Summary
该方案描述了专性摄食测定法，以评估植物化学物质对鳞翅目昆虫幼虫的潜在毒性作用。这是一种高度可扩展的昆虫生物测定法，易于优化亚致死剂量和致死剂量、威慑活性和生理效应。这可用于筛选环保杀虫剂。
Abstract
Helicoverpa armigera是一种鳞翅目昆虫，是一种分布于全球的多食性害虫。这种草食性昆虫对植物和农业生产力构成威胁。作为回应，植物会产生几种植物化学物质，对昆虫的生长和生存产生负面影响。该方案展示了一种专性摄食测定方法，用于评估植物化学物质（槲皮素）对昆虫生长，发育和生存的影响。在受控条件下，新生儿在预定的人工饮食中维持到第二龄。这些二龄幼虫被允许以对照和含有槲皮素的人工饮食为食 10 天。隔天记录昆虫的体重、发育阶段、体重和死亡率。在整个测定过程中评估体重的变化、喂养模式的差异和发育表型。 所描述的强制性摄食测定模拟了自然的摄入模式，并且可以放大到大量昆虫。它允许人们分析植物化学物质对 H. armigera 的生长动态、发育过渡和整体适应性的影响。此外，该设置还可用于评估营养参数和消化生理过程的改变。本文提供了一种详细的喂养测定系统方法，该方法可能适用于毒理学研究、杀虫分子筛选以及了解植物-昆虫相互作用中的化学效应。
Introduction
影响作物生产力的生物因子主要是病原体和害虫。一些害虫造成 15% 至 35% 的农作物损失，并影响经济可持续性实践 1.属于鞘翅目、半翅目和鳞翅目昆虫的昆虫是毁灭性害虫的主要目。环境的高度适应性使鳞翅目动物进化出几种生存机制。在鳞翅目昆虫中，棉铃虫（Helicoverpa armigera）可以以大约 180 种不同的作物为食，并对其生殖组织造成重大损害2。在世界范围内，阿米格拉嗜血杆菌的侵扰已造成约 50 亿美元的损失3.棉花、鹰嘴豆、木豆、西红柿、向日葵和其他作物是 H. armigera 的宿主。它在寄主植物的不同部分完成其生命周期。雌性飞蛾产下的卵在叶子上孵化，然后在幼虫阶段以营养组织为食。幼虫阶段由于其贪婪和高度适应性而最具破坏性 4,5。由于其显著的属性，如多噬性、优异的迁徙能力、更高的繁殖力、强烈的滞育性以及对现有昆虫防治策略的抗性的出现，H. armigera显示出全球分布和对新领土的侵占6。
来自萜烯、类黄酮、生物碱、多酚、氰基葡糖苷等多种化学分子被广泛用于控制阿米氏嗜血杆菌侵染7。然而，化学分子的频繁应用会因其残留物的获得而对环境和人类健康产生不利影响。此外，它们对各种害虫捕食者产生不利影响，导致生态失衡 8,9。因此，有必要研究害虫防治化学分子的安全和环保选择。
植物产生的天然杀虫分子（植物化学物质）可用作化学杀虫剂的有前途的替代品。这些植物化学物质包括属于生物碱、萜类化合物和酚类的各种次生代谢物7,10。槲皮素是存在于各种谷物、蔬菜、水果和叶子中的最丰富的类黄酮（酚类化合物）之一。它显示出对昆虫的喂食威慑和杀虫活性;此外，它对害虫的天敌无害11,12.因此，该方案演示了使用槲皮素的喂养测定来评估其对 H. armigera 的毒性作用。
已经开发了各种生物测定方法来评估天然和合成分子对昆虫摄食、生长、发育和行为模式的影响13.常用的方法包括叶盘试验、选择喂养试验、液滴喂养试验、接触试验、日粮覆盖试验和专性喂养试验13,14。这些方法根据杀虫剂施用于昆虫的方式进行分类。专性喂养试验是测试可能的杀虫剂及其致死剂量的最常用、最灵敏、最简单和适应性最强的方法之一 14。在专性喂养测定中，将目标分子与人工饮食混合。这提供了对饮食成分的一致性和控制，产生了稳健且可重复的结果。影响摄食测定的重要变量是昆虫的发育阶段、杀虫剂的选择、环境因素和样本量。测定的持续时间、两次数据记录之间的间隔、日粮喂养的频率和数量、昆虫的健康状况以及操作人员的操作技能也会影响喂养测定的结果14,15。
本研究旨在证明专性摄食试验以评估槲皮素对 H. armigera 存活和健康的影响。对各种参数的评估，如昆虫体重、死亡率和发育缺陷，将提供对槲皮素杀虫作用的见解。同时，测量营养参数，包括摄入食物转化效率 （ECI）、消化食物转化效率 （ECD） 和近似消化率 （AD），将突出槲皮素的抗摄食属性。
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Protocol
H. armigera 幼虫购自印度班加罗尔的ICAR-国家农业昆虫资源局（NBAIR）。本研究共使用了21只二龄幼虫。
1. 鹰嘴豆人工饲料的制备
注： 表1中提到了制备人工饮食所需的成分清单。
- 如 表1所示，在烧杯中分别称量所有馏分，并使用刮刀/磁力搅拌器制备均匀的混合物。
- 使用微波炉在100°C左右煮沸馏分C5分钟，加入馏分A中，并充分混合。
- 充分混合后，让混合的馏分稍微冷却，然后再加入馏分 B（馏分 B 含有热不稳定成分）。
- 倒入透明聚苯乙烯 150 mm x 150 mm 培养皿中。
2.含槲皮素人工饮食的制备
- 称取适量 （1,000 ppm） 的槲皮素水合物（参见 材料表），并将其适当溶解到最小体积的有机溶剂中，例如乙醇 （2 mg/mL）、二甲基亚砜 （DMSO; 30 mg/mL） 或二甲基甲酰胺 （DMF）。在这里，DMSO用于溶解槲皮素。
- 将溶解的槲皮素加入馏分B中，然后加入馏分A和C的混合物中（从馏分B中还原的水体积等于添加的DMSO体积）。
- 在对照饮食中加入等体积的用于溶解槲皮素的有机溶剂。
注： 图1 显示了制备人工和含槲皮素的饮食的示意图。
3. H. armigera培养物的饲养和维持
注意： 使用适当清洁和消毒的材料进行昆虫饲养和维护。遵循所有与无菌和安全相关的标准操作规范16、17、18 小心处理昆虫。
- 如步骤3.3所述，将 H. armigera 卵保持在繁殖室（用细布覆盖的塑料罐）中，并保持条件。然后，用细画笔在新鲜制备的鹰嘴豆人工饮食上轻轻转移新出现的新生儿。
- 使用人工饲料饲养幼虫，使用20%（w / v）蔗糖溶液和1%（w / v）复合维生素（见材料表）用于成年飞蛾19,20。
注意：由于 H. armigera 的三龄和更老龄幼虫表现出自相残杀的倾向，因此有必要将每个幼虫饲养在单独的小瓶中。 - 在昆虫培养室中将温度保持在25±1°C，相对湿度保持在70%，光照16小时：8小时暗光周期21。
- 在实验室中饲养一代昆虫进行均质性，然后将其用于喂养测定。
- 可选地，将昆虫培养室的温度提高到28°C，以加速幼虫和蛹的生长22。
4. 喂养试验的设置
- 每组（对照和治疗）收集21个二龄幼虫，并让它们远离饮食，约1-3小时。
- 将对照和含槲皮素的饮食切成小块，记录给予的饮食和昆虫身体的重量，并小心地将昆虫转移到培养瓶中。让昆虫以各自的饮食为食。
注意：这应被视为喂养测定的第 0 天。 - 记录昆虫身体的重量，给予饮食，未进食的饮食，隔天（第2,4,6,8和10天）直到测定的第10天。
- 第 10 天后，让它们以各自的饮食为食，以观察进一步的发育和形态变化。
注：发育变化通过以下方式进行：（1）幼虫-蛹中间体，如蛹的后半体有幼虫角质层斑块、头囊和胸腿;（2）蛹前蛹，身体完全变黑;（3）蛹体型过小，身体萎缩;（4）蛹蛾中间蛾，蛹皮老。形态变化包括畸形蛾成虫，身体异常，翅膀扭曲，腿关节。然后将这些变化与以对照饮食喂养的昆虫进行比较。 - 如果不需要研究发育和形态缺陷，则在第 10 天冷冻昆虫。
注意：在冷冻幼虫之前，需要将它们从饮食中剥夺至少3小时，以去除消化道中的残留饮食。
5. 数据记录与分析
- 在GraphPad Prism软件中（参见 材料表），从“欢迎或新建表”对话框中选择一个 XY 数据表，并在其中输入在子列中并排复制值 的昆虫数量 。然后，将标题名称指定为 X 轴 的天数，在 A 组和 B 组中，分别将标题名称指定 为对照 和 槲皮素处理。控制和处理每只昆虫的体重以生成体重图。
注意：GraphPad中的分析可能因样本量和处理次数而异。 - 使用学生 t 检验 （α = 0.05） 比较对照组和治疗组之间的昆虫体重。
- 在第 10 天计算活的和死的幼虫和蛹，以使用绘图软件绘制存活百分比的 Kaplan-Meier 曲线。
- 计算蛹的数量并使用给定的公式计算化蛹的百分比：
- 化蛹百分比（%）=（形成的蛹数/幼虫总数）x 100
- 使用以下公式比较幼虫的营养指数23 发育，ECI （%） =（幼虫体重增加/食用饲料重量）x 100
ECD （%） =（幼虫增重/[食用饲料重量 - 碎屑重量]）x 100
AD （%） = （[食用饲料重量 - 碎屑重量]/食用饲料重量）x 100
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Representative Results
与对照组相比，以含有1,000ppm槲皮素的饮食喂养的昆虫幼虫的体重显着降低~57%（图2A）。体重的减轻导致槲皮素处理的幼虫的体型减小（图2B）。与对照组相比，槲皮素喂养的幼虫的摄食率显着降低（图2C）。
此外，以槲皮素为食的幼虫的化蛹率下降了~14%，化蛹延迟，表明治疗后发育迟缓（图3A，B）。此外，在以含槲皮素的饮食喂养的昆虫幼虫中观察到~77.65%的存活和致死表型（图4A，B）。根据食物的消耗和利用，计算对照和槲皮素喂养的幼虫的营养参数（补充表1）。以 1,000 ppm 含槲皮素的饮食喂养的昆虫对身体物质的 ECI 和 ECD 分别降低了 ~9% 和 ~49%。ECD的降低可能是由于昆虫体内缺乏可用的代谢物20。与对照组相比，槲皮素喂养昆虫的AD增加了~5%（表2）。总体上，槲皮素对昆虫生长和阿米格拉菌发育有显著的负面影响。
图1：人工饮食和含槲皮素饮食制备的示意图。 将组分 A、B 和 C 混合制成人工和含槲皮素的饮食。幼虫以各自的饮食喂养 10 天。蓝色工艺箭头代表人工饮食，而红色工艺箭头代表含槲皮素饮食的制备。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：槲皮素喂养试验的代表性数据。 （A） 在第 2、4、6、8 和 10 天饲喂 1,000 ppm 槲皮素后，与对照组相比 ，H. armigera 幼虫的体重图。幼虫的体重以毫克（mg）为单位。（B） 在第 10 天记录幼虫的平均大小。比例尺 = 1 厘米。 （C） 第 2、4、6、8 和 10 天记录的平均进食率。饲料的重量以毫克（mg）为单位。蓝色圆圈和红色方块分别代表对照和槲皮素处理昆虫隔天的平均数据。学生 t 检验用于两组（配对）的比较。数据表示平均±SEM（n = 21 二龄幼虫;*p < 0.05 表示具有统计学意义）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：来自摄食试验的化蛹的代表性数据。 （A）化蛹百分比图。（B） 蛹图像（第 15 天）显示槲皮素处理的化蛹率延迟和降低。比例尺 = 1 厘米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：与对照组相比，饲喂 1,000 ppm 槲皮素后第 10 天存活率的代表性数据。 （A） 槲皮素喂养昆虫的 Kaplan-Meier 存活图表明存活率下降。对照昆虫的存活率为~96%，槲皮素处理的昆虫存活率为~77.65%。（B） 第 10 天拍摄的槲皮素喂养幼虫的致死表型图像。比例尺 = 1 厘米. 请点击这里查看此图的较大版本.
| 分数 A | ||
| 1 | 孟加拉克 | 50 克 |
| 2 | 酵母提取物 | 12 克 |
| 3 | 酪蛋白 | 3.5 克 |
| 4 | 山梨酸 | 0.5 克 |
| 5 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 1 克 |
| 6 | dH2O | 150毫升 |
| 分数 B | ||
| 1 | 氯化胆碱 | 0.35 克 |
| 2 | 链霉素 | 0.02 克 |
| 3 | 抗坏血酸 | 2 克 |
| 4 | 胆固醇 | 0.15 克 |
| 5 | 复合维生素胶囊 | 1 |
| 6 | 维生素E胶囊 | 1 |
| 7 | dH2O | 30毫升 |
| 分数 C | ||
| 1 | 琼脂 琼脂 | 6.5 克 |
| 2 | dH2O | 180毫升 |
表1：人工饮食的组成。
| 治疗（槲皮素浓度） | 营养指数 （%） | ||
| ECI的 | 幼儿发展 | 广告 | |
| 0 页/分钟 | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 页/分钟 | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
表2：槲皮素摄入对阿米 格拉蛾 摄食行为和日粮利用的影响。 缩写：ECI = 摄入食物的转化效率;ECD = 消化食物的转化效率;AD = 近似消化率。
补充表1：槲皮素喂养测定的数据表示例。请点击此处下载此文件。
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Discussion
实验室生物测定有助于预测结果，并在短时间内以合理的成本生成几种化合物的比较毒性数据。摄食生物测定有助于解释昆虫-杀虫剂和昆虫-植物-杀虫剂之间的相互作用。它是一种测量各种物质毒性的有效方法，大大简化了确定致死剂量50（LD50）、致死浓度50（LC50）或任何其他致死浓度或剂量24,25的过程。各种实验室生物测定用于确定杀虫活性、杀虫剂耐药性和化合物的毒性，包括饮食覆盖、局部应用、专性喂养、注射方法、接触或残留以及薄膜方法13,14。所有这些方法都可以根据特定研究的目的使用，但是理想的生物测定方法应该是快速有效的26。因此，除吸吮昆虫外，本手稿中讨论的专性摄食测定方法在几种情况下可以成为首选的生物测定方法。
本手稿中描述的专性摄食测定可用于研究任何化合物对昆虫幼虫生长、发育、摄食和存活的影响。在本文所示的代表性结果中，研究了槲皮素对 H. armigera 幼虫的杀虫活性，为进一步探索提供了理论依据。在槲皮素喂养的幼虫中观察到体重显着降低~57%（图2A，B），摄食率变化（图2C）和存活率降低~18%（图4A，B）。此外，以槲皮素饮食为食的昆虫表现出~14%的延迟和减少的化蛹（图3A，B）。与对照组相比，营养指标（包括ECI、ECD和AD）也发生了显着变化（表2）。总体而言，这些结果表明槲皮素对 H. armigera 幼虫的生长、发育和存活具有有害影响。所有这些观察结果都遵循槲皮素对埃及伊蚊27、葫芦科28 和黑腹果蝇29 的抗生作用。此外，这些观察结果被发现与由于免疫系统受损、幼虫重量减少以及草地贪夜蛾 31、Hyphantria cunea12 和 Eriosoma lanigerum32 的繁殖力而增加的致死率一致。
采取预防措施，例如样本量的均匀性，对于减少实验之间的生物学差异至关重要。为确保可重复性，必须在一致的温度和湿度水平下使用相同龄的昆虫幼虫在昆虫培养室中进行摄食测定。在准备人工饮食时，必须确保植物化学物质与饮食均匀混合。为了尽量减少由于植物化学降解而导致的误差，最好使用新鲜制备的饮食进行测定。在制备和储存人工饮食时，应考虑植物化学物质的特性，如热敏性、光敏性、溶解度等。随着时间的流逝而变干的日粮可能会变色并收缩，因此不应用于喂养测定。当对照组的死亡率大于 10%33 时，不得考虑测定结果。对照组和处理组的日粮制备和昆虫称重所需的材料，如刮刀、烧杯、培养皿等，应分开，以免因交叉污染而产生误差。
昆虫摄食生物测定法具有高度特异性和可重复性，但存在一些局限性。例如，当昆虫攻击植物时，植物免疫会产生结构或化学性状，以减少食草动物的摄食，从而最大限度地减少食草动物的损害34.然而，在该测定过程中未观察到这些防御性状及其影响。另一个限制是无法确定昆虫摄入的植物化学物质的确切浓度14.饮食和所用植物化学物质的营养成分的稳定性是影响其对昆虫影响的主要限制因素。
尽管存在上述局限性，但专性喂养测定法价格实惠，可以同时测试大量昆虫。此外，该测定法可用于筛选多种分子，以研究它们对不同类别昆虫的抗摄食剂和杀虫特性。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
SM、YP 和 VN 承认新德里印度政府大学教育资助委员会颁发的奖学金。RJ 感谢印度科学与工业研究委员会 （CSIR） 和印度浦那的 CSIR-国家化学实验室根据项目代码 MLP036626、MLP101526 和 YSA000826 提供财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
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