Summary
Este protocolo descreve o ensaio alimentar obrigatório para avaliar o efeito potencialmente tóxico de um fitoquímico sobre as larvas de insetos lepidópteros. Este é um bioensaio de insetos altamente escalável, fácil de otimizar a dose subletal e letal, atividade dissuasora e efeito fisiológico. Isso poderia ser usado para a triagem de inseticidas ecológicos.
Abstract
Helicoverpa armigera, um inseto lepidóptero, é uma praga polífaga com distribuição mundial. Este inseto herbívoro é uma ameaça às plantas e à produtividade agrícola. Em resposta, as plantas produzem vários fitoquímicos que impactam negativamente o crescimento e a sobrevivência do inseto. Este protocolo demonstra um método de ensaio alimentar obrigatório para avaliar o efeito de um fitoquímico (quercetina) sobre o crescimento, desenvolvimento e sobrevivência de insetos. Sob condições controladas, os neonatos foram mantidos até o segundo ínstar em dieta artificial pré-definida. Essas larvas de segundo ínstar foram autorizadas a se alimentar de uma dieta artificial controle e contendo quercetina por 10 dias. O peso corporal dos insetos, o estágio de desenvolvimento, o peso do frass e a mortalidade foram registrados em dias alternados. A mudança no peso corporal, a diferença no padrão alimentar e fenótipos de desenvolvimento foram avaliados ao longo do tempo de ensaio. O ensaio alimentar obrigatório descrito simula um modo natural de ingestão e pode ser escalado para um grande número de insetos. Permite analisar o efeito de fitoquímicos na dinâmica de crescimento, transição de desenvolvimento e aptidão geral de H. armigera. Além disso, esse arranjo também pode ser utilizado para avaliar alterações em parâmetros nutricionais e processos fisiológicos digestivos. Este artigo fornece uma metodologia detalhada para sistemas de ensaio de alimentação, que pode ter aplicações em estudos toxicológicos, triagem de moléculas inseticidas e compreensão de efeitos químicos em interações planta-inseto.
Introduction
Os fatores bióticos que afetam a produtividade das culturas são principalmente agentes patogênicos e pragas. Vários insetos-praga causam de 15% a 35% das perdas nas culturas agrícolas e afetam as práticas de sustentabilidade econômica1. Insetos pertencentes às ordens Coleoptera, Hemiptera e Lepidoptera são as principais ordens de pragas devastadoras. A natureza altamente adaptativa do ambiente tem beneficiado os lepidópteros na evolução de vários mecanismos de sobrevivência. Dentre os insetos lepidópteros, Helicoverpa armigera (Cotton bollworm) pode se alimentar de cerca de 180 culturas diferentes e causar danos significativos aos seus tecidos reprodutivos2. Em todo o mundo, a infestação por H. armigera resultou em uma perda de cerca de US$ 5 bilhões3. Algodão, grão-de-bico, feijão guandu, tomate, girassol e outras culturas são hospedeiros de H. armigera. Ele completa seu ciclo de vida em diferentes partes das plantas hospedeiras. Ovos postos por mariposas fêmeas eclodem nas folhas, seguindo-se de sua alimentação em tecidos vegetativos durante os estágios larvais. A fase larval é a mais destrutiva devido à sua natureza voraz e altamenteadaptável4,5. H. armigera apresenta distribuição global e invasão de novos territórios devido a seus atributos marcantes, como polifagia, excelentes habilidades migratórias, maior fecundidade, forte diapausa e surgimento de resistência às estratégias de controle de insetos existentes6.
Diversas moléculas químicas provenientes de terpenos, flavonoides, alcaloides, polifenóis, glicosídeos cianogênicos e muitos outros são amplamente utilizadas para o controle da infestação por H. armigera 7. No entanto, a aplicação frequente de moléculas químicas acarreta efeitos adversos ao meio ambiente e à saúde humana devido à aquisição de seus resíduos. Além disso, apresentam efeito prejudicial sobre vários predadores de pragas, resultando em desequilíbrio ecológico 8,9. Portanto, há necessidade de investigar opções seguras e ecologicamente corretas para moléculas químicas de controle de pragas.
Moléculas inseticidas naturais produzidas por plantas (fitoquímicos) podem ser usadas como uma alternativa promissora aos pesticidas químicos. Esses fitoquímicos incluem vários metabólitos secundários pertencentes às classes alcaloides, terpenóides e fenólicos 7,10. A quercetina é um dos flavonoides (compostos fenólicos) mais abundantes presentes em vários grãos, vegetais, frutas e folhas. Apresenta atividade dissuasora alimentar e inseticida contra insetos; Além disso, não é prejudicial aos inimigos naturais de pragas11,12. Assim, este protocolo demonstra o ensaio alimentar utilizando quercetina para avaliar seu efeito tóxico sobre H. armigera.
Vários métodos de bioensaio têm sido desenvolvidos para avaliar o efeito de moléculas naturais e sintéticas sobre a alimentação, crescimento, desenvolvimento e padrões comportamentais de um inseto13. Os métodos comumente utilizados incluem o ensaio de disco foliar, ensaio de escolha alimentar, ensaio de alimentação por gotículas, ensaio de contato, ensaio de cobertura de dieta e ensaio de alimentação obrigatória13,14. Esses métodos são classificados com base em como os pesticidas são aplicados aos insetos. O ensaio alimentar obrigatório é um dos métodos mais comumente utilizados, sensíveis, simples e adaptáveis para testar prováveis inseticidas e sua dose letal14. Em um ensaio de alimentação obrigatória, a molécula de interesse é misturada com uma dieta artificial. Isso proporciona consistência e controle sobre a composição da dieta, gerando resultados robustos e reprodutíveis. Variáveis importantes que afetam os ensaios alimentares são o estágio de desenvolvimento do inseto, a escolha do inseticida, fatores ambientais e tamanho da amostra. A duração do ensaio, o intervalo entre dois registros de dados, a frequência e a quantidade de dieta alimentada, a saúde dos insetos e a habilidade de manuseio dos operadores também podem influenciar o resultado dos ensaios alimentares 14,15.
Este estudo tem como objetivo demonstrar o ensaio de obrigatoriedade alimentar para avaliar o efeito da quercetina na sobrevivência e aptidão física de H. armigera . A avaliação de vários parâmetros, como peso corporal do inseto, taxa de mortalidade e defeitos de desenvolvimento, fornecerá informações sobre os efeitos inseticidas da quercetina. Enquanto isso, a mensuração de parâmetros nutricionais, incluindo a eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI), eficiência de conversão do alimento digerido (ECD) e digestibilidade aproximada (AD), destacará os atributos antialimentares da quercetina.
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Protocol
Larvas de H. armigera foram adquiridas do ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), Bangalore, Índia. Um total de 21 larvas de segundo estádio foi utilizado para o presente estudo.
1. Preparação de dieta artificial à base de grão-de-bico
NOTA: Uma lista de ingredientes necessários para preparar uma dieta artificial é mencionada na Tabela 1.
- Pesar todas as fracções separadamente num copo, tal como indicado no quadro 1, e preparar uma mistura homogénea utilizando uma espátula/agitador magnético.
- Ferva a Fração C a cerca de 100 °C usando um micro-ondas por 5 min, adicione à Fração A e misture bem.
- Depois de misturar completamente, deixe a fração mista esfriar um pouco antes de adicionar a Fração B (a Fração B contém componentes termolábeis).
- Despeje em uma placa de Petri transparente, de poliestireno, 150 mm x 150 mm.
2. Preparação de dieta artificial contendo quercetina
- Pesar a quantidade adequada (1.000 ppm) de hidrato de quercetina (ver Tabela de Materiais) e dissolvê-la adequadamente no volume mínimo de solventes orgânicos, como etanol (2 mg/mL), dimetilsulfóxido (DMSO; 30 mg/mL) ou dimetilformamida (DMF). Aqui, DMSO é usado para dissolver quercetina.
- Adicionar quercetina dissolvida na Fração B, seguida de adição na mistura das Frações A e C (o volume de água reduzido da Fração B é igual ao volume de DMSO adicionado).
- Adicione um volume igual de solvente orgânico usado para dissolver a quercetina na dieta controle.
NOTA: A Figura 1 mostra a representação esquemática do preparo de dietas artificiais e contendo quercetina.
3. Criação e manutenção da cultura de H. armigera
OBS: Utilizar materiais adequadamente limpos e esterilizados para criação e manutenção de insetos. Manusear os insetos cuidadosamente, seguindo todas as práticas operacionais padrão relacionadas à esterilidade e segurança 16,17,18.
- Manter os ovos de H. armigera na câmara de reprodução (frasco plástico coberto com pano de musselina nas condições de manutenção, conforme descrito na etapa 3.3. Em seguida, transfira suavemente neonatos recém-surgidos usando um pincel fino em uma dieta artificial à base de grão-de-bico recém-preparada.
- Utilizar dieta artificial para criação das larvas e solução de sacarose a 20% (p/v) com multivitamínico a 1% (p/v) (ver Tabela de Materiais) para mariposas adultas19,20.
NOTA: Como as larvas de terceiro e mais velho ínstar de H. armigera apresentam uma tendência canibalística, é necessário criar cada larva em um frasco separado. - Manter a temperatura de 25 ± 1 °C e umidade relativa do ar de 70% na sala de cultivo de insetos, com fotoperíodo de 16 h claro:8 h escuro21.
- Criar uma geração de insetos no laboratório para homogeneidade e, em seguida, usá-lo para o ensaio de alimentação.
- Opcionalmente, aumentar a temperatura da sala de cultivo de insetos para 28 °C para acelerar o crescimento de larvas e pupas22.
4. Configuração para o ensaio de alimentação
- Coletar larvas de 21 segundos ínstares para cada conjunto (controle e tratamento) e mantê-las longe da dieta, por aproximadamente 1-3 h.
- Corte a dieta controle e contendo quercetina em pequenos pedaços, registre o peso da dieta dada e o corpo do inseto e transfira cuidadosamente os insetos para frascos de cultura. Permita que os insetos se alimentem da respectiva dieta.
NOTA: Isso deve ser considerado como o Dia 0 do ensaio de alimentação. - Registre o peso do corpo do inseto, dada dieta, dieta não consumida e frass em dias alternados (Dias 2, 4, 6, 8 e 10) até o 10º dia de ensaio.
- Após o 10º dia, mantê-los se alimentando de sua respectiva dieta para observar novas mudanças de desenvolvimento e morfológicas.
OBS: As alterações de desenvolvimento por meio de: (1) intermediários larval-pupa, como a metade posterior da pupa com retalhos de cutícula larval, cápsula cefálica e pernas torácicas; (2) pré-pupas com corpo completamente enegrecido; (3) pupas subdimensionadas com encolhimento corporal; (4) mariposas-pupas intermediárias-mariposas com a pele pupal velha. As alterações morfológicas incluem adultos malformados de mariposas com corpos anormais, asas torcidas e pernas articuladas. Essas mudanças são então comparadas com insetos alimentados com a dieta controle. - Congelar os insetos no dia 10 se o estudo de defeitos de desenvolvimento e morfológicos não for necessário.
NOTA: Antes de congelar as larvas, elas precisam ser mantidas privadas da dieta por pelo menos 3 h para remover a dieta residual do trato digestivo.
5. Registro e análise dos dados
- No software GraphPad Prism (consulte Tabela de Materiais), escolha uma tabela de dados XY na caixa de diálogo "Bem-vindo ou Nova Tabela" e, nela, insira o número de insetos que replicam valores lado a lado nas subcolunas. Em seguida, dê o nome do título ao eixo X como número de dias e, nos grupos A e B, dê o nome do título como controle e tratamento com quercetina, respectivamente. Coloque o peso corporal de cada inseto sob controle e tratamento para gerar o gráfico de peso corporal.
NOTA: A análise no GraphPad pode variar de acordo com o tamanho da amostra e o número de tratamentos. - Comparar o peso corporal do inseto entre os grupos controle e tratamento usando o teste t de Student (α = 0,05).
- Conte as larvas e pupas vivas e mortas no Dia 10 para traçar uma curva de Kaplan-Meier para porcentagem de sobrevivência usando o software gráfico.
- Conte o número de pupas e calcule a porcentagem de pupação usando a fórmula dada:
- Porcentagem de pupação (%) = (número de pupas formadas/número total de larvas) x 100
- Comparar o desenvolvimento larval em termos de índices nutricionais23 utilizando as seguintes fórmulas, ICE (%) = (ganho de peso das larvas/peso da ração ingerida) x 100
DCE (%) = (ganho de peso das larvas/[peso da ração ingerida - peso do frass]) x 100
DA (%) = ([peso da ração consumida - peso da ração]/peso da ração ingerida) x 100
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Representative Results
Larvas de insetos alimentadas com uma dieta contendo 1.000 ppm de quercetina apresentaram uma diminuição significativa no peso corporal de ~57% em relação ao grupo controle (Figura 2A). A redução do peso corporal resultou na redução do tamanho corporal das larvas tratadas com quercetina (Figura 2B). Uma notável redução foi observada na taxa de alimentação das larvas alimentadas com quercetina em relação ao controle (Figura 2C).
Além disso, larvas alimentadas com quercetina apresentaram uma diminuição na taxa de pupação em ~14% e atraso na pupação, sugerindo retardo no desenvolvimento após o tratamento (Figura 3A,B). Além disso, ~77,65% da sobrevivência e fenótipos letais foram observados em larvas de insetos alimentadas com dieta contendo quercetina (Figura 4A,B). Os parâmetros nutricionais foram calculados para as larvas controle e alimentadas com quercetina com base no consumo e utilização de alimento (Tabela Suplementar 1). O ICE para matéria corporal e o ECD para insetos alimentados com a dieta contendo quercetina a 1.000 ppm foram reduzidos em ~9% e ~49%, respectivamente. A diminuição da DCE pode ser devida à falta de metabólitos disponíveis no organismo do inseto20. A DA dos insetos alimentados com quercetina foi aumentada em ~5% em relação ao controle (Tabela 2). Em geral, os resultados obtidos indicam que a quercetina tem efeitos negativos significativos sobre o crescimento de insetos e o desenvolvimento de H. armigera.
Figura 1: Representação esquemática do preparo de uma dieta artificial e dieta contendo quercetina. As frações A, B e C são misturadas para fazer uma dieta artificial e contendo quercetina. As larvas são alimentadas com a respectiva dieta por 10 dias. As setas azuis do processo representam uma dieta artificial, enquanto as setas vermelhas do processo representam a preparação de uma dieta contendo quercetina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dados representativos do ensaio de alimentação com quercetina. (A) Gráfico do peso corporal de larvas de H. armigera após a alimentação de 1.000 ppm de quercetina em comparação com o controle nos Dias 2, 4, 6, 8 e 10. O peso corporal das larvas é de miligramas (mg). (B) O tamanho médio das larvas é registrado no Dia 10. Barra de escala = 1 cm. (C) Taxa média de alimentação registrada nos dias 2, 4, 6, 8 e 10. O peso da ração é em miligramas (mg). Círculos azuis e quadrados vermelhos representam os dados médios dos insetos controle e tratados com quercetina em dias alternados, respectivamente. O teste t de Student é utilizado para comparação dos dois grupos (pareados). Os dados representam média ± EPM (n = 21 larvas de segundo ínstar; *p < 0,05 indica significância estatística). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dados representativos para a pupação a partir do ensaio de alimentação. (A) Gráfico de porcentagem de pupação. (B) Imagens de pupas (Dia 15) mostrando uma taxa de pupação atrasada e reduzida no tratamento com quercetina. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dados representativos de sobrevivência no Dia 10 após a alimentação de 1.000 ppm de quercetina em comparação com o controle. (A) O gráfico de sobrevivência de Kaplan-Meier para insetos alimentados com quercetina indica diminuição da taxa de sobrevivência. Os insetos controle apresentam uma taxa de sobrevivência de ~96%, e os insetos tratados com quercetina apresentam uma sobrevivência de ~77,65%. (B) Imagens de fenótipos letais de larvas alimentadas com quercetina tiradas no Dia 10. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Fração A | ||
| 1 | Grama de Bengala | 50 gr |
| 2 | Extrato de levedura | 12 gr |
| 3 | Caseína | 3,5 gr |
| 4 | Ácido sórbico | 0,5 gr |
| 5 | Parabenos Metílicos | 1 gr |
| 6 | dH2O | 150 mL |
| Fração B | ||
| 1 | Cloreto de colina | 0,35 gr |
| 2 | Estreptomicina | 0,02 gr |
| 3 | Ácido ascórbico | 2 g |
| 4 | Colesterol | 0,15 gr |
| 5 | Cápsula multivitamínica | 1 |
| 6 | Cápsula de vitamina E | 1 |
| 7 | dH2O | 30 mL |
| Fração C | ||
| 1 | Agar Agar | 6,5 gr |
| 2 | dH2O | 180 mL |
Tabela 1: Composição da dieta artificial.
| Tratamento (concentração de Quercentina) | Índices nutricionais (%) | ||
| ICE | ECD | ANÚNCIO | |
| 0 ppm | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 páginas | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
Tabela 2: Efeito da ingestão de quercetina sobre o comportamento alimentar e utilização da dieta de H. armigera . Abreviações: ECI = eficiência de conversão dos alimentos ingeridos; DCE = eficiência de conversão do alimento digerido; AD = digestibilidade aproximada.
Quadro suplementar 1: Exemplo da ficha técnica para o ensaio de alimentação com quercetina. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Bioensaios laboratoriais são úteis para prever desfechos e produzir dados comparativos de toxicidade de vários compostos em um curto período a um custo razoável. O bioensaio alimentar ajuda a interpretar as interações entre inseto-inseticida e inseto-planta-inseticida. É um método eficiente para medir a toxicidade de uma variedade de substâncias que simplifica significativamente o processo de estabelecimento da dose letal 50 (DL50), concentração letal 50 (CL50), ou qualquer outra concentração ou dose letal24,25. Vários bioensaios laboratoriais são utilizados para determinar a atividade inseticida, a resistência a inseticidas e a toxicidade de compostos, incluindo cobertura da dieta, aplicação tópica, alimentação obrigatória, método de injeção, contato ou resíduo e método do filme13,14. Todos esses métodos podem ser utilizados com base no objetivo de um estudo particular, porém a abordagem ideal do bioensaio deve ser rápida eeficaz26. Assim, o método de ensaio alimentar obrigatório discutido neste manuscrito pode ser o bioensaio de escolha em vários casos, exceto para insetos sugadores.
O ensaio de alimentação obrigatória descrito neste manuscrito pode ser usado para estudar o efeito de qualquer composto sobre o crescimento, desenvolvimento, alimentação e sobrevivência de larvas de insetos. Nos resultados representativos aqui apresentados, a atividade inseticida da quercetina foi examinada contra larvas de H. armigera, fornecendo uma justificativa para futuras explorações. Reduções significativas no peso corporal de ~57% (Figura 2A,B), mudanças na taxa de alimentação (Figura 2C) e diminuição da taxa de sobrevivência de ~18% (Figura 4A,B) foram observadas em larvas alimentadas com quercetina. Além disso, insetos alimentados com dieta de quercetina apresentaram pupação retardada e reduzida em ~14% (Figura 3A,B). Também foi observada mudança significativa nos índices nutricionais, incluindo ICE, DCE e DA (Tabela 2), em relação ao controle. Em geral, estes resultados indicam que a quercetina tem um efeito deletério sobre o crescimento, desenvolvimento e sobrevivência de larvas de H. armigera. Todas essas observações seguem o efeito antibiose da quercetina sobre Aedes aegypti27, Bactrocera cucurbitae Coquillett28 e Drosophila melanogaster29. Além disso, essas observações estão de acordo com o aumento da letalidade em Bombyx mori devido ao comprometimento do sistema imune30, redução do peso larval e fecundidade em Spodoptera litura31, Hyphantria cunea12 e Eriosoma lanigerum32.
Tomar precauções, como uniformidade no tamanho da amostra, é crucial para reduzir a variância biológica entre os experimentos. Para garantir a reprodutibilidade, o ensaio alimentar deve ser realizado utilizando larvas de insetos do mesmo ínstar em uma sala de cultivo de insetos com temperaturas e níveis de umidade consistentes. Ao preparar uma dieta artificial, deve-se ter certeza de que o fitoquímico é uniformemente misturado com a dieta. Para minimizar o erro devido à degradação fitoquímica ao longo do tempo, uma dieta recém-preparada é preferível para o ensaio. As propriedades dos fitoquímicos, tais como termossensibilidade, sensibilidade à luz, solubilidade, etc., devem ser consideradas durante o preparo e armazenamento da dieta artificial. Dietas que foram secas ao longo do tempo podem mudar de cor e encolher, e não devem ser utilizadas para o ensaio de alimentação. Os resultados dos ensaios não devem ser considerados quando as taxas de mortalidade do controle forem superiores a 10%33. Os materiais, como espátula, béqueres, placas de Petri, etc., necessários para o preparo da dieta e pesagem de insetos devem ser separados para os grupos controle e tratamento para evitar erros devido à contaminação cruzada.
O bioensaio de alimentação de insetos é altamente específico e reprodutível, mas apresenta algumas limitações. Por exemplo, quando um inseto ataca uma planta, a imunidade da planta produz características estruturais ou químicas para reduzir a alimentação de herbívoros e, assim, minimizar os danos causados pelos herbívoros34. No entanto, essas características defensivas e seus efeitos não são observados durante este ensaio. Outra limitação é que a concentração definida de fitoquímicos ingeridos pelos insetos não pode ser determinada14. A estabilidade do conteúdo nutricional da dieta e fitoquímicos utilizados é um importante fator limitante que pode influenciar seu efeito sobre insetos.
Apesar das limitações acima mencionadas, o ensaio de alimentação obrigatória é acessível e pode testar um grande número de muitos insetos simultaneamente. Além disso, este ensaio pode ser adaptado para selecionar várias moléculas para estudar suas propriedades antialimentares e inseticidas contra diferentes classes de insetos.
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Disclosures
Os autores declararam a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
SM, YP e VN reconhecem a bolsa concedida pela Comissão de Bolsas Universitárias, Governo da Índia, Nova Delhi. O RJ agradece ao Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR), Índia, e ao CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, Índia, pelo apoio financeiro sob os códigos de projeto MLP036626, MLP101526 e YSA000826.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
- Popp, J., Pető, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2013).
- da Silva, F. R., et al. Comparative toxicity of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) to selected insecticides. Insects. 11 (7), 431 (2020).
- Usman, A., Ali, M. I., Shah, M., e Amin, F., Sarwar, J. Comparative efficacy of indigenous plant extracts and a synthetic insecticide for the management of tomato fruit worm (Helicoverpa armigera Hub.) and their effect on natural enemies in tomato crop. Pure and Applied Biology. 7 (3), 1014-1020 (2018).
- Honnakerappa, S. B., Udikeri, S. S. Abundance of Helicoverpa armigera (Hubner) on different host crops. Journal of Farm Science. 31, 436-439 (2018).
- Edosa, T. T. Review on bio-intensive management of African bollworm, Helicoverpa armigera (Hub.): Botanicals and semiochemicals perspectives. African Journal of Agricultural Research. 14 (1), 1-9 (2019).
- Zhou, Y., et al. Migratory Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) exhibits marked seasonal variation in morphology and fitness. Environmental Entomology. 48 (3), 755-763 (2019).
- Souto, A. L., et al. Plant-derived pesticides as an alternative to pest management and sustainable agricultural production: Prospects, applications and challenges. Molecules. 26 (16), 4835 (2021).
- Özkara, A., Akyıl, D., Konuk, M. Pesticides, environmental pollution, and health. Environmental Health Risk-Hazardous Factors to Living Species. , (2016).
- Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42 (2021).
- Tlak Gajger, I., Dar, S. A. Plant allelochemicals as sources of insecticides. Insects. 12 (3), 189 (2021).
- Riddick, E. W. Potential of quercetin to reduce herbivory without disrupting natural enemies and pollinators. Agriculture. 11 (6), 476 (2021).
- Gao, Y. -L., et al. The effect of quercetin on the growth, development, nutrition utilization, and detoxification enzymes in Hyphantria cunea Drury (Lepidoptera: Arctiidae). Forests. 13 (11), 1945 (2022).
- Durmuşoğlu, E., Hatipoğlu, A., Gürkan, M. O., Moores, G. Comparison of different bioassay methods for determining insecticide resistance in European Grapevine Moth, Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller) (Lepidoptera: Tortricidae). Turkish Journal of Entomology. 39 (3), 271-276 (2015).
- Paramasivam, M., Selvi, C. Laboratory bioassay methods to assess the insecticide toxicity against insect pests-A review. Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (3), 1441-1445 (2017).
- Clark, E. L., Isitt, R., Plettner, E., Fields, P. G., Huber, D. P. W. An inexpensive feeding bioassay technique for stored-product insects. Journal of Economic Entomology. 107 (1), 455-461 (2014).
- Waldbauer, G. P., Cohen, R. W., Friedman, S. An improved procedure for laboratory rearing of the corn earworm, Heliothis zea (Lepidoptera: Noctuidae). The Great Lakes Entomologist. 17 (2), 10 (2017).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Laboratory rearing of stable flies and other muscoid Diptera. JoVE. (138), e57341 (2018).
- Zheng, M. -L., Zhang, D. -J., Damiens, D. D., Lees, R. S., Gilles, J. R. L. Standard operating procedures for standardized mass rearing of the dengue and chikungunya vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)-II-Egg storage and hatching. Parasites & Vectors. 8, 1-7 (2015).
- Nagarkatti, S., Prakash, S. Rearing Heliothis armigera (Hubn.) on an artificial diet. Technical Bulletin Commonwealth Institute of Biological Control. , (1974).
- Adhav, A. S., Kokane, S. R., Joshi, R. S. Functional characterization of Helicoverpa armigera trehalase and investigation of physiological effects caused due to its inhibition by Validamycin A formulation. International Journal of Biological Macromolecules. 112, 638-647 (2018).
- Abbasi, B. H., et al. Rearing the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, on a tapioca-based artificial diet. Journal of Insect Science. 7 (1), 35 (2007).
- Armes, N. J., Jadhav, D. R., Bond, G. S., King, A. B. S. Insecticide resistance in Helicoverpa armigera in South India. Pesticide Science. 34 (4), 355-364 (1992).
- Waldbauer, G. P. The consumption and utilization of food by insects. Advances in Insect Physiology. 5, Academic Press. 229-288 (1968).
- Carpinella, M. C., Defago, M. T., Valladares, G., Palacios, S. M. Antifeedant and insecticide properties of a limonoid from Melia azedarach (Meliaceae) with potential use for pest management. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (2), 369-374 (2003).
- Diaz Napal, G. N., Palacios, S. M. Bioinsecticidal effect of the flavonoids pinocembrin and quercetin against Spodoptera frugiperda. Journal of Pest Science. 88, 629-635 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , 4-38 (1990).
- Gikonyo, N. K., Mwangi, R. W., Midiwo, J. O. Toxicity and growth-inhibitory activity of Polygonum senegalense (Meissn.) surface exudate against Aedes aegypti larvae. International Journal of Tropical Insect Science. 18 (3), 229-234 (1998).
- Sharma, R., Sohal, S. K. Bioefficacy of quercetin against melon fruit fly. Bulletin of Insectology. 66 (1), 79-83 (2013).
- Després, L., David, J. -P., Gallet, C. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 298-307 (2007).
- Shi, G., Kang, Z., Ren, F., Zhou, Y., Guo, P. Effects of quercetin on the growth and expression of immune-pathway-related genes in silkworm (Lepidoptera: Bombycidae). Journal of Insect Science. 20 (6), 23 (2020).
- Selin-Rani, S., et al. Toxicity and physiological effect of quercetin on generalist herbivore, Spodoptera litura Fab. and a non-target earthworm Eisenia fetida Savigny. Chemosphere. 165, 257-267 (2016).
- Ateyyat, M., Abu-Romman, S., Abu-Darwish, M., Ghabeish, I. Impact of flavonoids against woolly apple aphid, Eriosoma lanigerum (Hausmann) and its sole parasitoid, Aphelinus mali (Hald). Journal of Agricultural Science. 4 (2), 227 (2012).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. JoVE. (144), e57768 (2019).
- Mitchell, C., Brennan, R. M., Graham, J., Karley, A. J. Plant defense against herbivorous pests: exploiting resistance and tolerance traits for sustainable crop protection. Frontiers in Plant Science. 7, 1132 (2016).
