Summary
פרוטוקול זה מתאר את בדיקת ההזנה המחייבת להעריך את ההשפעה הרעילה, פוטנציאלית, של פיטוכימיקל על זחלי החרקים הלפידופטרניים. זוהי בדיקה ביולוגית של חרקים בעלת יכולת הרחבה גבוהה, שקל לייעל את המינון התת-קטלני והקטלני, את פעילות ההרתעה ואת ההשפעה הפיזיולוגית. זה יכול לשמש להקרנת קוטלי חרקים ידידותיים לסביבה.
Abstract
Helicoverpa armigera, חרק lepidopteran, הוא מזיק polyphagous עם תפוצה עולמית. חרק אוכל עשב זה מהווה איום על הצמחים ועל התפוקה החקלאית. בתגובה, צמחים מייצרים מספר פיטוכימיקלים המשפיעים לרעה על גדילתו והישרדותו של החרק. פרוטוקול זה מדגים שיטת בדיקת הזנה מחייבת להערכת ההשפעה של פיטוכימיקל (קוורצטין) על גדילה, התפתחות והישרדות של חרקים. בתנאים מבוקרים, היילודים נשמרו עד הכוכב השני בתזונה מלאכותית מוגדרת מראש. זחלי הכוכב השני הורשו להיזון מתזונה מלאכותית המכילה קוורצטין במשך 10 ימים. משקל גופם של החרקים, שלב התפתחותם, משקלם ותמותתם תועדו בימים חלופיים. השינוי במשקל הגוף, ההבדל בדפוס ההזנה ופנוטיפים התפתחותיים הוערכו לאורך זמן הבדיקה. בדיקת האכלת החובה המתוארת מדמה מצב טבעי של בליעה וניתן להגדיל אותה למספר רב של חרקים. הוא מאפשר לנתח את השפעת הפיטוכימיקלים על דינמיקת הגדילה, המעבר ההתפתחותי והכושר הכללי של H. armigera. יתר על כן, מערך זה יכול לשמש גם להערכת שינויים בפרמטרים תזונתיים ובתהליכים פיזיולוגיים של מערכת העיכול. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת למערכות בדיקת הזנה, שעשויות להיות לה יישומים במחקרים טוקסיקולוגיים, סינון מולקולות קוטלי חרקים והבנת השפעות כימיות באינטראקציות בין צמחים לחרקים.
Introduction
הגורמים הביוטיים המשפיעים על פריון היבול הם בעיקר גורמים פתוגניים ומזיקים. מספר חרקים מזיקים גורמים ל-15% עד 35% מאובדן היבול החקלאי ומשפיעים על שיטות קיימות כלכלית1. חרקים השייכים למסדרים Coleoptera, Hemiptera, ו- Lepidoptera הם המסדר העיקרי של מזיקים הרסניים. הטבע המסתגל מאוד של הסביבה הועיל לפידופטרנים בפיתוח מספר מנגנוני הישרדות. בקרב חרקים לפידופטרניים, תולעת צמר גפן (Helicoverpa armigera) יכולה להיזון מכ-180 גידולים שונים ולגרום נזק משמעותי לרקמות הרבייה שלהם2. ברחבי העולם, התפשטות H. armigera גרמה להפסד של כ -5 מיליארד דולר3. כותנה, חומוס, אפונת יונים, עגבניות, חמניות וגידולים אחרים הם המארחים של H. armigera. הוא משלים את מחזור החיים שלו בחלקים שונים של צמחים פונדקאים. ביצים המוטלות על ידי נקבות עש בוקעות על העלים, ולאחר מכן הן ניזונות מרקמות צמחיות בשלבי הזחל. שלב הזחל הוא ההרסני ביותר בשל אופיו הרעב והסתגלני מאוד 4,5. H. armigera מראה תפוצה גלובלית ופלישה לטריטוריות חדשות בשל תכונותיו המדהימות, כגון פוליפגיה, יכולות נדידה מצוינות, פריון גבוה יותר, דיאפאוזה חזקה, והופעת עמידות לאסטרטגיות קיימות להדברת חרקים6.
מולקולות כימיות מגוונות מטרפנים, פלבנואידים, אלקלואידים, פוליפנולים, גלוקוזידים ציאנוגניים ורבים אחרים נמצאים בשימוש נרחב להדברת התפשטות H. armigera 7. עם זאת, יישום תכוף של מולקולות כימיות מקנה השפעות שליליות על הסביבה ובריאות האדם עקב רכישת שאריות שלהם. כמו כן, הם מראים השפעה מזיקה על טורפים מזיקים שונים, וכתוצאה מכך חוסר איזון אקולוגי 8,9. לכן, יש צורך לחקור אפשרויות בטוחות וידידותיות לסביבה עבור מולקולות כימיות של הדברה.
מולקולות קוטלי חרקים טבעיים המיוצרים על ידי צמחים (פיטוכימיקלים) יכולות לשמש כחלופה מבטיחה לחומרי הדברה כימיים. פיטוכימיקלים אלה כוללים מטבוליטים שניוניים שונים השייכים למחלקות אלקלואידים, טרפנואידים ופנולים 7,10. קוורצטין הוא אחד הפלבנואידים (תרכובת פנולית) הנפוצים ביותר בדגנים, ירקות, פירות ועלים שונים. הוא מראה הרתעת האכלה ופעילות קוטלת חרקים נגד חרקים; כמו כן, הוא אינו מזיק לאויבים טבעיים של מזיקים11,12. לפיכך, פרוטוקול זה מדגים את בדיקת ההזנה באמצעות קוורצטין כדי להעריך את השפעתו הרעילה על H. armigera.
שיטות ביו-אסאי שונות פותחו כדי להעריך את ההשפעה של מולקולות טבעיות וסינתטיות על דפוסי ההזנה, הגדילה, ההתפתחות וההתנהגות של חרקים13. שיטות נפוצות כוללות את בדיקת דיסק העלים, מבחן האכלת בחירה, בדיקת הזנה טיפתית, בדיקת מגע, בדיקת כיסוי דיאטה ובדיקת האכלה חובה13,14. שיטות אלה מסווגות בהתבסס על האופן שבו חומרי הדברה מיושמים על חרקים. בדיקת האכלה מחייבת היא אחת השיטות הנפוצות, הרגישות, הפשוטות והסתגלות ביותר לבדיקת קוטלי חרקים סבירים והמינון הקטלני שלהם14. בבדיקת הזנה מחייבת, המולקולה המעניינת מעורבבת עם תזונה מלאכותית. זה מספק עקביות ושליטה על הרכב הדיאטה, יצירת תוצאות חזקות לשחזור. משתנים חשובים המשפיעים על בדיקות האכלה הם השלב ההתפתחותי של החרק, בחירת קוטל החרקים, גורמים סביבתיים וגודל המדגם. משך הבדיקה, מרווח בין שתי הקלטות נתונים, תדירות וכמות התזונה המואכלת, בריאות החרקים ומיומנות הטיפול של המפעילים יכולים גם הם להשפיע על תוצאות בדיקות האכלה14,15.
מחקר זה נועד להדגים את בדיקת ההזנה המחייבת כדי להעריך את ההשפעה של קוורצטין על הישרדות וכושר של H. armigera . הערכה של פרמטרים שונים, כגון משקל גוף חרקים, שיעור תמותה ופגמים התפתחותיים, תספק תובנות לגבי ההשפעות קוטלי החרקים של קוורצטין. בינתיים, מדידת פרמטרים תזונתיים, כולל יעילות ההמרה של מזון שנבלע (ECI), יעילות ההמרה של מזון מעוכל (ECD) ויכולת עיכול משוערת (AD), תדגיש את התכונות נוגדות ההזנה של קוורצטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זחלי H. armigera נרכשו מ- ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), בנגלור, הודו. בסך הכל נעשה שימוש ב-21 זחלי אינסטאר שניים במחקר הנוכחי.
1. הכנת תזונה מלאכותית מבוססת חומוס
הערה: רשימת המרכיבים הדרושים להכנת תזונה מלאכותית מוזכרת בטבלה 1.
- שקלו את כל השברים בנפרד בכד, כמפורט בטבלה 1, והכינו תערובת הומוגנית באמצעות מרית/מערבב מגנטי.
- מרתיחים את מקטע C בטמפרטורה של כ-100°C במיקרוגל למשך 5 דקות, מוסיפים למקטע A ומערבבים היטב.
- לאחר ערבוב יסודי, הניחו למקטע המעורב להתקרר מעט לפני הוספת חלק B (חלק B מכיל רכיבי חום-שבר).
- יוצקים לתוך צלחת פטרי שקופה, פוליסטירן, 150 מ"מ x 150 מ"מ.
2. הכנת תזונה מלאכותית המכילה קוורצטין
- שקלו את הכמות המתאימה (1,000 ppm) של קוורצטין הידרט (ראו טבלת חומרים) והמיסו כראוי בנפח המינימלי של ממיסים אורגניים, כגון אתנול (2 מ"ג/מ"ל), דימתיל סולפוקסיד (DMSO; 30 מ"ג/מ"ל) או דימתיל פורממיד (DMF). כאן, DMSO משמש להמסת קוורצטין.
- הוסיפו קוורצטין מומס למקטע B, ולאחר מכן הוסיפו אותו לתערובת של שברים A ו-C (נפח המים שהופחת מחלק B שווה לנפח ה-DMSO שנוסף).
- הוסיפו כמות שווה של ממס אורגני המשמש להמסת קוורצטין לדיאטת הבקרה.
הערה: איור 1 מראה את הייצוג הסכמטי של הכנת דיאטות מלאכותיות המכילות קוורצטין.
3. גידול ותחזוקה של תרבות H. armigera
הערה: יש להשתמש בחומרים מנוקים ומעוקרים כראוי לגידול חרקים ותחזוקתם. טפל בחרקים בזהירות על ידי ביצוע כל נוהלי ההפעלה הסטנדרטיים הקשורים לסטריליות ובטיחות 16,17,18.
- שמור ביצים H . armigera בתא הרבייה (צנצנת פלסטיק מכוסה בד מוסלין) עם תנאים נשמרים, כמתואר בשלב 3.3. לאחר מכן, העבירו בעדינות יילודים חדשים באמצעות מברשת צבע עדינה על תזונה מלאכותית טרייה המבוססת על חומוס.
- השתמשו בתזונה מלאכותית לגידול הזחלים, וב-20% (w/v) תמיסת סוכרוז עם מולטי-ויטמין 1% (w/v) (ראו טבלת חומרים) לעשים בוגרים19,20.
הערה: מכיוון שזחלי אינסטאר שלישי ומעלה של H. armigera מראים נטייה קניבליסטית, יש צורך לגדל כל זחל בבקבוקון נפרד. - שמור על הטמפרטורה ב 25 ± 1 °C (75 °F) ולחות יחסית ב 70% בחדר גידול חרקים, עם 16 שעות אור: 8 שעות כהה photoperiod21.
- לגדל דור אחד של חרקים במעבדה עבור הומוגניות ולאחר מכן להשתמש בו עבור בדיקת האכלה.
- לחלופין, להגדיל את הטמפרטורה של חדר תרבית חרקים ל 28 °C כדי להאיץ את הצמיחה של זחלים וגלמים22.
4. הגדרה לבדיקת האכלה
- אספו זחלי אינסטאר של 21 שניות לכל סט (בקרה וטיפול) והרחיקו אותם מהתזונה, למשך כ-1-3 שעות.
- חתכו את התזונה המכילה קוורצטין לחתיכות קטנות, רשמו את משקל התזונה שניתנה ואת גוף החרק, והעבירו בזהירות את החרקים לבקבוקוני תרבית. אפשרו לחרקים להיזון מהתזונה המתאימה.
הערה: יש להתייחס אליו כיום 0 של בדיקת ההזנה. - רשום את משקל גוף החרק, תזונה נתונה, תזונה שלא נאכלה ופראס בימים חלופיים (ימים 2, 4, 6, 8 ו-10) עד היום העשירי לבדיקה.
- לאחר היום ה-10, דאגו שהם ניזונים מהתזונה שלהם כדי לצפות בשינויים התפתחותיים ומורפולוגיים נוספים.
הערה: השינויים ההתפתחותיים באמצעות: (1) מתווכי זחל-גולם, כגון חצי הגוף האחורי של הגלמים עם כתמי ציפורן הזחל, קפסולת ראש ורגלי בית החזה; (2) גלמים בעלי גוף מושחר לחלוטין; (3) גלמים קטנים עם התכווצות הגוף; (4) גולם-עש ביניים עם עור הגולם הישן. שינויים מורפולוגיים כוללים בוגרים של עש פגום עם גוף חריג, כנפיים מעוותות ורגליים משותפות. שינויים אלה מושווים לאחר מכן לחרקים הניזונים מתזונת הביקורת. - יש להקפיא את החרקים ביום ה-10 אם אין צורך בחקר פגמים התפתחותיים ומורפולוגיים.
הערה: לפני הקפאת הזחלים, הם צריכים להיות משוללים של הדיאטה לפחות 3 שעות כדי להסיר דיאטה שיורית ממערכת העיכול.
5. הקלטה וניתוח נתונים
- בתוכנת GraphPad Prism (ראה טבלת חומרים), בחר טבלת נתונים XY מתיבת הדו-שיח "ברוכים הבאים או טבלה חדשה", ובטבלה זו הזן את מספר החרקים משכפל ערכים זה לצד זה בעמודות המשנה. לאחר מכן, תן את שם הכותרת לציר X כמספר הימים, ובקבוצות A ו- B, תן את שם הכותרת כטיפול בקרה וקוורצטין, בהתאמה. שים את משקל הגוף של כל חרק תחת שליטה וטיפול כדי ליצור את גרף משקל הגוף.
הערה: הניתוח ב- GraphPad עשוי להשתנות בהתאם לגודל המדגם ומספר הטיפולים. - השווה את משקל גוף החרק בין קבוצת הביקורת וקבוצת הטיפול באמצעות מבחן t של תלמיד (α = 0.05).
- ספרו את הזחלים והגלמים החיים והמתים ביום ה-10 כדי לשרטט עקומת קפלן-מאייר לאחוזי הישרדות באמצעות תוכנת הגרפים.
- ספרו את מספר הגלמים וחשבו את אחוז הגלמים באמצעות הנוסחה הנתונה:
- אחוז הגור (%) = (מספר הגלמים שנוצרו/המספר הכולל של הזחלים) x 100
- השווה את התפתחות הזחלים במונחים של מדדים תזונתיים23 באמצעות הנוסחאות הבאות, ECI (%) = (עלייה במשקל הזחלים/משקל המזון הנאכל) x 100
ECD (%) = (עלייה במשקל הזחלים/[משקל המזון הנאכל - משקל הפראס]) x 100
AD (%) = ([משקל המזון הנאכל - משקל המזון]/משקל המזון הנאכל) x 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זחלי חרקים שניזונו מתזונה שהכילה 1,000 ppm קוורצטין הראו ירידה משמעותית במשקל הגוף של ~57% בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 2A). הירידה במשקל הגוף הביאה לירידה בגודל הגוף של זחלים שטופלו בקוורצטין (איור 2B). נצפתה ירידה ניכרת בקצב ההזנה של זחלים שניזונו מקוורצטין בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 2C).
כמו כן, זחלים שניזונו מקוורצטין הראו ירידה בשיעור הגור ב~14% ועיכבו את הגור, מה שמרמז על פיגור התפתחותי לאחר הטיפול (איור 3A,B). יתר על כן, ~77.65% מההישרדות והפנוטיפים הקטלניים נצפו בזחלי חרקים שניזונו מתזונה המכילה קוורצטין (איור 4A,B). הפרמטרים התזונתיים חושבו לצורך בקרה וזחלי קוורצטין על בסיס צריכה וניצול של מזון (טבלה משלימה 1). ECI לחומר גוף ו- ECD עבור חרקים שניזונו מתזונה המכילה קוורצטין של 1,000 ppm הופחתו ב~9% ו~ 49%, בהתאמה. הירידה ב- ECD יכולה לנבוע מהיעדר מטבוליטים זמינים בגוף החרק20. ה-AD של חרקים שניזונו מקוורצטין עלה ב~5% בהשוואה לקבוצת הביקורת (טבלה 2). בסך הכל, התוצאות שהתקבלו מצביעות על כך שלקוורצטין יש השפעות שליליות משמעותיות על גדילת חרקים והתפתחות של H. armigera.
איור 1: ייצוג סכמטי של הכנת תזונה מלאכותית ודיאטה המכילה קוורצטין. שברים A, B ו-C מעורבבים ליצירת תזונה מלאכותית המכילה קוורצטין. הזחלים מוזנים על הדיאטה המתאימה במשך 10 ימים. חיצי תהליך כחולים מייצגים תזונה מלאכותית, ואילו חיצי תהליך אדומים מייצגים הכנה של דיאטה המכילה קוורצטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נתונים מייצגים מבדיקת ההזנה של קוורצטין. (A) גרף משקל הגוף של זחלי H. armigera לאחר הזנה של 1,000 ppm קוורצטין בהשוואה לקבוצת הביקורת בימים 2, 4, 6, 8 ו-10. משקל הגוף של הזחלים הוא מיליגרם (מ"ג). (B) הגודל הממוצע של הזחלים נרשם ביום ה-10. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (C) קצב האכלה ממוצע שנרשם בימים 2, 4, 6, 8 ו-10. משקל ההזנה הוא במיליגרם (מ"ג). עיגולים כחולים וריבועים אדומים מייצגים את הנתונים הממוצעים של חרקים שטופלו בביקורת ובקוורצטין בימים חלופיים, בהתאמה. מבחן t של תלמיד משמש להשוואה בין שתי הקבוצות (זוגיות). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n = 21 זחלי כוכב שני; *p < 0.05 מציין מובהק סטטיסטית). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: נתונים מייצגים של גורים מבדיקת ההאכלה. (A) אחוז גרף הגור. (B) תמונות של גלמים (יום 15) המראות עיכוב וירידה בקצב הרבייה בטיפול בקוורצטין. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נתונים מייצגים של הישרדות ביום 10 לאחר האכלה של 1,000 ppm קוורצטין בהשוואה לקבוצת הביקורת. (A) גרף הישרדות קפלן-מאייר עבור חרקים הניזונים מקוורצטין מצביע על ירידה בשיעור ההישרדות. חרקי הבקרה מראים שיעור הישרדות ~96%, והחרקים שטופלו בקוורצטין מראים הישרדות של ~77.65%. (B) תמונות של פנוטיפים קטלניים של זחלים הניזונים מקוורצטין שצולמו ביום ה-10. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| שבר א' | ||
| 1 | גרם בנגלי | 50 גרם |
| 2 | תמצית שמרים | 12 גרם |
| 3 | קזאין | 3.5 גרם |
| 4 | חומצה סורבית | 0.5 גרם |
| 5 | מתיל פרבן | 1 גרם |
| 6 | dH2O | 150 מ"ל |
| שבר ב' | ||
| 1 | כולין כלוריד | 0.35 גרם |
| 2 | סטרפטומיצין | 0.02 גרם |
| 3 | חומצה אסקורבית | 2 גרם |
| 4 | כולסטרול | 0.15 גרם |
| 5 | כמוסת מולטי ויטמין | 1 |
| 6 | כמוסת ויטמין E | 1 |
| 7 | dH2O | 30 מ"ל |
| חלק ג' | ||
| 1 | אגר אגר | 6.5 גרם |
| 2 | dH2O | 180 מ"ל |
טבלה 1: הרכב התזונה המלאכותית.
| טיפול (ריכוז קוורצנטין) | מדדים תזונתיים (%) | ||
| ECI | א.ק.ד. | פרסומת | |
| 0 עמודים לדקה | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 עמודים לדקה | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
טבלה 2: השפעת בליעת קוורצטין על התנהגות האכילה והניצול התזונתי של H. armigera . קיצורים: ECI = יעילות ההמרה של מזון שנבלע; ECD = יעילות ההמרה של מזון מעוכל; AD = יכולת עיכול משוערת.
טבלה משלימה 1: דוגמה לגיליון הנתונים של בדיקת הזנת קוורצטין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדיקות ביולוגיות במעבדה שימושיות לחיזוי תוצאות ולהפקת נתוני רעילות השוואתיים על מספר תרכובות בתקופה קצרה ובעלות סבירה. הבדיקה הביולוגית של ההזנה מסייעת לפרש את יחסי הגומלין בין קוטל חרקים לבין קוטלי חרקים-צמחים. זוהי שיטה יעילה למדידת רעילותם של מגוון חומרים המפשטת באופן משמעותי את תהליך קביעת המינון הקטלני 50 (LD50), ריכוז קטלני 50 (LC50), או כל ריכוז קטלני אחר או מינון24,25. בדיקות מעבדה שונות משמשות לקביעת פעילות קוטלי חרקים, עמידות לקוטלי חרקים ורעילות של תרכובות, כולל כיסוי דיאטה, יישום מקומי, האכלה חובה, שיטת ההזרקה, מגע או שאריות, ושיטת הסרט13,14. ניתן להשתמש בכל השיטות הללו בהתבסס על מטרת מחקר מסוים, אולם הגישה האידיאלית לבדיקה ביולוגית צריכה להיות מהירה ויעילה26. לפיכך, שיטת בדיקת ההאכלה המחייבת הנדונה בכתב יד זה יכולה להיות הבדיקה הביולוגית המועדפת במספר מקרים, למעט מציצת חרקים.
ניתן להשתמש בבדיקת האכלת החובה המתוארת בכתב יד זה כדי לחקור את ההשפעה של כל תרכובת על גדילה, התפתחות, האכלה והישרדות של זחלי חרקים. בתוצאות המייצגות המוצגות כאן, נבדקה פעילות קוטלי החרקים של קוורצטין כנגד זחלי H. armigera, מה שמספק רציונל למחקר נוסף. ירידה משמעותית במשקל הגוף של ~57% (איור 2A,B), שינויים בקצב ההזנה (איור 2C) וירידה בשיעור ההישרדות של ~18% (איור 4A,B) נצפו בזחלים שניזונו מקוורצטין. כמו כן, חרקים שניזונו מתזונת קוורצטין הראו עיכוב והפחתה בגור ב~14% (איור 3A,B). שינוי משמעותי נצפה גם במדדים תזונתיים, כולל ECI, ECD ו-AD (לוח 2), בהשוואה לקבוצת הביקורת. באופן כללי, התוצאות הללו מצביעות על כך שיש לקוורצטין השפעה מזיקה על הגדילה, ההתפתחות וההישרדות של זחלי H. armigera. כל התצפיות הללו עוקבות אחר ההשפעה האנטיביוזה של קוורצטין על Aedes aegypti27, Bactrocera cucurbitae Coquillett28 ו-Drosophila melanogaster29. יתר על כן, תצפיות אלה נמצאו בהתאם לקטלניות מוגברת בבומביקס מורי עקב פגיעה במערכת החיסון30, משקל זחל מופחת ופריון ב- Spodoptera litura31, Hyphantria cunea12 ו- Eriosoma lanigerum32.
נקיטת אמצעי זהירות, כגון אחידות בגודל המדגם, חיונית להפחתת השונות הביולוגית בין ניסויים. כדי להבטיח יכולת שחזור, בדיקת ההאכלה חייבת להתבצע באמצעות זחלי חרקים של אותו כוכב בחדר תרבית חרקים בטמפרטורות ורמות לחות עקביות. בעת הכנת דיאטה מלאכותית, יש להבטיח כי phytochemical מעורבב באופן אחיד עם הדיאטה. כדי למזער את השגיאה עקב פירוק פיטוכימיקלים לאורך זמן, דיאטה טרייה מוכנה עדיפה לבדיקה. יש לקחת בחשבון את התכונות של פיטוכימיקלים, כגון רגישות לחום, רגישות לאור, מסיסות וכו ', בעת הכנת ואחסון התזונה המלאכותית. דיאטות שהתייבשו עם הזמן עשויות לשנות את צבען ולהתכווץ, ואין להשתמש בהן לבדיקת ההאכלה. אין לקחת בחשבון את תוצאות הבדיקה כאשר שיעורי התמותה של קבוצת הביקורת גבוהים מ-10%33. החומרים, כגון מרית, כוסות, צלחות פטרי וכו ', הדרושים להכנת דיאטה ושקילת חרקים צריכים להיות נפרדים לקבוצות הבקרה והטיפול כדי למנוע טעויות עקב זיהום צולב.
הבדיקה הביולוגית להאכלת חרקים היא מאוד ספציפית וניתנת לשחזור, אך יש לה כמה מגבלות. לדוגמה, כאשר חרק תוקף צמח, חסינות הצמח מייצרת תכונות מבניות או כימיות כדי להפחית את ההזנה של אוכלי העשב ובכך למזער את הנזק לאוכלי עשב34. עם זאת, תכונות הגנה אלה והשפעותיהן אינן נצפות במהלך בדיקה זו. מגבלה נוספת היא שלא ניתן לקבוע את הריכוז המוגדר של פיטוכימיקלים הנבלעים על ידי חרקים14. יציבות התוכן התזונתי של התזונה והפיטוכימיקלים המשומשים היא גורם מגביל מרכזי שיכול להשפיע על השפעתו על חרקים.
למרות המגבלות הנ"ל, בדיקת האכלה חובה היא סבירה ויכולה לבדוק מספר רב של חרקים רבים בו זמנית. כמו כן, ניתן להתאים את הבדיקה הזו כדי לסנן מספר מולקולות כדי לחקור את תכונות נוגדי ההזנה וקוטלי החרקים שלהן כנגד סוגים שונים של חרקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא הצהירו על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
SM, YP ו- VN מכירים במלגה שהוענקה על ידי ועדת המענקים של האוניברסיטה, ממשלת הודו, ניו דלהי. RJ מודה למועצה למחקר מדעי ותעשייתי (CSIR), הודו, ולמעבדה הכימית הלאומית CSIR, פונה, הודו, לתמיכה כספית תחת קודי הפרויקט MLP036626, MLP101526 ו- YSA000826.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
- Popp, J., Pető, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2013).
- da Silva, F. R., et al. Comparative toxicity of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) to selected insecticides. Insects. 11 (7), 431 (2020).
- Usman, A., Ali, M. I., Shah, M., e Amin, F., Sarwar, J. Comparative efficacy of indigenous plant extracts and a synthetic insecticide for the management of tomato fruit worm (Helicoverpa armigera Hub.) and their effect on natural enemies in tomato crop. Pure and Applied Biology. 7 (3), 1014-1020 (2018).
- Honnakerappa, S. B., Udikeri, S. S. Abundance of Helicoverpa armigera (Hubner) on different host crops. Journal of Farm Science. 31, 436-439 (2018).
- Edosa, T. T. Review on bio-intensive management of African bollworm, Helicoverpa armigera (Hub.): Botanicals and semiochemicals perspectives. African Journal of Agricultural Research. 14 (1), 1-9 (2019).
- Zhou, Y., et al. Migratory Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) exhibits marked seasonal variation in morphology and fitness. Environmental Entomology. 48 (3), 755-763 (2019).
- Souto, A. L., et al. Plant-derived pesticides as an alternative to pest management and sustainable agricultural production: Prospects, applications and challenges. Molecules. 26 (16), 4835 (2021).
- Özkara, A., Akyıl, D., Konuk, M. Pesticides, environmental pollution, and health. Environmental Health Risk-Hazardous Factors to Living Species. , (2016).
- Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42 (2021).
- Tlak Gajger, I., Dar, S. A. Plant allelochemicals as sources of insecticides. Insects. 12 (3), 189 (2021).
- Riddick, E. W. Potential of quercetin to reduce herbivory without disrupting natural enemies and pollinators. Agriculture. 11 (6), 476 (2021).
- Gao, Y. -L., et al. The effect of quercetin on the growth, development, nutrition utilization, and detoxification enzymes in Hyphantria cunea Drury (Lepidoptera: Arctiidae). Forests. 13 (11), 1945 (2022).
- Durmuşoğlu, E., Hatipoğlu, A., Gürkan, M. O., Moores, G. Comparison of different bioassay methods for determining insecticide resistance in European Grapevine Moth, Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller) (Lepidoptera: Tortricidae). Turkish Journal of Entomology. 39 (3), 271-276 (2015).
- Paramasivam, M., Selvi, C. Laboratory bioassay methods to assess the insecticide toxicity against insect pests-A review. Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (3), 1441-1445 (2017).
- Clark, E. L., Isitt, R., Plettner, E., Fields, P. G., Huber, D. P. W. An inexpensive feeding bioassay technique for stored-product insects. Journal of Economic Entomology. 107 (1), 455-461 (2014).
- Waldbauer, G. P., Cohen, R. W., Friedman, S. An improved procedure for laboratory rearing of the corn earworm, Heliothis zea (Lepidoptera: Noctuidae). The Great Lakes Entomologist. 17 (2), 10 (2017).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Laboratory rearing of stable flies and other muscoid Diptera. JoVE. (138), e57341 (2018).
- Zheng, M. -L., Zhang, D. -J., Damiens, D. D., Lees, R. S., Gilles, J. R. L. Standard operating procedures for standardized mass rearing of the dengue and chikungunya vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)-II-Egg storage and hatching. Parasites & Vectors. 8, 1-7 (2015).
- Nagarkatti, S., Prakash, S. Rearing Heliothis armigera (Hubn.) on an artificial diet. Technical Bulletin Commonwealth Institute of Biological Control. , (1974).
- Adhav, A. S., Kokane, S. R., Joshi, R. S. Functional characterization of Helicoverpa armigera trehalase and investigation of physiological effects caused due to its inhibition by Validamycin A formulation. International Journal of Biological Macromolecules. 112, 638-647 (2018).
- Abbasi, B. H., et al. Rearing the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, on a tapioca-based artificial diet. Journal of Insect Science. 7 (1), 35 (2007).
- Armes, N. J., Jadhav, D. R., Bond, G. S., King, A. B. S. Insecticide resistance in Helicoverpa armigera in South India. Pesticide Science. 34 (4), 355-364 (1992).
- Waldbauer, G. P. The consumption and utilization of food by insects. Advances in Insect Physiology. 5, Academic Press. 229-288 (1968).
- Carpinella, M. C., Defago, M. T., Valladares, G., Palacios, S. M. Antifeedant and insecticide properties of a limonoid from Melia azedarach (Meliaceae) with potential use for pest management. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (2), 369-374 (2003).
- Diaz Napal, G. N., Palacios, S. M. Bioinsecticidal effect of the flavonoids pinocembrin and quercetin against Spodoptera frugiperda. Journal of Pest Science. 88, 629-635 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , 4-38 (1990).
- Gikonyo, N. K., Mwangi, R. W., Midiwo, J. O. Toxicity and growth-inhibitory activity of Polygonum senegalense (Meissn.) surface exudate against Aedes aegypti larvae. International Journal of Tropical Insect Science. 18 (3), 229-234 (1998).
- Sharma, R., Sohal, S. K. Bioefficacy of quercetin against melon fruit fly. Bulletin of Insectology. 66 (1), 79-83 (2013).
- Després, L., David, J. -P., Gallet, C. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 298-307 (2007).
- Shi, G., Kang, Z., Ren, F., Zhou, Y., Guo, P. Effects of quercetin on the growth and expression of immune-pathway-related genes in silkworm (Lepidoptera: Bombycidae). Journal of Insect Science. 20 (6), 23 (2020).
- Selin-Rani, S., et al. Toxicity and physiological effect of quercetin on generalist herbivore, Spodoptera litura Fab. and a non-target earthworm Eisenia fetida Savigny. Chemosphere. 165, 257-267 (2016).
- Ateyyat, M., Abu-Romman, S., Abu-Darwish, M., Ghabeish, I. Impact of flavonoids against woolly apple aphid, Eriosoma lanigerum (Hausmann) and its sole parasitoid, Aphelinus mali (Hald). Journal of Agricultural Science. 4 (2), 227 (2012).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. JoVE. (144), e57768 (2019).
- Mitchell, C., Brennan, R. M., Graham, J., Karley, A. J. Plant defense against herbivorous pests: exploiting resistance and tolerance traits for sustainable crop protection. Frontiers in Plant Science. 7, 1132 (2016).
