholdet, i ca 1-3 timer.
- Klipp kontroll- og quercetinholdig diett i små biter, registrer vekten av dietten og insektets kropp, og overfør insektene forsiktig til kulturflasker. La insektene mate på den respektive dietten.
MERK: Dette bør betraktes som dag 0 i fôringsanalysen. - Registrer vekten av insektlegemet, gitt diett, uspist diett og frass på alternative dager (dag 2, 4, 6, 8 og 10) til den 10. analysedagen.
- Etter dag 10, fortsett å mate dem på deres respektive diett for å observere ytterligere utviklingsmessige og morfologiske endringer.
MERK: Utviklingsendringene ved hjelp av: (1) larve-puppe-mellomprodukter, for eksempel den bakre halvdelen av pupper med larvekutikulaplaster, en hodekapsel og thoraxben; (2) prepupae med en helt svart kropp; (3) undersized pupper med kroppskrymping; (4) Puppemøll mellomprodukter-møll med det gamle puppeskinnet. Morfologiske endringer inkluderer misformede møllvoksne med unormale kropper, vridde vinger og leddede ben. Disse endringene sammenlignes deretter med insekter matet på kontrolldietten. - Frys insekter på dag 10 hvis studien av utviklings- og morfologiske defekter ikke er nødvendig.
MERK: Før larvene fryses, må de holdes fratatt dietten i minst 3 timer for å fjerne gjenværende diett fra fordøyelseskanalen.
5. Dataregistrering og analyse
- I GraphPad Prism-programvaren (se Materialfortegnelse) velger du en XY-datatabell fra dialogboksen "Velkommen eller ny tabell", og ved at du angir antall insekter replikerer verdier side om side i underkolonnene. Gi deretter tittelnavnet til X-aksen som antall dager, og i gruppe A og B, gi tittelnavnet som henholdsvis kontroll og quercetinbehandling. Sett kroppsvekten til hvert insekt under kontroll og behandling for å generere kroppsvektgrafen.
MERK: Analyse i GraphPad kan variere i henhold til prøvestørrelsen og antall behandlinger. - Sammenlign insektenes kroppsvekt mellom kontroll- og behandlingsgruppen med en t-test for studenter (α = 0,05).
- Tell levende og døde larver og pupper på dag 10 for å plotte en Kaplan-Meier-kurve for overlevelsesprosent ved hjelp av grafprogramvaren.
- Telle antall pupper og beregne prosentandelen av puppene ved hjelp av den gitte formelen:
- Prosentandel av forpupping (%) = (antall pupper dannet/totalt antall larver) x 100
- Sammenlign larveutvikling ut fra næringsindekser23 ved hjelp av følgende formler: ECI (%) = (vektøkning av larver/vekt av spist fôr) x 100
ECD (%) = (vektøkning av larver/[vekt av spist fôr - vekt av frass]) x 100
AD (%) = ([vekt av spist fôr - vekt av frass]/vekt av spist fôr) x 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insektlarver matet på en diett som inneholdt 1,000 ppm quercetin viste en signifikant reduksjon i kroppsvekt på ~ 57% sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2A). Reduksjonen i kroppsvekt resulterte i redusert kroppsstørrelse hos quercetinbehandlede larver (figur 2B). En merkbar reduksjon ble observert i fôringshastigheten til larver med quercetinfôr sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2C).
Larver matet på quercetin viste også en reduksjon i puppefrekvensen med ~ 14% og forsinket pupp, noe som tyder på utviklingshemming ved behandling (figur 3A, B). Videre ble ~77,65 % av overlevelse og dødelige fenotyper observert hos insektlarver fôret på en quercetinholdig diett (figur 4A,B). Ernæringsparametrene ble beregnet for kontroll- og quercetinfôrede larver basert på inntak og utnyttelse av mat (tilleggstabell 1). ECI til kroppsmateriale og ECD for insekter matet på 1,000 ppm quercetinholdig diett ble redusert med henholdsvis ~ 9% og ~ 49%. Nedgangen i ECD kan skyldes mangel på tilgjengelige metabolitter i insektlegemet20. AD for quercetinfôrede insekter ble økt med ~ 5% sammenlignet med kontrollen (tabell 2). Samlet sett indikerer de oppnådde resultatene at quercetin har signifikante negative effekter på insektvekst og utvikling av H. armigera.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av fremstilling av kunstig diett og quercetinholdig diett. Fraksjoner A, B og C blandes for å lage en kunstig og quercetinholdig diett. Larvene blir matet på den respektive dietten i 10 dager. Blå prosesspiler representerer et kunstig kosthold, mens røde prosesspiler representerer utarbeidelsen av en quercetinholdig diett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative data fra quercetin-fôringsanalysen. (A) Kroppsvektgraf for H. armigera-larver etter fôring av 1000 ppm quercetin sammenlignet med kontrollen på dag 2, 4, 6, 8 og 10. Larvenes kroppsvekt er i milligram (mg). (B) Den gjennomsnittlige størrelsen på larver registreres på dag 10. Vektstang = 1 cm. (C) Gjennomsnittlig tilførselshastighet registrert på dag 2, 4, 6, 8 og 10. Vekten av fôret er i milligram (mg). Blå sirkler og røde firkanter representerer gjennomsnittsdataene for henholdsvis kontroll- og quercetinbehandlede insekter på alternative dager. Student t-test brukes for sammenligning av de to gruppene (paret). Data representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 21 andre instar larver; *p < 0,05 indikerer statistisk signifikant). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative data for pupering fra fôringsanalysen. (A) Prosentandel av puppegraf. (B) Bilder av pupper (dag 15) som viser en forsinket og redusert puppehastighet ved behandling med quercetin. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative data for overlevelse på dag 10 ved fôring av 1000 ppm quercetin sammenlignet med kontroll. (A) Kaplan-Meier overlevelsesgraf for quercetin-matede insekter indikerer redusert overlevelse. Kontrollinsektene viser en ~ 96% overlevelse, og de quercetinbehandlede insektene viser en ~ 77,65% overlevelse. (B) Bilder av dødelige fenotyper av quercetinfôrede larver tatt på dag 10. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Brøk A | ||
| 1 | Bengalsk gram | 50 g |
| 2 | Gjærekstrakt | 12 g |
| 3 | Kasein | 3,5 g |
| 4 | Sorbinsyre | 0,5 g |
| 5 | Metyl paraben | 1 g |
| 6 | dH2O | 150 ml |
| Fraksjon B | ||
| 1 | Kolinklorid | 0,35 g |
| 2 | Streptomycin | 0,02 g |
| 3 | Askorbinsyre | 2 g |
| 4 | Kolesterol | 0,15 g |
| 5 | Multivitamin kapsel | 1 |
| 6 | Vitamin E kapsel | 1 |
| 7 | dH2O | 30 ml |
| Fraksjon C | ||
| 1 | Agar Agar | 6,5 g |
| 2 | dH2O | 180 ml |
Tabell 1: Sammensetning av kunstig diett.
| Behandling (Quercentin-konsentrasjon) | Næringsindekser (%) | ||
| ECI | ECD | ANNONSE | |
| 0 ppm | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 ppm | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
Tabell 2: Effekt av inntak av quercetin på H. armigera fôringsatferd og diettutnyttelse. Forkortelser: ECI = effektiviteten av konvertering av inntatt mat; ECD = effektiviteten av konvertering av fordøyd mat; AD = omtrentlig fordøyelighet.
Tilleggstabell 1: Eksempel på datablad for quercetinfôringsanalysen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laboratoriebioassays er nyttige for å forutsi utfall og produsere komparative toksisitetsdata på flere forbindelser på kort tid til en rimelig pris. Fôringsbioassay bidrar til å tolke samspillet mellom insekt-insektmiddel og insekt-plante-insektmidler. Det er en effektiv metode for å måle toksisiteten til en rekke stoffer som betydelig forenkler prosessen med å etablere den dødelige dosen 50 (LD50), dødelig konsentrasjon 50 (LC50) eller annen dødelig konsentrasjon eller dose24,25. Ulike laboratoriebioassays brukes til å bestemme insekticid aktivitet, insektmiddelresistens og giftighet av forbindelser, inkludert diettdekke, aktuell applikasjon, obligatorisk fôring, injeksjonsmetode, kontakt eller rest, og filmmetoden13,14. Alle disse metodene kan brukes basert på målet med en bestemt studie, men den ideelle bioassay-tilnærmingen skal være rask og effektiv26. Derfor kan den obligatoriske fôringsanalysemetoden som diskuteres i dette manuskriptet, være den valgte bioassayen i flere tilfeller, bortsett fra sugende insekter.
Den obligatoriske fôringsanalysen beskrevet i dette manuskriptet kan brukes til å studere effekten av enhver forbindelse på vekst, utvikling, fôring og overlevelse av insektlarver. I de representative resultatene som er vist her, ble den insekticide aktiviteten til quercetin undersøkt mot H. armigera-larver, noe som gir en begrunnelse for videre utforskning. Signifikante reduksjoner i kroppsvekt på ~57 % (figur 2A,B), endringer i fôringshastighet (figur 2C) og redusert overlevelse på ~18 % (figur 4A,B) ble observert hos larver som fikk quercetin. Også insekter matet på en quercetin diett viste forsinket og redusert pupping med ~ 14% (figur 3A, B). En signifikant endring ble også observert i ernæringsindekser, inkludert ECI, ECD og AD (tabell 2), sammenlignet med kontrollgruppen. Samlet sett indikerer disse resultatene at quercetin har en skadelig effekt på vekst, utvikling og overlevelse av H. armigera-larver. Alle disse observasjonene følger antibioseeffekten av quercetin på Aedes aegypti27, Bactrocera cucurbitae Coquillett28 og Drosophila melanogaster29. Videre er disse observasjonene funnet å være i samsvar med økt letalitet i Bombyx mori på grunn av nedsatt immunsystem30, redusert larvevekt og fecundity i Spodoptera litura31, Hyphantria cunea12 og Eriosoma lanigerum32.
Å ta forholdsregler, for eksempel ensartethet i prøvestørrelse, er avgjørende for å redusere biologisk varians mellom eksperimenter. For å sikre reproduserbarhet må fôringsanalysen utføres ved bruk av insektlarver av samme stjerne i et insektkulturrom ved konsistente temperaturer og fuktighetsnivåer. Mens du forbereder et kunstig diett, må det sikres at fytokjemikaliet er jevnt blandet med dietten. For å minimere feilen på grunn av fytokjemisk nedbrytning over tid, er et tilberedt kosthold å foretrekke for analyse. Egenskapene til fytokjemikalier, som termosensitivitet, lysfølsomhet, oppløselighet, etc., bør vurderes under forberedelse og lagring av kunstig diett. Dietter som har blitt tørket ut over tid kan endres i farge og krympe, og de bør ikke brukes til fôringsanalysen. Analyseresultatene må ikke vurderes når kontrollens dødelighet er større enn 10%33. Materialene, som slikkepott, begerglass, petriskåler, etc., som kreves for dietttilberedning og insektveiing, bør være separate for kontroll- og behandlingsgruppene for å unngå feil på grunn av krysskontaminering.
Insektfôringsbioassay er svært spesifikk og reproduserbar, men har noen begrensninger. For eksempel, når et insekt angriper en plante, produserer planteimmunitet strukturelle eller kjemiske egenskaper for å redusere fôring av planteetere og dermed minimere skade på planteetere34. Imidlertid observeres ikke disse defensive egenskapene og deres effekter under denne analysen. En annen begrensning er at den bestemte konsentrasjonen av fytokjemikalier inntatt av insekter ikke kan bestemmes14. Stabiliteten av næringsinnholdet i dietten og brukt fytokjemisk er en viktig begrensende faktor som kan påvirke effekten på insekter.
Til tross for de ovennevnte begrensningene er den obligatoriske fôringsanalysen rimelig og kan teste et stort antall mange insekter samtidig. Denne analysen kan også tilpasses for å skjerme flere molekyler for å studere deres antifeedant og insekticide egenskaper mot forskjellige klasser av insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærte ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
SM, YP og VN anerkjenner stipendiet tildelt av University Grants Commission, Indias regjering, New Delhi. RJ anerkjenner Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), India, og CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, India, for økonomisk støtte under prosjektkodene MLP036626, MLP101526 og YSA000826.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
- Popp, J., Pető, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2013).
- da Silva, F. R., et al. Comparative toxicity of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) to selected insecticides. Insects. 11 (7), 431 (2020).
- Usman, A., Ali, M. I., Shah, M., e Amin, F., Sarwar, J. Comparative efficacy of indigenous plant extracts and a synthetic insecticide for the management of tomato fruit worm (Helicoverpa armigera Hub.) and their effect on natural enemies in tomato crop. Pure and Applied Biology. 7 (3), 1014-1020 (2018).
- Honnakerappa, S. B., Udikeri, S. S. Abundance of Helicoverpa armigera (Hubner) on different host crops. Journal of Farm Science. 31, 436-439 (2018).
- Edosa, T. T. Review on bio-intensive management of African bollworm, Helicoverpa armigera (Hub.): Botanicals and semiochemicals perspectives. African Journal of Agricultural Research. 14 (1), 1-9 (2019).
- Zhou, Y., et al. Migratory Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) exhibits marked seasonal variation in morphology and fitness. Environmental Entomology. 48 (3), 755-763 (2019).
- Souto, A. L., et al. Plant-derived pesticides as an alternative to pest management and sustainable agricultural production: Prospects, applications and challenges. Molecules. 26 (16), 4835 (2021).
- Özkara, A., Akyıl, D., Konuk, M. Pesticides, environmental pollution, and health. Environmental Health Risk-Hazardous Factors to Living Species. , (2016).
- Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42 (2021).
- Tlak Gajger, I., Dar, S. A. Plant allelochemicals as sources of insecticides. Insects. 12 (3), 189 (2021).
- Riddick, E. W. Potential of quercetin to reduce herbivory without disrupting natural enemies and pollinators. Agriculture. 11 (6), 476 (2021).
- Gao, Y. -L., et al. The effect of quercetin on the growth, development, nutrition utilization, and detoxification enzymes in Hyphantria cunea Drury (Lepidoptera: Arctiidae). Forests. 13 (11), 1945 (2022).
- Durmuşoğlu, E., Hatipoğlu, A., Gürkan, M. O., Moores, G. Comparison of different bioassay methods for determining insecticide resistance in European Grapevine Moth, Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller) (Lepidoptera: Tortricidae). Turkish Journal of Entomology. 39 (3), 271-276 (2015).
- Paramasivam, M., Selvi, C. Laboratory bioassay methods to assess the insecticide toxicity against insect pests-A review. Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (3), 1441-1445 (2017).
- Clark, E. L., Isitt, R., Plettner, E., Fields, P. G., Huber, D. P. W. An inexpensive feeding bioassay technique for stored-product insects. Journal of Economic Entomology. 107 (1), 455-461 (2014).
- Waldbauer, G. P., Cohen, R. W., Friedman, S. An improved procedure for laboratory rearing of the corn earworm, Heliothis zea (Lepidoptera: Noctuidae). The Great Lakes Entomologist. 17 (2), 10 (2017).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Laboratory rearing of stable flies and other muscoid Diptera. JoVE. (138), e57341 (2018).
- Zheng, M. -L., Zhang, D. -J., Damiens, D. D., Lees, R. S., Gilles, J. R. L. Standard operating procedures for standardized mass rearing of the dengue and chikungunya vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)-II-Egg storage and hatching. Parasites & Vectors. 8, 1-7 (2015).
- Nagarkatti, S., Prakash, S. Rearing Heliothis armigera (Hubn.) on an artificial diet. Technical Bulletin Commonwealth Institute of Biological Control. , (1974).
- Adhav, A. S., Kokane, S. R., Joshi, R. S. Functional characterization of Helicoverpa armigera trehalase and investigation of physiological effects caused due to its inhibition by Validamycin A formulation. International Journal of Biological Macromolecules. 112, 638-647 (2018).
- Abbasi, B. H., et al. Rearing the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, on a tapioca-based artificial diet. Journal of Insect Science. 7 (1), 35 (2007).
- Armes, N. J., Jadhav, D. R., Bond, G. S., King, A. B. S. Insecticide resistance in Helicoverpa armigera in South India. Pesticide Science. 34 (4), 355-364 (1992).
- Waldbauer, G. P. The consumption and utilization of food by insects. Advances in Insect Physiology. 5, Academic Press. 229-288 (1968).
- Carpinella, M. C., Defago, M. T., Valladares, G., Palacios, S. M. Antifeedant and insecticide properties of a limonoid from Melia azedarach (Meliaceae) with potential use for pest management. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (2), 369-374 (2003).
- Diaz Napal, G. N., Palacios, S. M. Bioinsecticidal effect of the flavonoids pinocembrin and quercetin against Spodoptera frugiperda. Journal of Pest Science. 88, 629-635 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , 4-38 (1990).
- Gikonyo, N. K., Mwangi, R. W., Midiwo, J. O. Toxicity and growth-inhibitory activity of Polygonum senegalense (Meissn.) surface exudate against Aedes aegypti larvae. International Journal of Tropical Insect Science. 18 (3), 229-234 (1998).
- Sharma, R., Sohal, S. K. Bioefficacy of quercetin against melon fruit fly. Bulletin of Insectology. 66 (1), 79-83 (2013).
- Després, L., David, J. -P., Gallet, C. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 298-307 (2007).
- Shi, G., Kang, Z., Ren, F., Zhou, Y., Guo, P. Effects of quercetin on the growth and expression of immune-pathway-related genes in silkworm (Lepidoptera: Bombycidae). Journal of Insect Science. 20 (6), 23 (2020).
- Selin-Rani, S., et al. Toxicity and physiological effect of quercetin on generalist herbivore, Spodoptera litura Fab. and a non-target earthworm Eisenia fetida Savigny. Chemosphere. 165, 257-267 (2016).
- Ateyyat, M., Abu-Romman, S., Abu-Darwish, M., Ghabeish, I. Impact of flavonoids against woolly apple aphid, Eriosoma lanigerum (Hausmann) and its sole parasitoid, Aphelinus mali (Hald). Journal of Agricultural Science. 4 (2), 227 (2012).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. JoVE. (144), e57768 (2019).
- Mitchell, C., Brennan, R. M., Graham, J., Karley, A. J. Plant defense against herbivorous pests: exploiting resistance and tolerance traits for sustainable crop protection. Frontiers in Plant Science. 7, 1132 (2016).
