Summary
يصف هذا البروتوكول مقايسة التغذية الملزمة لتقييم التأثير السام المحتمل للمادة الكيميائية النباتية على يرقات الحشرات حرشفية الأجنحة. هذا اختبار حيوي للحشرات قابل للتطوير بدرجة كبيرة ، وسهل لتحسين الجرعة شبه المميتة والمميتة ، والنشاط الرادع ، والتأثير الفسيولوجي. يمكن استخدام هذا لفحص المبيدات الحشرية الصديقة للبيئة.
Abstract
Helicoverpa armigera ، حشرة حرشفية الأجنحة ، هي آفة متعددة الآفات ذات توزيع عالمي. هذه الحشرة العاشبة تشكل تهديدا للنباتات والإنتاجية الزراعية. ردا على ذلك ، تنتج النباتات العديد من المواد الكيميائية النباتية التي تؤثر سلبا على نمو الحشرة وبقائها. يوضح هذا البروتوكول طريقة فحص التغذية الملزمة لتقييم تأثير مادة كيميائية نباتية (كيرسيتين) على نمو الحشرات وتطورها وبقائها. في ظل ظروف خاضعة للرقابة ، تم الحفاظ على حديثي الولادة حتى المرحلة الثانية من نظام غذائي اصطناعي محدد مسبقا. سمح لهذه اليرقات الثانية بالتغذي على نظام غذائي اصطناعي يحتوي على كيرسيتين لمدة 10 أيام. تم تسجيل وزن جسم الحشرات ومرحلة نموها ووزن الفراس والوفيات في أيام متناوبة. تم تقييم التغير في وزن الجسم ، والفرق في نمط التغذية ، والأنماط الظاهرية التنموية طوال فترة الفحص. يحاكي فحص التغذية الإلزامي الموصوف طريقة طبيعية للابتلاع ويمكن توسيع نطاقه إلى عدد كبير من الحشرات. يسمح للمرء بتحليل تأثير المواد الكيميائية النباتية على ديناميكيات النمو ، والانتقال التنموي ، واللياقة العامة ل H. armigera. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا الإعداد لتقييم التغيرات في المعلمات الغذائية وعمليات فسيولوجيا الجهاز الهضمي. تقدم هذه المقالة منهجية مفصلة لأنظمة فحص التغذية ، والتي قد يكون لها تطبيقات في الدراسات السمية ، وفحص جزيئات المبيدات الحشرية ، وفهم التأثيرات الكيميائية في تفاعلات الحشرات النباتية.
Introduction
العوامل الحيوية التي تؤثر على إنتاجية المحاصيل هي أساسا العوامل المسببة للأمراض والآفات. تتسبب العديد من الآفات الحشرية في 15٪ إلى 35٪ من فقدان المحاصيل الزراعية وتؤثر على ممارسات الاستدامة الاقتصادية1. الحشرات التي تنتمي إلى رتبة غمدية الأجنحة ، Hemiptera ، و Lepidoptera هي الرتب الرئيسية للآفات المدمرة. استفادت الطبيعة التكيفية للغاية للبيئة من حرشفيات الأجنحة في تطوير العديد من آليات البقاء. من بين الحشرات حرشفية الأجنحة ، يمكن أن تتغذى Helicoverpa armigera (دودة اللوز القطنية) على حوالي 180 محصولا مختلفا وتسبب أضرارا كبيرة لأنسجتهاالتناسلية 2. في جميع أنحاء العالم ، أدت الإصابة ب H. armigera إلى خسارة حوالي 5 مليارات دولار3. القطن والحمص والبازلاء والطماطم وعباد الشمس وغيرها من المحاصيل هي مضيفات ل H. armigera. يكمل دورة حياته على أجزاء مختلفة من النباتات المضيفة. يفقس البيض الذي تضعه إناث العث على الأوراق ، يليه تغذيته على الأنسجة النباتية خلال مراحل اليرقات. مرحلة اليرقات هي الأكثر تدميرا بسبب طبيعتها الشرهة والقابلة للتكيف للغاية 4,5. يظهر H. armigera توزيعا عالميا وتعديا على مناطق جديدة بسبب سماته الرائعة ، مثل تعدد القطع ، وقدرات الهجرة الممتازة ، والخصوبة العالية ، والتوقف القوي ، وظهور مقاومة لاستراتيجيات مكافحة الحشرات الحالية6.
تستخدم على نطاق واسع جزيئات كيميائية متنوعة من التربينات والفلافونويد والقلويات والبوليفينول والجلوكوزيدات السيانوجينية وغيرها الكثير للسيطرة على الإصابة ب H. armigera 7. ومع ذلك ، فإن التطبيق المتكرر للجزيئات الكيميائية يضفي آثارا ضارة على البيئة وصحة الإنسان بسبب الحصول على بقاياها. أيضا ، فإنها تظهر تأثيرا ضارا على مختلف المفترسة للآفات ، مما يؤدي إلى اختلال التوازن البيئي 8,9. لذلك ، هناك ضرورة للتحقيق في خيارات آمنة وصديقة للبيئة للجزيئات الكيميائية لمكافحة الآفات.
يمكن استخدام جزيئات المبيدات الحشرية الطبيعية التي تنتجها النباتات (المواد الكيميائية النباتية) كبديل واعد للمبيدات الكيميائية. تشمل هذه المواد الكيميائية النباتية العديد من المستقلبات الثانوية التي تنتمي إلى فئات قلويدات ، تيربينويدات ، والفينولات7،10. كيرسيتين هو واحد من أكثر مركبات الفلافونويد وفرة (مركب الفينول) الموجودة في مختلف الحبوب والخضروات والفواكه والأوراق. يظهر نشاط التغذية الرادع والمبيدات الحشرية ضد الحشرات. أيضا ، أنها ليست ضارة للأعداء الطبيعيين للآفات11,12. وبالتالي ، يوضح هذا البروتوكول مقايسة التغذية باستخدام كيرسيتين لتقييم تأثيره السام على H. armigera.
تم تطوير طرق اختبار حيوي مختلفة لتقييم تأثير الجزيئات الطبيعية والاصطناعية على تغذية الحشرة ونموها وتطورها وأنماطها السلوكية13. تشمل الطرق الشائعة الاستخدام فحص قرص الأوراق ، وفحص التغذية بالاختيار ، ومقايسة تغذية القطيرات ، ومقايسة الاتصال ، وفحص تغطية النظام الغذائي ، ومقايسة التغذيةالملزمة 13،14. يتم تصنيف هذه الطرق بناء على كيفية تطبيق المبيدات على الحشرات. يعد اختبار التغذية الإلزامي أحد أكثر الطرق شيوعا وحساسية وبساطة وقابلية للتكيف لاختبار المبيدات الحشرية المحتملة وجرعتها المميتة14. في مقايسة التغذية الملزمة ، يتم خلط جزيء الاهتمام مع نظام غذائي اصطناعي. هذا يوفر الاتساق والتحكم في تكوين النظام الغذائي ، وتوليد نتائج قوية وقابلة للتكرار. المتغيرات المهمة التي تؤثر على فحوصات التغذية هي مرحلة نمو الحشرة ، واختيار المبيدات الحشرية ، والعوامل البيئية ، وحجم العينة. يمكن أن تؤثر مدة الفحص ، والفاصل الزمني بين تسجيلين للبيانات ، وتواتر وكمية النظام الغذائي الذي يتم تغذيته ، وصحة الحشرات ، ومهارة التعامل مع المشغلين أيضا على نتيجة فحوصات التغذية14,15.
تهدف هذه الدراسة إلى إظهار مقايسة التغذية الملزمة لتقييم تأثير الكيرسيتين على بقاء H. armigera واللياقة البدنية. سيوفر تقييم المعلمات المختلفة ، مثل وزن جسم الحشرات ومعدل الوفيات والعيوب التنموية ، نظرة ثاقبة لتأثيرات المبيدات الحشرية للكيرسيتين. وفي الوقت نفسه ، فإن قياس المعايير الغذائية ، بما في ذلك كفاءة تحويل الأغذية المبتلعة (ECI) ، وكفاءة تحويل الأغذية المهضومة (ECD) ، والهضم التقريبي (AD) ، سيسلط الضوء على السمات المضادة للتغذية للكيرسيتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على يرقات H. armigera من ICAR-المكتب الوطني للموارد الحشرية الزراعية (NBAIR) ، بنغالور ، الهند. تم استخدام ما مجموعه 21 يرقة ثانية في هذه الدراسة.
1. إعداد نظام غذائي اصطناعي قائم على الحمص
ملاحظة: قائمة المكونات المطلوبة لإعداد نظام غذائي اصطناعي مذكورة في الجدول 1.
- قم بوزن جميع الكسور بشكل منفصل في دورق ، كما هو موضح في الجدول 1 ، وقم بإعداد خليط متجانس باستخدام ملعقة / محرك مغناطيسي.
- اسلقي الجزء C على حرارة 100 درجة مئوية تقريبا باستخدام الميكروويف لمدة 5 دقائق ، ثم أضفه إلى الكسر أ ، واخلطه جيدا.
- بعد الخلط جيدا ، اترك الجزء المختلط يبرد قليلا قبل إضافة الجزء B (يحتوي الجزء B على مكونات قابلة للحرارة).
- تصب في طبق بتري شفاف من البوليسترين 150 مم × 150 مم.
2. إعداد نظام غذائي اصطناعي يحتوي على كيرسيتين
- قم بوزن الكمية المناسبة (1000 جزء في المليون) من هيدرات الكيرسيتين (انظر جدول المواد) وقم بإذابتها بشكل صحيح في الحد الأدنى لحجم المذيبات العضوية ، مثل الإيثانول (2 مجم / مل) ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO ؛ 30 مجم / مل) ، أو ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF). هنا ، يتم استخدام DMSO لإذابة كيرسيتين.
- أضف الكيرسيتين المذاب إلى الجزء B ، متبوعا بالإضافة إلى خليط الكسور A و C (حجم الماء المختزل من الكسر B يساوي حجم DMSO المضاف).
- أضف كمية متساوية من المذيبات العضوية المستخدمة لإذابة الكيرسيتين في النظام الغذائي الضابط.
ملاحظة: يوضح الشكل 1 التمثيل التخطيطي لإعداد الوجبات الغذائية الاصطناعية والتي تحتوي على كيرسيتين.
3. تربية وصيانة ثقافة H. armigera
ملاحظة: استخدم مواد تم تنظيفها وتعقيمها بشكل مناسب لتربية الحشرات وصيانتها. تعامل مع الحشرات بعناية باتباع جميع ممارسات التشغيل القياسية المتعلقة بالعقموالسلامة 16،17،18.
- احتفظ ببيض H. armigera في غرفة التكاثر (جرة بلاستيكية مغطاة بقطعة قماش شاش) مع الحفاظ على الظروف ، كما هو موضح في الخطوة 3.3. بعد ذلك، انقلي حديثي الولادة حديثي الولادة برفق باستخدام فرشاة رسم دقيقة على نظام غذائي اصطناعي طازج قائم على الحمص.
- استخدم نظاما غذائيا اصطناعيا لتربية اليرقات ، و 20٪ (وزن / حجم) محلول سكروز مع 1٪ (وزن / حجم) فيتامينات متعددة (انظر جدول المواد) للعث البالغ19،20.
ملاحظة: نظرا لأن اليرقات الثالثة والأكبر سنا من H. armigera تظهر ميلا إلى أكل لحوم البشر ، فمن الضروري تربية كل يرقة في قنينة منفصلة. - الحفاظ على درجة الحرارة عند 25 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية عند 70٪ في غرفة زراعة الحشرات ، مع ضوء 16 ساعة: 8 ساعات من الفترة الضوئية الداكنة21.
- قم بتربية جيل واحد من الحشرات في المختبر من أجل التجانس ثم استخدمه لفحص التغذية.
- اختياريا ، قم بزيادة درجة حرارة غرفة زراعة الحشرات إلى 28 درجة مئوية لتسريع نمو اليرقات والشرانق22.
4. الإعداد لفحص التغذية
- اجمع 21 يرقة داخلية ثانية لكل مجموعة (التحكم والعلاج) واحفظها بعيدا عن النظام الغذائي ، لمدة 1-3 ساعات تقريبا.
- قطع السيطرة والنظام الغذائي المحتوي على كيرسيتين إلى قطع صغيرة ، وتسجيل وزن النظام الغذائي المعطى وجسم الحشرة ، ونقل الحشرات بعناية إلى قوارير الثقافة. السماح للحشرات لتتغذى على النظام الغذائي المعني.
ملاحظة: يجب اعتبار هذا اليوم 0 من فحص التغذية. - سجل وزن جسم الحشرة ، والنظام الغذائي المعطى ، والنظام الغذائي غير المأكول ، والفراس في أيام بديلة (الأيام 2 و 4 و 6 و 8 و 10) حتى اليوم العاشر من الفحص.
- بعد اليوم 10 ، اجعلهم يتغذون على نظامهم الغذائي لمراقبة المزيد من التغييرات التنموية والمورفولوجية.
ملاحظة: التغيرات التنموية عن طريق: (1) وسيطة اليرقات ، مثل نصف الجسم الخلفي للشرانق مع بقع بشرة اليرقات ، كبسولة الرأس ، والساقين الصدرية. (2) الشرانق مع جسم أسود تماما ؛ (3) الشرانق صغيرة الحجم مع انكماش الجسم. (4) العثة العثة العذراء وسيطة مع جلد العذراء القديم. تشمل التغيرات المورفولوجية البالغين العثة المشوهة ذات الأجسام غير الطبيعية والأجنحة الملتوية والساقين المفصلية. ثم تتم مقارنة هذه التغييرات مع الحشرات التي تتغذى على النظام الغذائي السيطرة. - قم بتجميد الحشرات في اليوم 10 إذا لم تكن دراسة العيوب التنموية والمورفولوجية مطلوبة.
ملاحظة: قبل تجميد اليرقات ، يجب أن تبقى محرومة من النظام الغذائي لمدة 3 ساعات على الأقل لإزالة النظام الغذائي المتبقي من الجهاز الهضمي.
5. تسجيل البيانات وتحليلها
- في برنامج GraphPad Prism (انظر جدول المواد) ، اختر جدول بيانات XY من مربع الحوار "Welcome أو New Table" ، وفي ذلك أدخل عدد الحشرات التي تكرر القيم جنبا إلى جنب في الأعمدة الفرعية. بعد ذلك ، أعط اسم العنوان للمحور X كعدد من الأيام ، وفي المجموعتين A و B ، أعط اسم العنوان كعنصر تحكم وعلاج كيرسيتين ، على التوالي. ضع وزن الجسم لكل حشرة تحت السيطرة والعلاج لتوليد الرسم البياني لوزن الجسم.
ملاحظة: قد يختلف التحليل في GraphPad وفقا لحجم العينة وعدد العلاجات. - قارن وزن جسم الحشرة بين مجموعتي التحكم والعلاج باستخدام اختبار t للطالب (α = 0.05).
- عد اليرقات والشرانق الحية والميتة في اليوم 10 لرسم منحنى كابلان ماير لنسبة البقاء على قيد الحياة باستخدام برنامج الرسوم البيانية.
- احسب عدد الشرانق واحسب النسبة المئوية للتشرنق باستخدام الصيغة المحددة:
- النسبة المئوية للتشرنق (٪) = (عدد الشرانق المتكونة / العدد الإجمالي لليرقات) × 100
- قارن تطور اليرقات من حيث المؤشرات الغذائية23 باستخدام الصيغ التالية ، ECI (٪) = (زيادة وزن اليرقات / وزن العلف المأكول) × 100
تنمية الطفولة المبكرة (٪) = (زيادة وزن اليرقات / [وزن العلف المأكول - وزن الفراس]) × 100
AD (٪) = ([وزن العلف المأكول - وزن الفراس] / وزن العلف المأكول) × 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أظهرت يرقات الحشرات التي تغذت على نظام غذائي يحتوي على 1000 جزء في المليون كيرسيتين انخفاضا كبيرا في وزن الجسم بنسبة ~ 57٪ مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 2 أ). أدى انخفاض وزن الجسم إلى انخفاض حجم جسم اليرقات المعالجة بالكيرسيتين (الشكل 2 ب). لوحظ انخفاض ملحوظ في معدل تغذية اليرقات التي تتغذى على الكيرسيتين مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 2C).
أيضا ، أظهرت اليرقات التي تتغذى على كيرسيتين انخفاضا في معدل الجرو بنسبة ~ 14٪ وتأخر التشرد ، مما يشير إلى تأخر النمو عند العلاج (الشكل 3 أ ، ب). علاوة على ذلك ، لوحظ ~ 77.65٪ من الأنماط الظاهرية القاتلة والبقاء على قيد الحياة في يرقات الحشرات التي تتغذى على نظام غذائي يحتوي على كيرسيتين (الشكل 4 أ ، ب). تم حساب المعلمات التغذوية لليرقات المكافحة والكيرسيتين بناء على استهلاك الأغذية واستخدامها (الجدول التكميلي 1). تم تخفيض ECI لمادة الجسم و ECD للحشرات التي تتغذى على النظام الغذائي المحتوي على 1000 جزء في المليون من الكيرسيتين بنسبة ~ 9٪ و ~ 49٪ على التوالي. يمكن أن يكون الانخفاض في تنمية الطفولة المبكرة بسبب نقص المستقلبات المتاحة في جسم الحشرات20. تمت زيادة AD للحشرات التي تتغذى على الكيرسيتين بنسبة ~ 5٪ مقارنة بالمجموعة الضابطة (الجدول 2). بشكل عام ، تشير النتائج التي تم الحصول عليها إلى أن الكيرسيتين له آثار سلبية كبيرة على نمو الحشرات وتطور H. armigera.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لإعداد نظام غذائي اصطناعي ونظام غذائي يحتوي على كيرسيتين. يتم خلط الكسور A و B و C لعمل نظام غذائي اصطناعي يحتوي على كيرسيتين. يتم تغذية اليرقات على النظام الغذائي المعني لمدة 10 أيام. تمثل أسهم العملية الزرقاء نظاما غذائيا اصطناعيا ، بينما تمثل أسهم العملية الحمراء تحضير نظام غذائي يحتوي على كيرسيتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بيانات تمثيلية من مقايسة تغذية الكيرستين. (أ) الرسم البياني لوزن الجسم ليرقات H. armigera بعد تغذية 1000 جزء في المليون من الكيرسيتين مقارنة بالمجموعة الضابطة في الأيام 2 و 4 و 6 و 8 و 10. وزن الجسم من اليرقات في ملليغرام (ملغ). (ب) يسجل متوسط حجم اليرقات في اليوم 10. شريط المقياس = 1 سم. (C) متوسط معدل التغذية المسجل في الأيام 2 و 4 و 6 و 8 و 10. وزن العلف بالملليغرام (ملغ). تمثل الدوائر الزرقاء والمربعات الحمراء متوسط بيانات الحشرات الضابطة والحشرات المعالجة بالكيرسيتين في أيام بديلة ، على التوالي. يستخدم اختبار t للطالب للمقارنة بين المجموعتين (المقترنتين). تمثل البيانات متوسط ± SEM (n = 21 يرقات داخلية ثانية ؛ * p < 0.05 تشير إلى دلالة إحصائية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بيانات تمثيلية للتشرنق من مقايسة التغذية. (أ) النسبة المئوية للرسم البياني للتشرنق. (ب) صور الشرانق (اليوم 15) تظهر تأخر وانخفاض معدل التشرد في علاج الكيرسيتين. شريط المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: بيانات تمثيلية للبقاء على قيد الحياة في اليوم 10 عند تغذية 1000 جزء في المليون كيرسيتين مقارنة بالسيطرة. (أ) يشير الرسم البياني للبقاء على قيد الحياة كابلان ماير للحشرات التي تتغذى على الكيرسيتين إلى انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة. تظهر الحشرات الضابطة معدل بقاء ~ 96٪ ، وتظهر الحشرات المعالجة بالكيرسيتين بقاء ~ 77.65٪. (ب) صور للأنماط الظاهرية القاتلة لليرقات التي تتغذى على الكيرسيتين مأخوذة في اليوم 10. شريط المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| الكسر أ | ||
| 1 | غرام البنغال | ٥٠ غرام |
| 2 | مستخلص الخميرة | ١٢ غرام |
| 3 | الكازين | 3.5 غ |
| 4 | حمض السوربيك | 0.5 غ |
| 5 | ميثيل بارابين | 1 غرام |
| 6 | dH2O | 150 مل |
| الكسر ب | ||
| 1 | كلوريد الكولين | 0.35 غ |
| 2 | الستربتومايسين | 0.02 غ |
| 3 | حمض الاسكوربيك | 2 غرام |
| 4 | كولسترول | 0.15 غ |
| 5 | كبسولة متعددة الفيتامينات | 1 |
| 6 | كبسولة فيتامين ه | 1 |
| 7 | dH2O | 30 مل |
| الكسر ج | ||
| 1 | أجار أجار | 6.5 غ |
| 2 | dH2O | 180 مل |
الجدول 1: تكوين النظام الغذائي الاصطناعي.
| العلاج (تركيز كويرسينتين) | المؤشرات الغذائية (٪) | ||
| إي سي آي | تنمية الطفولة المبكرة | الاعلان | |
| 0 جزء في المليون | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 جزء في المليون | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
الجدول 2: تأثير ابتلاع الكيرسيتين على سلوك تغذية H. armigera والاستخدام الغذائي. الاختصارات: ECI = كفاءة تحويل الأغذية المبتلعة. ECD = كفاءة تحويل الأغذية المهضومة ؛ AD = الهضم التقريبي.
الجدول التكميلي 1: مثال على ورقة البيانات الخاصة بمقايسة تغذية الكيرستين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المقايسات الحيوية المختبرية مفيدة للتنبؤ بالنتائج وإنتاج بيانات سمية مقارنة على عدة مركبات في فترة قصيرة بتكلفة معقولة. تساعد المقايسة الحيوية للتغذية على تفسير التفاعلات بين المبيدات الحشرية والمبيدات الحشرية ومبيدات الحشرات النباتية. إنها طريقة فعالة لقياس سمية مجموعة متنوعة من المواد التي تبسط بشكل كبير عملية تحديد الجرعة المميتة 50 (LD50) أو التركيز المميت 50 (LC50) أو أي تركيز أو جرعة مميتة أخرى24,25. تستخدم المقايسات الحيوية المختبرية المختلفة لتحديد نشاط المبيدات الحشرية ، ومقاومة المبيدات الحشرية ، وسمية المركبات ، بما في ذلك تغطية النظام الغذائي ، والتطبيق الموضعي ، والتغذية الملزمة ، وطريقة الحقن ، والتلامس أو المتبقي ، وطريقة الفيلم13،14. يمكن استخدام كل هذه الطرق بناء على هدف دراسة معينة ، ولكن يجب أن يكون نهج الفحص الحيوي المثالي سريعا وفعالا26. ومن ثم ، فإن طريقة فحص التغذية الإلزامية التي تمت مناقشتها في هذه المخطوطة يمكن أن تكون المقايسة الحيوية المفضلة في عدة حالات ، باستثناء الحشرات الماصة.
يمكن استخدام مقايسة التغذية الإلزامية الموصوفة في هذه المخطوطة لدراسة تأثير أي مركب على نمو يرقات الحشرات وتطورها وتغذيتها وبقائها. في النتائج التمثيلية الموضحة هنا ، تم فحص نشاط المبيدات الحشرية للكيرسيتين ضد يرقات H. armigera ، مما يوفر أساسا منطقيا لمزيد من الاستكشاف. لوحظت انخفاضات كبيرة في وزن الجسم ~ 57٪ (الشكل 2 أ ، ب) ، وتغيرات في معدل التغذية (الشكل 2 ج) ، وانخفاض معدل البقاء على قيد الحياة ~ 18٪ (الشكل 4 أ ، ب) في اليرقات التي تتغذى على الكيرستين. أيضا ، أظهرت الحشرات التي تتغذى على نظام غذائي كيرسيتين تأخر وانخفاض التشرد بنسبة ~ 14 ٪ (الشكل 3 أ ، ب). كما لوحظ تغير كبير في المؤشرات التغذوية، بما في ذلك ECI و ECD و AD (الجدول 2)، مقارنة بالمجموعة الضابطة. بشكل عام ، تشير هذه النتائج إلى أن الكيرسيتين له تأثير ضار على نمو وتطور وبقاء يرقات H. armigera. تتبع كل هذه الملاحظات تأثير الكيرسيتين المضاد للبيوسيس على الزاعجة المصرية27 ، و Bactrocera cucurbitae Coquillett28 ، و Drosophila melanogaster29. علاوة على ذلك ، وجد أن هذه الملاحظات تتوافق مع زيادة الفتك في Bombyx mori بسبب ضعف الجهاز المناعي30 ، وانخفاض وزن اليرقات ، والخصوبة في Spodoptera litura31 و Hyphantria cunea12 و Eriosoma lanigerum32.
يعد اتخاذ الاحتياطات ، مثل التوحيد في حجم العينة ، أمرا بالغ الأهمية لتقليل التباين البيولوجي بين التجارب. لضمان التكاثر ، يجب إجراء فحص التغذية باستخدام يرقات الحشرات من نفس الطور في غرفة استزراع الحشرات في درجات حرارة ومستويات رطوبة ثابتة. أثناء إعداد نظام غذائي اصطناعي ، يجب التأكد من خلط المادة الكيميائية النباتية بشكل موحد مع النظام الغذائي. لتقليل الخطأ بسبب التدهور الكيميائي النباتي بمرور الوقت ، يفضل اتباع نظام غذائي طازج للفحص. يجب مراعاة خصائص المواد الكيميائية النباتية ، مثل الحساسية الحرارية ، وحساسية الضوء ، والذوبان ، وما إلى ذلك ، أثناء إعداد وتخزين النظام الغذائي الاصطناعي. قد يتغير لون الأنظمة الغذائية التي تم تجفيفها بمرور الوقت وتتقلص ، ولا ينبغي استخدامها في فحص التغذية. يجب عدم النظر في نتائج الفحص عندما تكون معدلات وفيات المجموعة الضابطة أكبر من 10٪ 33. يجب أن تكون المواد ، مثل الملعقة ، والأكواب ، وأطباق بتري ، وما إلى ذلك ، اللازمة لإعداد النظام الغذائي ووزن الحشرات منفصلة لمجموعات التحكم والعلاج لتجنب الأخطاء بسبب التلوث المتبادل.
المقايسة الحيوية لتغذية الحشرات محددة للغاية وقابلة للتكرار ، ولكن لها بعض القيود. على سبيل المثال ، عندما تهاجم حشرة نباتا ، تنتج مناعة النبات سمات هيكلية أو كيميائية لتقليل تغذية العاشبة وبالتالي تقليل تلف العاشبة34. ومع ذلك ، لا يتم ملاحظة هذه السمات الدفاعية وآثارها خلال هذا الفحص. قيد آخر هو أن التركيز المحدد للمواد الكيميائية النباتية التي تبتلعها الحشرات لا يمكن تحديده14. يعد استقرار المحتوى الغذائي للنظام الغذائي والمواد الكيميائية النباتية المستخدمة عاملا مقيدا رئيسيا يمكن أن يؤثر على تأثيره على الحشرات.
على الرغم من القيود المذكورة أعلاه ، فإن اختبار التغذية الإلزامي ميسور التكلفة ويمكنه اختبار عدد كبير من الحشرات في وقت واحد. أيضا ، يمكن تكييف هذا الفحص لفحص العديد من الجزيئات لدراسة خصائصها المضادة للتغذية والمبيدات الحشرية ضد فئات مختلفة من الحشرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يعلن أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تعترف SM و YP و VN بالزمالة التي تمنحها لجنة المنح الجامعية ، حكومة الهند ، نيودلهي. تعترف الملكية الأردنية بمجلس البحوث العلمية والصناعية (CSIR) ، الهند ، و CSIR-National Chemical Laboratory ، بيون ، الهند ، للدعم المالي بموجب رموز المشاريع MLP036626 و MLP101526 و YSA000826.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
- Popp, J., Pető, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2013).
- da Silva, F. R., et al. Comparative toxicity of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) to selected insecticides. Insects. 11 (7), 431 (2020).
- Usman, A., Ali, M. I., Shah, M., e Amin, F., Sarwar, J. Comparative efficacy of indigenous plant extracts and a synthetic insecticide for the management of tomato fruit worm (Helicoverpa armigera Hub.) and their effect on natural enemies in tomato crop. Pure and Applied Biology. 7 (3), 1014-1020 (2018).
- Honnakerappa, S. B., Udikeri, S. S. Abundance of Helicoverpa armigera (Hubner) on different host crops. Journal of Farm Science. 31, 436-439 (2018).
- Edosa, T. T. Review on bio-intensive management of African bollworm, Helicoverpa armigera (Hub.): Botanicals and semiochemicals perspectives. African Journal of Agricultural Research. 14 (1), 1-9 (2019).
- Zhou, Y., et al. Migratory Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) exhibits marked seasonal variation in morphology and fitness. Environmental Entomology. 48 (3), 755-763 (2019).
- Souto, A. L., et al. Plant-derived pesticides as an alternative to pest management and sustainable agricultural production: Prospects, applications and challenges. Molecules. 26 (16), 4835 (2021).
- Özkara, A., Akyıl, D., Konuk, M. Pesticides, environmental pollution, and health. Environmental Health Risk-Hazardous Factors to Living Species. , (2016).
- Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42 (2021).
- Tlak Gajger, I., Dar, S. A. Plant allelochemicals as sources of insecticides. Insects. 12 (3), 189 (2021).
- Riddick, E. W. Potential of quercetin to reduce herbivory without disrupting natural enemies and pollinators. Agriculture. 11 (6), 476 (2021).
- Gao, Y. -L., et al. The effect of quercetin on the growth, development, nutrition utilization, and detoxification enzymes in Hyphantria cunea Drury (Lepidoptera: Arctiidae). Forests. 13 (11), 1945 (2022).
- Durmuşoğlu, E., Hatipoğlu, A., Gürkan, M. O., Moores, G. Comparison of different bioassay methods for determining insecticide resistance in European Grapevine Moth, Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller) (Lepidoptera: Tortricidae). Turkish Journal of Entomology. 39 (3), 271-276 (2015).
- Paramasivam, M., Selvi, C. Laboratory bioassay methods to assess the insecticide toxicity against insect pests-A review. Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (3), 1441-1445 (2017).
- Clark, E. L., Isitt, R., Plettner, E., Fields, P. G., Huber, D. P. W. An inexpensive feeding bioassay technique for stored-product insects. Journal of Economic Entomology. 107 (1), 455-461 (2014).
- Waldbauer, G. P., Cohen, R. W., Friedman, S. An improved procedure for laboratory rearing of the corn earworm, Heliothis zea (Lepidoptera: Noctuidae). The Great Lakes Entomologist. 17 (2), 10 (2017).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Laboratory rearing of stable flies and other muscoid Diptera. JoVE. (138), e57341 (2018).
- Zheng, M. -L., Zhang, D. -J., Damiens, D. D., Lees, R. S., Gilles, J. R. L. Standard operating procedures for standardized mass rearing of the dengue and chikungunya vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)-II-Egg storage and hatching. Parasites & Vectors. 8, 1-7 (2015).
- Nagarkatti, S., Prakash, S. Rearing Heliothis armigera (Hubn.) on an artificial diet. Technical Bulletin Commonwealth Institute of Biological Control. , (1974).
- Adhav, A. S., Kokane, S. R., Joshi, R. S. Functional characterization of Helicoverpa armigera trehalase and investigation of physiological effects caused due to its inhibition by Validamycin A formulation. International Journal of Biological Macromolecules. 112, 638-647 (2018).
- Abbasi, B. H., et al. Rearing the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, on a tapioca-based artificial diet. Journal of Insect Science. 7 (1), 35 (2007).
- Armes, N. J., Jadhav, D. R., Bond, G. S., King, A. B. S. Insecticide resistance in Helicoverpa armigera in South India. Pesticide Science. 34 (4), 355-364 (1992).
- Waldbauer, G. P. The consumption and utilization of food by insects. Advances in Insect Physiology. 5, Academic Press. 229-288 (1968).
- Carpinella, M. C., Defago, M. T., Valladares, G., Palacios, S. M. Antifeedant and insecticide properties of a limonoid from Melia azedarach (Meliaceae) with potential use for pest management. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (2), 369-374 (2003).
- Diaz Napal, G. N., Palacios, S. M. Bioinsecticidal effect of the flavonoids pinocembrin and quercetin against Spodoptera frugiperda. Journal of Pest Science. 88, 629-635 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , 4-38 (1990).
- Gikonyo, N. K., Mwangi, R. W., Midiwo, J. O. Toxicity and growth-inhibitory activity of Polygonum senegalense (Meissn.) surface exudate against Aedes aegypti larvae. International Journal of Tropical Insect Science. 18 (3), 229-234 (1998).
- Sharma, R., Sohal, S. K. Bioefficacy of quercetin against melon fruit fly. Bulletin of Insectology. 66 (1), 79-83 (2013).
- Després, L., David, J. -P., Gallet, C. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 298-307 (2007).
- Shi, G., Kang, Z., Ren, F., Zhou, Y., Guo, P. Effects of quercetin on the growth and expression of immune-pathway-related genes in silkworm (Lepidoptera: Bombycidae). Journal of Insect Science. 20 (6), 23 (2020).
- Selin-Rani, S., et al. Toxicity and physiological effect of quercetin on generalist herbivore, Spodoptera litura Fab. and a non-target earthworm Eisenia fetida Savigny. Chemosphere. 165, 257-267 (2016).
- Ateyyat, M., Abu-Romman, S., Abu-Darwish, M., Ghabeish, I. Impact of flavonoids against woolly apple aphid, Eriosoma lanigerum (Hausmann) and its sole parasitoid, Aphelinus mali (Hald). Journal of Agricultural Science. 4 (2), 227 (2012).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. JoVE. (144), e57768 (2019).
- Mitchell, C., Brennan, R. M., Graham, J., Karley, A. J. Plant defense against herbivorous pests: exploiting resistance and tolerance traits for sustainable crop protection. Frontiers in Plant Science. 7, 1132 (2016).
