Summary
このプロトコルは鱗翅目の昆虫の幼虫に対するphytochemicalの潜在的に有毒な効果を評価するために義務的な供給の試金を記述する。これは、亜致死量および致死量、抑止活性、および生理学的効果の最適化が容易な、拡張性の高い昆虫バイオアッセイです。これは、環境に優しい殺虫剤のスクリーニングに使用できます。
Abstract
鱗翅目の昆虫であるHelicoverpa armigeraは、世界中に分布する多食性の害虫です。この草食性昆虫は、植物や農業の生産性を脅かす存在です。これに反応して、植物は昆虫の成長と生存に悪影響を与えるいくつかの植物化学物質を産生します。このプロトコルは昆虫の成長、開発および存続に対するphytochemical (quercetin)の効果を評価する義務的な供給の試金方法を示す。管理された条件下で、新生児は事前に定義された人工飼料で2番目の星齢まで維持されました。これらの2齢幼虫は、対照群とケルセチンを含む人工食を10日間摂食させました。昆虫の体重、発生段階、フラス重量、死亡率を隔日で記録しました。体重の変化、摂食パターンの違い、および発生表現型は、アッセイ時間全体を通じて評価されました。 記載の義務的摂食アッセイは、自然な摂取様式をシミュレートし、多数の昆虫にスケールアップすることができる。これにより、H. armigeraの成長動態、発生遷移、および全体的な適応度に対するファイトケミカルの影響を分析できます。さらに、このセットアップは、栄養パラメータや消化生理学的プロセスの変化を評価するためにも利用できます。本稿では、毒物学的研究、殺虫分子スクリーニング、植物と昆虫の相互作用における化学的影響の理解に応用できる可能性のある給餌アッセイシステムの詳細な方法論を提供します。
Introduction
作物の生産性に影響を与える生物的要因は、主に病原体と害虫です。いくつかの害虫は、農作物の損失の15%から35%を引き起こし、経済的持続可能性の実践に影響を与えます1。鞘翅目、半翅目、鱗翅目に属する昆虫は、壊滅的な害虫の主要な目です。環境の適応性が高いため、鱗翅目類はいくつかの生存メカニズムを進化させるのに役立っています。鱗翅目昆虫の中で、Helicoverpa armigera(ワタボリムシ)は約180種類の作物を食べ、生殖組織に重大な損傷を与える可能性があります2。世界全体では、H. armigeraの蔓延により、約50億ドルの損失が発生しています3。綿、ひよこ豆、ハトマメ、トマト、ヒマワリ、その他の作物は、H. armigeraの宿主です。宿主植物のさまざまな部分でライフサイクルを完了します。雌の蛾が産んだ卵は葉の上で孵化し、幼虫期に栄養組織を食べます。幼虫期は、その貪欲で適応性の高い性質のために最も破壊的です4,5。H. armigeraは、多食性、優れた移動能力、より高い繁殖力、強い休眠、既存の昆虫防除戦略に対する抵抗性の出現などの顕著な特性により、世界的な分布と新しい領域への侵入を示しています6。
テルペン、フラボノイド、アルカロイド、ポリフェノール、シアン化グルコシドなど、さまざまな化学分子が、H. armigeraの蔓延の防除に広く用いられている7。しかし、化学分子の頻繁な適用は、それらの残留物の獲得により、環境および人間の健康に悪影響を及ぼします。また、それらはさまざまな害虫捕食者に有害な影響を及ぼし、生態学的不均衡をもたらします8,9。したがって、害虫駆除の化学分子の安全で環境に優しいオプションを調査する必要があります。
植物が産生する天然の殺虫分子(ファイトケミカル)は、化学農薬の有望な代替品として使用できます。これらの植物化学物質には、アルカロイド、テルペノイド、およびフェノールのクラスに属するさまざまな二次代謝産物が含まれます7,10。ケルセチンは、さまざまな穀物、野菜、果物、葉に含まれる最も豊富なフラボノイド(フェノール化合物)の1つです。昆虫に対する摂食抑止力と殺虫活性を示します。また、害虫の天敵にも害はありません11,12。従って、このプロトコルはH. armigeraに対する毒性効果を評価するのにケルセチンを使用して供給の試金を示す。
昆虫の摂食、成長、発達、および行動パターンに対する天然および合成分子の影響を評価するために、さまざまなバイオアッセイ法が開発されています13。一般的に使用される方法には、リーフディスクアッセイ、選択給餌アッセイ、液滴給餌アッセイ、接触アッセイ、ダイエットカバーアッセイ、および義務給餌アッセイが含まれます13,14。これらの方法は、殺虫剤が昆虫にどのように適用されるかに基づいて分類されます。義務的摂食アッセイは、殺虫剤とその致死量14をテストするために最も一般的に使用される、感度が高く、シンプルで適応性の高い方法の1つです。義務的な摂食アッセイでは、目的の分子を人工飼料と混合します。これにより、食事組成の一貫性と制御が可能になり、堅牢で再現性のある結果が得られます。摂食アッセイに影響を与える重要な変数は、昆虫の発生段階、殺虫剤の選択、環境要因、およびサンプルサイズです。アッセイの期間、2つのデータ記録の間隔、給餌の頻度と量、昆虫の健康状態、およびオペレーターの取り扱いスキルも、給餌アッセイの結果に影響を与える可能性があります14,15。
この研究は、ケルセチンが H. armigera の生存と適応度に及ぼす影響を評価するための義務的な摂食アッセイを実証することを目的としています。昆虫の体重、死亡率、発達障害などのさまざまなパラメータを評価することで、ケルセチンの殺虫効果に関する洞察が得られます。一方、摂取食品の変換効率(ECI)、消化食品の変換効率(ECD)、おおよその消化率(AD)などの栄養パラメータを測定することで、ケルセチンの抗摂食特性が浮き彫りになります。
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Protocol
H. armigera の幼虫は、インドのバンガロールにあるICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources(NBAIR)から入手しました。本研究では、合計21匹の2齢幼虫を使用しました。
1. ひよこ豆ベースの人工飼料の調製
注:人工飼料の調製に必要な成分のリストを 表1に示します。
- 表1に示すように、すべてのフラクションをビーカーで個別に秤量し、スパチュラ/マグネチックスターラーを使用して均質な混合物を調製します。
- フラクションCを電子レンジで約100°Cで5分間茹で、フラクションAに加え、よく混ぜる。
- 十分に混合した後、混合画分を少し冷ましてから、画分Bを加えます(画分Bには熱に弱い成分が含まれています)。
- 透明なポリスチレン製、150 mm x 150 mmのシャーレに注ぎます。
2.ケルセチン含有人工飼料の調製
- ケルセチン水和物( 材料表参照)を適量(1,000ppm)秤量し、エタノール(2 mg/mL)、ジメチルスルホキシド(DMSO;30 mg/mL)、ジメチルホルムアミド(DMF)などの有機溶媒に適切に溶解します。ここで、ケルセチンを溶解するためにDMSOが用いられる。
- 溶解したケルセチンをフラクションBに加え、続いてフラクションAとフラクションCの混合物に添加します(フラクションBから還元された水の量は、添加されたDMSOの量に等しくなります)。
- ケルセチンの溶解に使用した同量の有機溶媒を対照食に加えます。
注: 図1 は、人工飼料およびケルセチン含有飼料の調製を概略的に示しています。
3. ホモ・アルミゲラの養殖と維持
注意: 昆虫の飼育とメンテナンスには、適切に洗浄および滅菌された材料を使用してください。昆虫は、すべての無菌性および安全関連の標準操作慣行16、17、18に従って慎重に取り扱ってください。
- H. armigeraの卵は、ステップ3.3で説明したように、飼育室(モスリンの布で覆われたプラスチック製の瓶)に維持された状態で保管します。次に、新しく生まれた新生児を、細い絵筆を使って、作りたてのひよこ豆ベースの人工飼料に優しく移します。
- 幼虫の飼育には人工飼料を使用し、成虫には1%(w / v)のマルチビタミン(材料表を参照)を含む20%(w / v)のスクロース溶液を使用します19,20。
注: H. armigera の3齢齢幼虫は共食い傾向を示すため、各幼虫を別々のバイアルで飼育する必要があります。 - 昆虫培養室の温度を25±1°C、相対湿度を70%に維持し、16時間の光:8時間の暗長21とする。
- 実験室で1世代の昆虫を飼育して均質性を確保し、摂食アッセイに使用します。
- 必要に応じて、昆虫培養室の温度を28°Cに上げて、幼虫と蛹の成長を早めます22。
4. 給餌アッセイのセットアップ
- 各セット(コントロールと処理)で21秒の幼虫を収集し、約1〜3時間、食事から遠ざけます。
- 対照飼料とケルセチン含有飼料を細かく切り、与えた飼料の重量と昆虫の体を記録し、昆虫を培養バイアルに慎重に移します。昆虫がそれぞれの食事を食べるのを許します。
注:これは、摂食アッセイの0日目と見なす必要があります。 - 昆虫の体の体重、与えられた食事、食べていない食事、およびアッセイの10日目までの隔日(2、4、6、8、および10日目)のフラスを記録します。
- 10日目以降は、それぞれの餌を食べさせて、さらなる発達的および形態学的変化を観察します。
注:(1)幼虫のクチクラパッチ、頭嚢、胸脚を備えた蛹の後半身などの幼虫-蛹の中間体。(2)完全に黒くなった体を持つ前蛹。(3)体が収縮した小さめの蛹。(4)蛹-蛾-古い蛹の皮を持つ中間蛾。形態学的変化には、異常な体、ねじれた翼、および関節のある脚を持つ奇形の蛾の成虫が含まれます。次に、これらの変化を対照食で与えられた昆虫と比較します。 - 発生的および形態学的欠陥の研究が必要ない場合は、10日目に昆虫を凍結します。
注:幼虫を冷凍する前に、消化管から残留飼料を取り除くために、少なくとも3時間食事を奪われたままにしておく必要があります。
5. データの記録と分析
- GraphPad Prismソフトウェア( 材料表を参照)で、「ようこそまたは新しいテーブル」ダイアログから XY データテーブルを選択し、そのサブ列に並んで複製する 昆虫の数 を入力します。次に、X軸にタイトル名を 日数として付け、グループAとグループBで、それぞれ コントロール と ケルセチン処理としてタイトル名を付けます。各昆虫の体重を管理して処理し、体重グラフを生成します。
注:GraphPadでの分析は、サンプルサイズと処理回数によって異なる場合があります。 - スチューデントのt検定(α = 0.05)を使用して、対照群と治療群の間で昆虫の体重を比較します。
- 10日目に生きている幼虫と死んだ幼虫と蛹を数え、グラフ作成ソフトウェアを使用して生存率のカプランマイヤー曲線をプロットします。
- 蛹の数を数え、与えられた式を使用して蛹化の割合を計算します。
- 蛹化率(%)=(形成された蛹の数/幼虫の総数)x 100
- ECI(%)=(幼虫の体重増加/食べた飼料の重量)×100の計算式を用いて、栄養指数23の観点から幼虫の発育を比較する
ECD(%)=(幼虫の体重増加/[食べた飼料の重量-フラスの重量])x 100
AD (%) = ([食べた飼料の重量 - フラスの重量]/食べた飼料の重量) x 100
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Representative Results
1,000 ppmのケルセチンを含む飼料を与えた昆虫の幼虫は、対照群と比較して体重が~57%の有意な減少を示しました(図2A)。体重の減少により、ケルセチン処理された幼虫の体のサイズが小さくなりました(図2B)。対照群と比較して、ケルセチンを給餌した幼虫の摂食速度に顕著な低下が観察されました(図2C)。
また、ケルセチンを与えられた幼虫は、蛹化率が~14%低下し、蛹化が遅れたことから、治療後の発育遅延が示唆されました(図3A、B)。さらに、生存率と致死率の表現型の~77.65%が、ケルセチン含有食餌を与えられた昆虫の幼虫で観察されました(図4A、B)。対照幼虫とケルセチン給餌幼虫の栄養パラメータは、食物の消費と利用に基づいて計算した(付表1)。1,000ppmのケルセチン含有食餌を与えられた昆虫の体内へのECIとECDは、それぞれ~9%と~49%減少しました。ECDの減少は、昆虫体20における利用可能な代謝産物の欠乏によるものであり得る。ケルセチンを与えられた昆虫のADは、対照群と比較して~5%増加しました(表2)。全体として、得られた結果は、ケルセチンが昆虫の成長とH.armigeraの発達に有意な悪影響を与えることを示しています。
図1:人工飼料およびケルセチン含有飼料の調製を模式化した図。 画分A、B、Cを混合して、ケルセチンを含む人工飼料を作ります。幼虫はそれぞれの餌を10日間与えられます。青色のプロセス矢印は人工飼料を表し、赤色のプロセス矢印はケルセチン含有飼料の調製を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ケルセチン給餌アッセイの代表的なデータ。 (A)1,000ppmのケルセチンを摂食した後の H. armigera 幼虫の体重グラフを、対照群の2、4、6、8、10日目と比較した。幼虫の体重はミリグラム(mg)です。(B)幼虫の平均サイズは10日目に記録されています。スケールバー= 1 cm。 (C)2、4、6、8、および10日目に記録された平均摂食速度。飼料の重量はミリグラム(mg)単位です。青丸と赤四角は、対照群とケルセチン処理した昆虫の隔日の平均データです。スチューデントのt検定は、2つのグループ(対応のあるグループ)の比較に使用されます。データはSEM±平均値(n = 21齢幼虫、*p < 0.05は統計的に有意)である。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:摂食アッセイからの蛹化の代表的なデータ。 (A)蛹化率グラフ。(B)ケルセチン治療における蛹化率の遅延と低下を示す蛹の画像(15日目)。スケールバー = 1 cm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:対照と比較した1,000ppmのケルセチンの給餌10日目の生存率の代表的なデータ。 (A)ケルセチンを与えられた昆虫のKaplan-Meier生存グラフは、生存率の低下を示しています。対照昆虫は~96%の生存率を示し、ケルセチン処理昆虫は~77.65%の生存率を示します。(B)10日目に撮影されたケルセチン給餌幼虫の致死表現型の画像。スケールバー = 1 cm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| フラクションA | ||
| 1 | ベンガルグラム | 50グラム |
| 2 | 酵母エキス | 12グラム |
| 3 | カゼイン | 3.5グラム |
| 4 | ソルビン酸 | 0.5グラム |
| 5 | メチルパラベン | 1グラム |
| 6 | dH2O | 150 mLの |
| フラクションB | ||
| 1 | 塩化コリン | 0.35グラム |
| 2 | ストレプトマイシン | 0.02グラム |
| 3 | アスコルビン酸 | 2グラム |
| 4 | コレステロール | 0.15グラム |
| 5 | マルチビタミンカプセル | 1 |
| 6 | ビタミンEカプセル | 1 |
| 7 | dH2O | 30 mLの |
| フラクションC | ||
| 1 | 寒天 寒天 | 6.5グラム |
| 2 | dH2O | 180 mLの |
表1:人工飼料の組成。
| 治療(ケルセンチン濃度) | 栄養指数(%) | ||
| ECIの | ECDの | 広告 | |
| 0 ppmの | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 ppmの | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
表2:ケルセチン摂取が H. armigera の摂食行動と食事利用に及ぼす影響。 略語:ECI =摂取された食品の変換効率。ECD = 消化された食物の変換効率。AD = おおよその消化率。
補足表1:ケルセチン供給アッセイのデータシートの例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ラボ用バイオアッセイは、結果を予測し、複数の化合物について、短期間で妥当なコストで比較毒性データを作成するのに役立ちます。摂食バイオアッセイは、昆虫-殺虫剤と昆虫-植物-殺虫剤の間の相互作用を解釈するのに役立ちます。これは、致死量50(LD50)、致死濃度50(LC50)、またはその他の致死濃度または用量24,25を確立するプロセスを大幅に簡素化する、さまざまな物質の毒性を測定するための効率的な方法です。様々な実験室用バイオアッセイが、殺虫活性、殺虫剤耐性、および化合物の毒性を決定するために使用され、これには、食事被覆、局所適用、義務的給餌、注射法、接触または残留物、およびフィルム法が含まれる13,14。これらの方法はすべて、特定の研究の目的に基づいて使用できますが、理想的なバイオアッセイアプローチは迅速かつ効果的である必要があります26。したがって、この原稿で議論されている義務的な摂食アッセイ法は、昆虫を吸うことを除いて、いくつかの例で選択されるバイオアッセイになり得ます。
この原稿に記載されている義務的摂食アッセイは、昆虫の幼虫の成長、発達、摂食、および生存に対する任意の化合物の影響を研究するために使用できます。ここに示した代表的な結果では、ケルセチンの殺虫活性がH. armigeraの幼虫に対して調べられ、さらなる研究の根拠が得られました。ケルセチンを与えられた幼虫では、体重が~57%(図2A、B)、摂食率の変化(図2C)、生存率が~18%低下(図4A、B)の有意な減少が観察されました。また、ケルセチン食を与えられた昆虫は、蛹化が遅れ、~14%減少しました(図3A、B)。また、対照群と比較して、ECI、ECD、ADなどの栄養指標にも有意な変化が見られました(表2)。全体として、これらの結果は、ケルセチンがH. armigera幼虫の成長、発達、生存に有害な影響を与えることを示しています。これらの観察結果はすべて、ネッタイシマカ27、Bactrocera cucurbitae Coquillett28、およびショウジョウバエ29に対するケルセチンの抗生物質効果に続くものです。さらに、これらの観察結果は、免疫系の障害30、幼虫の体重の減少、およびSpodoptera litura31、Hyphantria cunea12およびEriosoma lanigerum32の繁殖力によるBombyx moriの致死率の増加と一致していることがわかった。
サンプルサイズの均一性などの予防策を講じることは、実験間の生物学的ばらつきを減らすために重要です。再現性を確保するために、摂食アッセイは、同じ星の昆虫幼虫を使用して、一定の温度と湿度レベルの昆虫培養室で実施する必要があります。人工飼料を準備する際には、植物化学物質が食事と均一に混合されていることを確認する必要があります。経時的なファイトケミカル分解による誤差を最小限に抑えるために、アッセイには作りたての飼料が望ましいです。熱感受性、光感受性、溶解性などのファイトケミカルの特性は、人工飼料を調製および保管する際に考慮する必要があります。時間の経過とともに乾燥した飼料は、色が変化して縮む可能性があるため、給餌アッセイに利用しないでください。対照の死亡率が10%を超える場合は、アッセイ結果を考慮しないでください33。ヘラ、ビーカー、ペトリ皿など、食事の準備や昆虫の計量に必要な材料は、クロスコンタミネーションによるエラーを避けるために、対照群と治療群で分離する必要があります。
昆虫食バイオアッセイは特異性と再現性が高いが、いくつかの限界がある。例えば、昆虫が植物を攻撃すると、植物免疫は、草食動物の摂食を減らし、それによって草食動物の被害を最小限に抑えるための構造的または化学的形質を生み出す34。しかし、これらの防御的形質およびそれらの効果は、このアッセイでは観察されない。もう一つの限界は、昆虫が摂取する植物化学物質の明確な濃度を決定することができないことである14。食事と使用されるファイトケミカルの栄養成分の安定性は、昆虫への影響に影響を与える可能性のある主要な制限要因です。
上記の制限にもかかわらず、義務的摂食アッセイは手頃な価格であり、多数の昆虫を同時に試験することができます。また、このアッセイは、複数の分子をスクリーニングして、さまざまなクラスの昆虫に対する抗摂食剤および殺虫特性を研究するために適合させることができます。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言した。
Acknowledgments
SM、YP、およびVNは、ニューデリーのインド政府にある大学助成委員会によって授与されたフェローシップを認めています。RJは、プロジェクトコードMLP036626、MLP101526、およびYSA000826に基づく財政支援について、インドの科学産業研究評議会(CSIR)およびインドのプネーにあるCSIR-National Chemical Laboratoryに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
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