Summary
Detta protokoll beskriver den obligatoriska utfodringsanalysen för att utvärdera den potentiellt toxiska effekten av en fytokemikalie på fjärilsarternas insektslarver. Detta är en mycket skalbar insektsbioassay, lätt att optimera den subletala och dödliga dosen, avskräckande aktivitet och fysiologisk effekt. Detta skulle kunna användas för att screena miljövänliga insekticider.
Abstract
Helicoverpa armigera, en fjärilsinsekt, är en polyfag skadegörare med en världsomspännande utbredning. Denna växtätande insekt är ett hot mot växter och jordbrukets produktivitet. Som svar producerar växter flera fytokemikalier som påverkar insektens tillväxt och överlevnad negativt. Detta protokoll demonstrerar en obligatorisk utfodringsanalysmetod för att utvärdera effekten av en fytokemikalie (quercetin) på insekters tillväxt, utveckling och överlevnad. Under kontrollerade förhållanden hölls de nyfödda kvar fram till den andra stjärnan på en fördefinierad konstgjord diet. Dessa andrastjärnlarver fick livnära sig på en kontroll- och quercetininnehållande konstgjord diet i 10 dagar. Insekternas kroppsvikt, utvecklingsstadium, frassvikt och dödlighet registrerades varannan dag. Förändringen i kroppsvikt, skillnaden i utfodringsmönster och utvecklingsfenotyper utvärderades under hela analystiden. Den beskrivna obligatoriska utfodringsmetoden simulerar ett naturligt intagssätt och kan skalas upp till ett stort antal insekter. Det gör det möjligt att analysera fytokemikaliernas effekt på tillväxtdynamiken, utvecklingsövergången och den övergripande konditionen hos H. armigera. Dessutom kan denna inställning också användas för att utvärdera förändringar i näringsparametrar och matsmältningsfysiologiska processer. Den här artikeln ger en detaljerad metodik för utfodringsanalyssystem, som kan ha tillämpningar i toxikologiska studier, screening av insekticida molekyler och förståelse av kemiska effekter i växt-insektsinteraktioner.
Introduction
De biotiska faktorer som påverkar grödans produktivitet är främst patogener och skadegörare. Flera skadeinsekter orsakar 15–35 % av förlusten av jordbruksgrödor och påverkar den ekonomiska hållbarheten1. Insekter som tillhör ordningarna Coleoptera, Hemiptera och Lepidoptera är de största ordningarna av förödande skadedjur. Miljöns mycket anpassningsbara natur har gynnat fjärilar i utvecklingen av flera överlevnadsmekanismer. Bland fjärilsinsekter kan Helicoverpa armigera (bomullsbollmask) livnära sig på cirka 180 olika grödor och orsaka betydande skador på deras reproduktiva vävnader. Över hela världen har angrepp av H. armigera resulterat i en förlust på cirka 5 miljarder dollar3. Bomull, kikärter, duvärter, tomater, solrosor och andra grödor är värdar för H. armigera. Den fullbordar sin livscykel på olika delar av värdväxter. Ägg som läggs av kvinnliga malar kläcks på bladen, följt av att de livnär sig på vegetativa vävnader under larvstadiet. Larvstadiet är det mest destruktiva på grund av dess glupska och mycket anpassningsbara natur 4,5. H. armigera visar en global utbredning och intrång i nya territorier på grund av dess anmärkningsvärda egenskaper, såsom polyfagi, utmärkt migrationsförmåga, högre fruktsamhet, stark diapaus och uppkomsten av resistens mot befintliga insektsbekämpningsstrategier6.
Olika kemiska molekyler från terpener, flavonoider, alkaloider, polyfenoler, cyanogena glukosider och många andra används i stor utsträckning för kontroll av H. armigera-angrepp 7. Frekvent applicering av kemiska molekyler ger dock negativa effekter på miljön och människors hälsa på grund av förvärvet av deras rester. De visar också en skadlig effekt på olika skadedjurspredatorer, vilket resulterar i en ekologisk obalans 8,9. Därför finns det ett behov av att undersöka säkra och miljövänliga alternativ för kemiska molekyler för skadedjursbekämpning.
Naturliga insekticidmolekyler som produceras av växter (fytokemikalier) kan användas som ett lovande alternativ till kemiska bekämpningsmedel. Dessa fytokemikalier omfattar olika sekundära metaboliter som tillhör klasserna alkaloider, terpenoider och fenoler 7,10. Quercetin är en av de vanligaste flavonoiderna (fenolförening) som finns i olika spannmål, grönsaker, frukter och blad. Den visar utfodring avskräckande och insekticid aktivitet mot insekter; Det är inte heller skadligt för naturliga fiender till skadedjur11,12. Således demonstrerar detta protokoll utfodringsanalysen med quercetin för att bedöma dess toxiska effekt på H. armigera.
Olika bioanalysmetoder har utvecklats för att utvärdera effekten av naturliga och syntetiska molekyler på en insekts födointag, tillväxt, utveckling och beteendemönster13. Vanligt använda metoder inkluderar bladskivanalys, val matningsanalys, droppmatningsanalys, kontaktanalys, diettäckande analys och obligatorisk matningsanalys13,14. Dessa metoder klassificeras utifrån hur bekämpningsmedel appliceras på insekter. Den obligatoriska utfodringsanalysen är en av de vanligaste, känsliga, enkla och anpassningsbara metoderna för att testa troliga insekticider och deras dödliga dos14. I en obligatorisk utfodringsanalys blandas molekylen av intresse med en konstgjord diet. Detta ger konsekvens och kontroll över kostsammansättningen, vilket genererar robusta och reproducerbara resultat. Viktiga variabler som påverkar utfodringsanalyser är insektens utvecklingsstadium, val av insektsmedel, miljöfaktorer och provstorlek. Analysens varaktighet, intervallet mellan två dataregistreringar, frekvens och mängd av utfodring, insekternas hälsa och operatörernas hanteringsförmåga kan också påverka resultatet av utfodringsanalyser14,15.
Denna studie syftar till att demonstrera den obligatoriska utfodringsanalysen för att utvärdera effekten av quercetin på H. armigera överlevnad och fitness. Bedömning av olika parametrar, såsom insekters kroppsvikt, dödlighet och utvecklingsdefekter, kommer att ge insikter om de insekticida effekterna av quercetin. Samtidigt kommer mätning av näringsparametrar, inklusive effektiviteten av omvandling av intagen mat (ECI), effektiviteten av omvandling av smält mat (ECD) och ungefärlig smältbarhet (AD), att belysa quercetins antifeedantegenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
H. armigera-larver förvärvades från ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), Bangalore, Indien. Totalt användes 21 andra stjärnlarver för den aktuella studien.
1. Beredning av kikärtbaserad konstgjord kost
OBS: En lista över ingredienser som krävs för att förbereda en konstgjord diet nämns i tabell 1.
- Väg alla fraktioner separat i en bägare, enligt förteckningen i tabell 1, och bered en homogen blandning med hjälp av en spatel/magnetomrörare.
- Koka fraktion C vid cirka 100 °C i mikrovågsugn i 5 minuter, tillsätt fraktion A och blanda ordentligt.
- Efter noggrann blandning, låt den blandade fraktionen svalna lite innan du tillsätter fraktion B (fraktion B innehåller värmelabila komponenter).
- Häll i en genomskinlig petriskål av polystyren 150 mm x 150 mm.
2. Beredning av konstgjord diet som innehåller quercetin
- Väg upp lämplig mängd (1 000 ppm) quercetinhydrat (se materialtabell) och lös upp den ordentligt i minsta volym organiska lösningsmedel, såsom etanol (2 mg/ml), dimetylsulfoxid (DMSO; 30 mg/ml) eller dimetylformamid (DMF). Här används DMSO för att lösa upp quercetin.
- Tillsätt upplöst quercetin i fraktion B, följt av tillsats i blandningen av fraktionerna A och C (volymen vatten reducerad från fraktion B är lika med volymen tillsatt DMSO).
- Tillsätt en lika stor volym organiskt lösningsmedel som används för att lösa quercetin i kontrollfodret.
OBS: Figur 1 visar den schematiska representationen av beredning av konstgjorda och quercetininnehållande dieter.
3. Uppfödning och skötsel av H. armigera-kulturen
OBS: Använd lämpligt rengjorda och steriliserade material för insektsuppfödning och underhåll. Hantera insekterna varsamt genom att följa alla sterilitets- och säkerhetsrelaterade standardrutiner 16,17,18.
- Förvara H. armigera-ägg i avelskammaren (plastburk täckt med muslintyg) under bibehållna förhållanden, enligt beskrivningen i steg 3.3. Överför sedan försiktigt nykläckta nyfödda med en fin pensel på en nylagad kikärtsbaserad konstgjord diet.
- Använd ett konstgjort foder för att föda upp larverna och 20 % (vikt/volym) sackaroslösning med 1 % (vikt/volym) multivitamin (se materialförteckning) för vuxna malar19,20.
OBS: Eftersom tredje och äldre larver av H. armigera visar en kannibalistisk tendens, är det nödvändigt att föda upp varje larv i en separat injektionsflaska. - Håll temperaturen på 25 ± 1 °C och den relativa luftfuktigheten på 70 % i insektsodlingsrummet, med 16 timmars ljus:8 timmars mörk fotoperiod21.
- Föd upp en generation insekter i laboratoriet för homogenitet och använd den sedan för utfodringsanalys.
- Alternativt kan du öka temperaturen i insektsodlingsrummet till 28 °C för att påskynda tillväxten av larver och puppor22.
4. Inställning för matningsanalys
- Samla in 21 andra stjärnlarver för varje uppsättning (kontroll och behandling) och håll dem borta från kosten, i cirka 1-3 timmar.
- Skär kontroll- och quercetinhaltigt foder i små bitar, anteckna vikten av den givna kosten och insektens kropp och överför försiktigt insekterna till odlingsflaskor. Låt insekterna livnära sig på respektive diet.
OBS: Detta bör betraktas som dag 0 av utfodringsanalysen. - Anteckna insektskroppens vikt, given diet, oäten kost och frass varannan dag (dag 2, 4, 6, 8 och 10) fram till den 10:e dagen av analysen.
- Efter dag 10 ska du låta dem äta sin respektive kost för att observera ytterligare utvecklingsmässiga och morfologiska förändringar.
OBS: Utvecklingsförändringarna med hjälp av: (1) larv-pupp-intermediärer, såsom den bakre halvkroppen av puppor med larvfläckar på kutikulan, en huvudkapsel och bröstben; 2. Förpuppor med helt svärtad kropp. (3) underdimensionerade puppor med krympande kropp; (4) Puppmal intermediärer med den gamla pupphuden. Morfologiska förändringar inkluderar missbildade vuxna nattfjärilar med onormala kroppar, vridna vingar och ledade ben. Dessa förändringar jämförs sedan med insekter som utfodras med kontrolldieten. - Frys insekterna på dag 10 om det inte är nödvändigt att studera utvecklings- och morfologiska defekter.
OBS: Innan larverna fryses in måste de hållas berövade kosten i minst 3 timmar för att ta bort kvarvarande kost från matsmältningskanalen.
5. Registrering och analys av data
- I programvaran GraphPad Prism (se Materialförteckning), välj en XY-datatabell från dialogrutan "Välkommen eller Ny tabell" och ange i den antalet insekter som replikerar värden sida vid sida i underkolumnerna. Ge sedan titelnamnet till X-axeln som antal dagar, och i grupperna A och B anger du titelnamnet som kontroll respektive quercetinbehandling. Sätt kroppsvikten för varje insekt under kontroll och behandling för att generera kroppsviktsgrafen.
OBS: Analys i GraphPad kan variera beroende på provstorlek och antal behandlingar. - Jämför insektens kroppsvikt mellan kontroll- och behandlingsgrupperna med hjälp av ett t-test (α = 0,05).
- Räkna levande och döda larver och puppor på dag 10 för att rita en Kaplan-Meier-kurva för överlevnadsprocent med hjälp av grafprogrammet.
- Räkna antalet puppor och beräkna procentandelen förpuppning med hjälp av den givna formeln:
- Procentuell förpuppning (%) = (antal puppor som bildats/totalt antal larver) x 100
- Jämför larvutvecklingen i termer av näringsindex23 med hjälp av följande formler, ECI (%) = (viktökning av larver/vikt av uppätet foder) x 100
ECD (%) = (viktökning av larver/[vikt av ätet foder - vikt av frass]) x 100
AD (%) = ([vikt av ätet foder - vikt av frass]/vikt av ätet foder) x 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insektslarver som utfodrades med en diet som innehöll 1 000 ppm quercetin visade en signifikant minskning av kroppsvikten med ~57 % jämfört med kontrollgruppen (Figur 2A). Minskningen av kroppsvikten resulterade i en minskad kroppsstorlek hos quercetinbehandlade larver (Figur 2B). En märkbar minskning observerades i matningshastigheten för quercetinmatade larver jämfört med kontrollgruppen (Figur 2C).
Larver som utfodrades med quercetin visade också en minskning av förpuppningsfrekvensen med ~14 % och fördröjd förpuppning, vilket tyder på utvecklingshämning vid behandling (Figur 3A,B). Dessutom observerades ~77,65 % av överlevnads- och dödliga fenotyper hos insektslarver som utfodrades med en quercetininnehållande diet (Figur 4A,B). Näringsparametrarna beräknades för kontroll- och quercetinmatade larver baserat på konsumtion och användning av föda (tilläggstabell 1). ECI för kroppsmateria och ECD för insekter som utfodrades med 1 000 ppm quercetininnehållande kost minskade med ~9 % respektive ~49 %. Minskningen av ECD kan bero på bristen på tillgängliga metaboliter i insektskroppen20. AD:n för quercetinmatade insekter ökade med ~5 % jämfört med kontrollen (tabell 2). Sammantaget tyder de erhållna resultaten på att quercetin har signifikanta negativa effekter på insektstillväxt och utvecklingen av H. armigera.
Figur 1: Schematisk representation av beredningen av en konstgjord diet och quercetininnehållande diet. Fraktionerna A, B och C blandas för att göra en konstgjord och quercetininnehållande kost. Larverna utfodras med respektive diet i 10 dagar. Blå processpilar representerar en konstgjord diet, medan röda processpilar representerar beredningen av en quercetininnehållande diet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa data från quercetin-utfodringsanalysen. (A) Kroppsviktsdiagram för H. armigera-larver efter utfodring av 1 000 ppm quercetin jämfört med kontrollen dag 2, 4, 6, 8 och 10. Larvernas kroppsvikt är i milligram (mg). (B) Den genomsnittliga storleken på larverna registreras på dag 10. Skalstreck = 1 cm. (C) Genomsnittlig utfodringshastighet registrerad dag 2, 4, 6, 8 och 10. Fodrets vikt är i milligram (mg). Blå cirklar och röda fyrkanter representerar medelvärdet av data för kontrollinsekter och quercetinbehandlade insekter varannan dag. Elevens t-test används för jämförelse av de två grupperna (parade). Data representerar medelvärdet ± SEM (n = 21 andra stjärnlarver; *p < 0,05 indikerar statistiskt signifikant). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa data för förpuppning från utfodringstestet. (A) Procentuell andel av förpuppningsdiagrammet. (B) Bilder av puppor (dag 15) som visar en fördröjd och minskad förpuppningshastighet vid quercetinbehandling. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa data för överlevnad dag 10 vid utfodring av 1 000 ppm quercetin jämfört med kontroll. (A) Kaplan-Meier-överlevnadsgrafen för quercetinmatade insekter visar minskad överlevnadsgrad. Kontrollinsekterna visar en överlevnadsgrad på ~96 % och de quercetinbehandlade insekterna visar en överlevnad på ~77,65 %. (B) Bilder av dödliga fenotyper av quercetinmatade larver tagna på dag 10. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Bråk A | ||
| 1 | Bengal Gram | 50 g |
| 2 | Jästextrakt | 12 g |
| 3 | Kasein | 3,5 gr |
| 4 | Sorbinsyra | 0,5 gr |
| 5 | Metyl parabener | 1 g |
| 6 | dH2O | 150 ml |
| Fraktion B | ||
| 1 | Kolinklorid | 0,35 gr |
| 2 | Streptomycin | 0,02 gr |
| 3 | Askorbinsyra | 2 g |
| 4 | Kolesterol | 0,15 gr |
| 5 | Multivitamin kapsel | 1 |
| 6 | Vitamin E kapsel | 1 |
| 7 | dH2O | 30 ml |
| Fraktion C | ||
| 1 | Agar Agar | 6,5 gr |
| 2 | dH2O | 180 ml |
Tabell 1: Sammansättning av den artificiella kosten.
| Behandling (Quercentin-koncentration) | Näringsvärde (%) | ||
| Medborgarinitiativ | ECD | REKLAM | |
| 0 ppm | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 ppm | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
Tabell 2: Effekt av intag av quercetin på H. armigeras födobeteende och kostutnyttjande. Förkortningar: ECI = effektivitet vid omvandling av intagna livsmedel; ECD = effektivitet för omvandling av smält mat; AD = ungefärlig smältbarhet.
Tilläggstabell 1: Exempel på datablad för quercetinmatningsanalysen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bioanalyser i laboratorier är användbara för att förutsäga resultat och producera jämförande toxicitetsdata för flera föreningar på kort tid till en rimlig kostnad. Utfodringsbioassay hjälper till att tolka interaktionerna mellan insekt-insekticid och insekt-växt-insekticider. Det är en effektiv metod för att mäta toxiciteten hos en mängd olika ämnen som avsevärt förenklar processen för att fastställa den dödliga dosen 50 (LD50), den dödliga koncentrationen 50 (LC50) eller någon annan dödlig koncentration eller dos24,25. Olika laboratoriebioassays används för att bestämma insekticid aktivitet, insekticidresistens och toxiciteten hos föreningar, inklusive kostbeläggning, lokal applicering, obligatorisk utfodring, injektionsmetoden, kontakt eller rester och filmmetoden13,14. Alla dessa metoder kan användas baserat på syftet med en viss studie, men den ideala bioassay-metoden bör vara snabb och effektiv26. Därför kan den obligatoriska utfodringsmetoden som diskuteras i detta manuskript vara den bioassay som väljs i flera fall, förutom för sugande insekter.
Den obligatoriska utfodringsanalysen som beskrivs i detta manuskript kan användas för att studera effekten av vilken förening som helst på insektslarvers tillväxt, utveckling, utfodring och överlevnad. I de representativa resultaten som visas här undersöktes den insekticida aktiviteten hos quercetin mot H. armigera-larver, vilket ger en motivering för vidare forskning. Signifikanta minskningar av kroppsvikten med ~57 % (Figur 2A,B), förändringar i utfodringshastighet (Figur 2C) och minskad överlevnad med ~18 % (Figur 4A,B) observerades hos quercetinmatade larver. Insekter som utfodrades med en quercetindiet visade också försenad och minskad förpuppning med ~14 % (Figur 3A,B). En signifikant förändring observerades också i näringsindex, inklusive ECI, ECD och AD (tabell 2), jämfört med kontrollgruppen. Sammantaget tyder dessa resultat på att quercetin har en skadlig effekt på tillväxt, utveckling och överlevnad av H. armigera-larver. Alla dessa observationer följer quercetins antibioseffekt på Aedes aegypti27, Bactrocera cucurbitae Coquillett28 och Drosophila melanogaster29. Vidare visar sig dessa observationer vara i överensstämmelse med ökad dödlighet i Bombyx mori på grund av nedsatt immunförsvar30, minskad larvvikt och fruktsamhet i Spodoptera litura31, Hyphantria cunea12 och Eriosoma lanigerum32.
Att vidta försiktighetsåtgärder, såsom enhetlighet i provstorlek, är avgörande för att minska den biologiska variansen mellan experimenten. För att säkerställa reproducerbarheten måste utfodringstestet utföras med insektslarver av samma stjärna i ett insektsodlingsrum vid jämna temperaturer och luftfuktighetsnivåer. När du förbereder en konstgjord diet måste du se till att fytokemikalien blandas jämnt med kosten. För att minimera felet på grund av fytokemisk nedbrytning över tid är en nylagad diet att föredra för analys. Fytokemikaliernas egenskaper, såsom termokänslighet, ljuskänslighet, löslighet etc., bör beaktas vid beredning och förvaring av den konstgjorda kosten. Dieter som har torkat ut med tiden kan ändra färg och krympa, och de bör inte användas för utfodringsanalysen. Analysresultaten får inte beaktas när kontrollgruppens dödlighet är högre än 10 %33. De material, t.ex. spatel, bägare, petriskålar osv., som krävs för beredning av foder och insektsvägning bör vara åtskilda för kontroll- och behandlingsgrupperna för att undvika fel på grund av korskontaminering.
Bioassay för insektsutfodring är mycket specifik och reproducerbar, men har vissa begränsningar. Till exempel, när en insekt attackerar en växt, producerar växtimmunitet strukturella eller kemiska egenskaper för att minska växtätande och därmed minimera skador på växtätare34. Dessa defensiva egenskaper och deras effekter observeras dock inte under denna analys. En annan begränsning är att den bestämda koncentrationen av fytokemikalier som intas av insekter inte kan bestämmas14. Stabiliteten hos näringsinnehållet i kosten och den använda fytokemikalien är en viktig begränsande faktor som kan påverka dess effekt på insekter.
Trots de ovan nämnda begränsningarna är den obligatoriska utfodringsanalysen prisvärd och kan testa ett stort antal många insekter samtidigt. Denna analys kan också anpassas för att screena flera molekyler för att studera deras antifeedant och insekticida egenskaper mot olika klasser av insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerade att det inte förelåg någon intressekonflikt.
Acknowledgments
SM, YP och VN erkänner stipendiet som tilldelats av University Grants Commission, Government of India, New Delhi. RJ tackar Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indien, och CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, Indien, för ekonomiskt stöd under projektkoderna MLP036626, MLP101526 och YSA000826.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
- Popp, J., Pető, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2013).
- da Silva, F. R., et al. Comparative toxicity of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) to selected insecticides. Insects. 11 (7), 431 (2020).
- Usman, A., Ali, M. I., Shah, M., e Amin, F., Sarwar, J. Comparative efficacy of indigenous plant extracts and a synthetic insecticide for the management of tomato fruit worm (Helicoverpa armigera Hub.) and their effect on natural enemies in tomato crop. Pure and Applied Biology. 7 (3), 1014-1020 (2018).
- Honnakerappa, S. B., Udikeri, S. S. Abundance of Helicoverpa armigera (Hubner) on different host crops. Journal of Farm Science. 31, 436-439 (2018).
- Edosa, T. T. Review on bio-intensive management of African bollworm, Helicoverpa armigera (Hub.): Botanicals and semiochemicals perspectives. African Journal of Agricultural Research. 14 (1), 1-9 (2019).
- Zhou, Y., et al. Migratory Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) exhibits marked seasonal variation in morphology and fitness. Environmental Entomology. 48 (3), 755-763 (2019).
- Souto, A. L., et al. Plant-derived pesticides as an alternative to pest management and sustainable agricultural production: Prospects, applications and challenges. Molecules. 26 (16), 4835 (2021).
- Özkara, A., Akyıl, D., Konuk, M. Pesticides, environmental pollution, and health. Environmental Health Risk-Hazardous Factors to Living Species. , (2016).
- Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42 (2021).
- Tlak Gajger, I., Dar, S. A. Plant allelochemicals as sources of insecticides. Insects. 12 (3), 189 (2021).
- Riddick, E. W. Potential of quercetin to reduce herbivory without disrupting natural enemies and pollinators. Agriculture. 11 (6), 476 (2021).
- Gao, Y. -L., et al. The effect of quercetin on the growth, development, nutrition utilization, and detoxification enzymes in Hyphantria cunea Drury (Lepidoptera: Arctiidae). Forests. 13 (11), 1945 (2022).
- Durmuşoğlu, E., Hatipoğlu, A., Gürkan, M. O., Moores, G. Comparison of different bioassay methods for determining insecticide resistance in European Grapevine Moth, Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller) (Lepidoptera: Tortricidae). Turkish Journal of Entomology. 39 (3), 271-276 (2015).
- Paramasivam, M., Selvi, C. Laboratory bioassay methods to assess the insecticide toxicity against insect pests-A review. Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (3), 1441-1445 (2017).
- Clark, E. L., Isitt, R., Plettner, E., Fields, P. G., Huber, D. P. W. An inexpensive feeding bioassay technique for stored-product insects. Journal of Economic Entomology. 107 (1), 455-461 (2014).
- Waldbauer, G. P., Cohen, R. W., Friedman, S. An improved procedure for laboratory rearing of the corn earworm, Heliothis zea (Lepidoptera: Noctuidae). The Great Lakes Entomologist. 17 (2), 10 (2017).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Laboratory rearing of stable flies and other muscoid Diptera. JoVE. (138), e57341 (2018).
- Zheng, M. -L., Zhang, D. -J., Damiens, D. D., Lees, R. S., Gilles, J. R. L. Standard operating procedures for standardized mass rearing of the dengue and chikungunya vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)-II-Egg storage and hatching. Parasites & Vectors. 8, 1-7 (2015).
- Nagarkatti, S., Prakash, S. Rearing Heliothis armigera (Hubn.) on an artificial diet. Technical Bulletin Commonwealth Institute of Biological Control. , (1974).
- Adhav, A. S., Kokane, S. R., Joshi, R. S. Functional characterization of Helicoverpa armigera trehalase and investigation of physiological effects caused due to its inhibition by Validamycin A formulation. International Journal of Biological Macromolecules. 112, 638-647 (2018).
- Abbasi, B. H., et al. Rearing the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, on a tapioca-based artificial diet. Journal of Insect Science. 7 (1), 35 (2007).
- Armes, N. J., Jadhav, D. R., Bond, G. S., King, A. B. S. Insecticide resistance in Helicoverpa armigera in South India. Pesticide Science. 34 (4), 355-364 (1992).
- Waldbauer, G. P. The consumption and utilization of food by insects. Advances in Insect Physiology. 5, Academic Press. 229-288 (1968).
- Carpinella, M. C., Defago, M. T., Valladares, G., Palacios, S. M. Antifeedant and insecticide properties of a limonoid from Melia azedarach (Meliaceae) with potential use for pest management. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (2), 369-374 (2003).
- Diaz Napal, G. N., Palacios, S. M. Bioinsecticidal effect of the flavonoids pinocembrin and quercetin against Spodoptera frugiperda. Journal of Pest Science. 88, 629-635 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , 4-38 (1990).
- Gikonyo, N. K., Mwangi, R. W., Midiwo, J. O. Toxicity and growth-inhibitory activity of Polygonum senegalense (Meissn.) surface exudate against Aedes aegypti larvae. International Journal of Tropical Insect Science. 18 (3), 229-234 (1998).
- Sharma, R., Sohal, S. K. Bioefficacy of quercetin against melon fruit fly. Bulletin of Insectology. 66 (1), 79-83 (2013).
- Després, L., David, J. -P., Gallet, C. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 298-307 (2007).
- Shi, G., Kang, Z., Ren, F., Zhou, Y., Guo, P. Effects of quercetin on the growth and expression of immune-pathway-related genes in silkworm (Lepidoptera: Bombycidae). Journal of Insect Science. 20 (6), 23 (2020).
- Selin-Rani, S., et al. Toxicity and physiological effect of quercetin on generalist herbivore, Spodoptera litura Fab. and a non-target earthworm Eisenia fetida Savigny. Chemosphere. 165, 257-267 (2016).
- Ateyyat, M., Abu-Romman, S., Abu-Darwish, M., Ghabeish, I. Impact of flavonoids against woolly apple aphid, Eriosoma lanigerum (Hausmann) and its sole parasitoid, Aphelinus mali (Hald). Journal of Agricultural Science. 4 (2), 227 (2012).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. JoVE. (144), e57768 (2019).
- Mitchell, C., Brennan, R. M., Graham, J., Karley, A. J. Plant defense against herbivorous pests: exploiting resistance and tolerance traits for sustainable crop protection. Frontiers in Plant Science. 7, 1132 (2016).
