Summary
Vi tillhandahåller en omfattande översikt och förfining av befintliga protokoll för organoidbildning av hepatocellulärt karcinom (HCC), som omfattar alla stadier av organoidodling. Detta system fungerar som en värdefull modell för identifiering av potentiella terapeutiska mål och bedömning av läkemedelskandidaters effektivitet.
Abstract
Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en mycket utbredd och dödlig tumör över hela världen och dess sena upptäckt och brist på effektiva specifika terapeutiska medel kräver ytterligare forskning om dess patogenes och behandling. Organoider, en ny modell som liknar naturlig tumörvävnad och kan odlas in vitro, har väckt stort intresse de senaste åren, med många rapporter om utvecklingen av organoidmodeller för levercancer. I denna studie har vi framgångsrikt optimerat proceduren och etablerat ett odlingsprotokoll som möjliggör bildandet av större HCC-organoider med stabila passage- och odlingsförhållanden. Vi har utförligt beskrivit varje steg i proceduren, som täcker hela processen med HCC-vävnadsdissociation, organoidplätering, odling, passaging, kryokonservering och återupplivning, och tillhandahållit detaljerade försiktighetsåtgärder i detta dokument. Dessa organoider uppvisar genetisk likhet med de ursprungliga HCC-vävnaderna och kan användas för olika tillämpningar, inklusive identifiering av potentiella terapeutiska mål för tumörer och efterföljande läkemedelsutveckling.
Introduction
Hepatocellulärt karcinom (HCC), en utbredd och mycket varierad tumör1, har fått stor uppmärksamhet inom det medicinska samfundet. Förekomsten av härstamningsplasticitet och betydande heterogenitet i HCC tyder på att tumörceller som härrör från olika patienter och till och med distinkta lesioner inom samma patient kan uppvisa olika molekylära och fenotypiska egenskaper, vilket utgör formidabla hinder för utvecklingen av innovativa terapeutiska metoder 2,3,4,5 . Följaktligen finns det ett absolut behov av ökad förståelse av de biologiska egenskaperna och mekanismerna för läkemedelsresistens vid HCC för att informera formuleringen av mer effektiva behandlingsstrategier.
Under de senaste decennierna har forskare ägnat sina ansträngningar åt att utveckla in vitro-modeller i syfte att studera HCC 3,4. Trots vissa framsteg kvarstår begränsningarna. Dessa modeller omfattar en rad olika tekniker, såsom användning av cellinjer, primära celler och patient-deriverade xenografter (PDX). Cellinjer fungerar som in vitro-modeller för långtidsodling av tumörceller erhållna från HCC-patienter, vilket ger fördelarna med bekvämlighet och enkel expansion. Primära cellmodeller innebär direkt isolering och odling av primära tumörceller från patientens tumörvävnad, vilket ger en representation av biologiska egenskaper som liknar patienterna själva. PDX-modeller innebär transplantation av tumörvävnad från patienter till möss, i syfte att mer exakt simulera tumörtillväxt och respons. Dessa modeller har varit avgörande för HCC-forskning, men de har vissa begränsningar, inklusive cellinjernas heterogenitet och oförmågan att fullt ut replikera in vivo-förhållanden. Dessutom kan långvarig in vitro-odling leda till försämring av cellernas ursprungliga egenskaper och funktioner, vilket innebär utmaningar när det gäller att korrekt representera de biologiska egenskaperna hos HCC. Dessutom är användningen av PDX-modeller både tidskrävande och kostsam3.
För att ta itu med dessa begränsningar och mer exakt replikera de fysiologiska egenskaperna hos HCC har användningen av organoidteknik introducerats som en lovande forskningsplattform som kan överträffa tidigare begränsningar. Organoider, som är tredimensionella cellmodeller odlade in vitro, har förmågan att replikera strukturen och funktionaliteten hos faktiska organ. I samband med HCC finns det dock vissa utmaningar med att etablera organoidmodeller. Dessa utmaningar inkluderar otillräckligt detaljerade beskrivningar av HCC-organoidkonstruktionsprocedurer, brist på omfattande protokoll för hela processen för HCC-organoidkonstruktion och den vanligtvis lilla storleken på odlade organoider 6,7,8. Mot bakgrund av de vanligtvis begränsade dimensionerna av odlade organoider, strävade vi efter att ta itu med dessa utmaningar genom att utveckla ett omfattande protokoll som omfattar hela HCC-organoidkonstruktion6. Detta protokoll omfattar vävnadsdissociation, organoidplätering, odling, passaging, kryokonservering och återupplivning. Genom att optimera procedurstegen och förfina sammansättningen av odlingsmediet har vi framgångsrikt etablerat HCC-organoidmodeller som kan upprätthålla tillväxt och långsiktig passage 6,8. I de följande avsnitten kommer en omfattande redogörelse för de operativa krångligheterna och relevanta faktorer som är involverade i konstruktionen av HCC-organoider att presenteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vävnader från humana biopsier erhölls från respektive patient vid Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University, och informerat samtycke erhölls från patienterna. Se materialtabellen för detaljer om alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll.
1. Etablering av HCC-organoider från patienter från kirurgiska prover
OBS: Etableringen av HCC-organoider omfattar olika steg, nämligen vävnadsdissociation, organoidplätering, odling, passaging, kryokonservering och återupplivning. Processen för vävnadsdissociation kräver en varaktighet på 2 timmar, medan sådd av organoider på en platta tar cirka 40 minuter. Efter detta genomgår den första generationen HCC-organoider en odlingsperiod på 10-14 dagar med HCC-isoleringsmedium. När en tillfredsställande densitet har uppnåtts utförs organoidpassager, vilket kräver 1 timme. Efterföljande odlingar av organoiderna bibehålls sedan med HCC-expansionsmedium i 7-10 dagar, vilket kan variera beroende på organoidernas tillväxthastighet och tillstånd.
- Dissociation av vävnad
- Förberedelse av förnödenheter och material
- Samla in 1-2cm3 HCC-vävnad från patienter som inte tidigare har fått någon lokal eller systemisk behandling före operationen. Efter kirurgisk resektion förvaras vävnaden vid 4 °C i vävnadskonserveringslösning (tabell 1) fram till bearbetning.
OBS: Färska vävnadsprover av hög kvalitet är avgörande för en framgångsrik etablering av organoider. Det är viktigt att behandla prover snabbt, helst inom 1-4 timmar efter kirurgisk resektion för att bibehålla vävnadens livskraft. Utför alla efterföljande procedurer i en aseptisk miljö med sterila material och reagenser. - Förvärm cellodlingsplattor med ultralåg vidhäftning (24 brunnar) i 1 timme i en inkubator vid 37 °C. Tina det frysta basalmembranextraktet (BME) över natten vid 4 °C fram till strax före användning.
OBS: För att säkerställa fullständig upptining av BME måste den placeras på is i minst 3 timmar. Fullständig smältning av BME är avgörande för framgångsrik organoidodling i de efterföljande stegen. - Före användning, se till att digestionslösningen (tabell 1) värms upp till en temperatur på 37 °C.
OBS: Bered digestionslösningen på nytt i en aseptisk miljö och använd den omedelbart.
- Samla in 1-2cm3 HCC-vävnad från patienter som inte tidigare har fått någon lokal eller systemisk behandling före operationen. Efter kirurgisk resektion förvaras vävnaden vid 4 °C i vävnadskonserveringslösning (tabell 1) fram till bearbetning.
- Organisatoriskt bearbetningsflöde
- Skär tumörvävnaden i små bitar (0,5-1 mm3) i ett laminärt flödesskåp med hjälp av en kirurgisk sax på en petriskål. Överför den klippta vävnaden till ett 15 ml koniskt rör och tillsätt 5-10 ml basalmedium (tabell 1).
OBS: Basalmediet (tabell 1) kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad. - Använd en barotropisk pipett för att tvätta bort så mycket blod som möjligt och låt den stå i 1-2 minuter för att ta bort en del av supernatanten, inklusive eventuella blodkroppar och flytande fettproppar. Upprepa denna procedur två gånger.
- Centrifugera blandningen vid 300 × g i 5 minuter vid rumstemperatur och ta försiktigt bort supernatanten. Tillsätt 5 ml av den förvärmda digestionslösningen (tabell 1) till den putsade vävnaden.
- Rotera röret vid 37 °C för matsmältning.
- Efter 30 minuters inledande matsmältning, leta efter små kluster av celler under mikroskopet. Kontrollera var 5-10:e minut för att undvika övermatning.
OBS: Den tid som krävs för vävnadssmältning beror på vävnadens storlek och typ. Matsmältningen av vävnad bör inte överstiga 90 minuter. Översmält vävnad kommer att visas under mikroskopet som ett stort ark av enskilda celler. Den lämpliga nivån av matsmältning indikeras av det faktum att de flesta av dessa är cellkluster och har ett druvliknande utseende. - Avbryt nedbrytningen genom att tillsätta kallt basalmedium (tabell 1) och filtrera i ett nytt 50 ml rör med ett 100 μm cellfilter. Tillsätt kallt basalmedium till en volym av 50 ml.
- Centrifugera cellerna vid 2 × g i 10 minuter vid 8 °C. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pelleten genom att tillsätta ytterligare 50 ml kallt basalmedium (tabell 1). Upprepa detta steg två gånger.
OBS: Centrifugering med låg hastighet används för att låta små cellkluster slå sig ner, medan blodkroppar och cellskräp fortfarande är suspenderade i supernatanten; Processen upprepas flera gånger för att få en relativt ren vävnadscellmassa.
- Skär tumörvävnaden i små bitar (0,5-1 mm3) i ett laminärt flödesskåp med hjälp av en kirurgisk sax på en petriskål. Överför den klippta vävnaden till ett 15 ml koniskt rör och tillsätt 5-10 ml basalmedium (tabell 1).
- Förberedelse av förnödenheter och material
- Organoid plätering
- Efter den andra tvätten avlägsnas så mycket av supernatanten som möjligt och återsuspenderar det önskade antalet celler (1 000–5 000 celler per brunn på en 24-hålsplatta) i lämplig BME för plätering.
OBS: Håll alltid BME vid 4 °C före användning. - Lägg till BME och suspendera små cellkluster i Advanced DMEM/F-12 genom att lägga till BME och försiktigt pipettera upp och ner tills cellaggregaten är helt suspenderade. Kontrollera koncentrationen av BME mellan 30 % och 50 %.
- Frö 50 μL BME-droppar blandade med cellkluster i mitten av 24-brunnars odlingsplattor.
OBS: Låt inte dropparna spridas till brunnsplattans sidovägg så långt det är möjligt. Sidoväggen på lågadsorptionsplattan är inte i ett lågadsorptionstillstånd, och kontakt mellan dropparna och sidoväggen kommer att leda till vidhäftning, vilket inte bidrar till den efterföljande inkubationen. - Låt plattorna med de tillsatta dropparna stelna vid 37 °C i 20 minuter. I slutet av inkubationen tillsätts 500 μl förvärmt medium (tabell 1) till varje brunn och inkuberas i en cellinkubator vid 37 °C.
- Efter den andra tvätten avlägsnas så mycket av supernatanten som möjligt och återsuspenderar det önskade antalet celler (1 000–5 000 celler per brunn på en 24-hålsplatta) i lämplig BME för plätering.
- Organoid kultur
- Uppdatera odlingsmediet (tabell 1) en gång var 2-3:e dag. I början av odlingen odlas HCC-organoiderna i HCC-isoleringsmedium (tabell 1) i 2 veckor.
- Efter 2 veckors inkubation med HCC-isoleringsmedium, byt ut mediet mot HCC-organoidexpansionsmedium (tabell 1) (förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor).
- Uppdatera odlingsmediet en gång var 3:e dag.
- Efter 7-10 dagars odling med HCC-expansionsmedium när organoiden har nått lämplig densitet eller storlek, initiera experimentella ingrepp eller passage eller frys in organoiderna efter behov.
- Organoid passaging
- Förberedelse av förnödenheter och material
- Förvärm cellodlingsplattor med ultralåg vidhäftning (24 brunnar) i 1 timme i en inkubator vid 37 °C. Tina fryst BME över natten vid 4 °C fram till strax före användning.
- Förvärm organoidlösning och trypsinersättning vid 37 °C i 30 minuter.
- passerande process
- Efter att ha avlägsnat odlingsmediet från brunnsplattan, överför organoidsuspensionen till ett 15 ml rör.
- Tillsätt organoidskördslösning enligt mängden BME (500 μl organoidskördslösning per 50 μl BME) genom att skrapa och pipettera upp och ner med en 1 000 μL pipettpistol.
OBS: Undvik luftbubblor under hela processen för att förhindra förlust av organoider eftersom närvaron av luftbubblor indikerar högre pipetteringstryck. - Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur.
- Aspirera försiktigt BME med en 1 000 μL pipett och observera att BME är helt upplöst. Observera var 10:e minut tills ett klart organoidcellkluster observeras, centrifugera sedan vid 400 × g i 5 minuter vid rumstemperatur och ta bort så mycket av supernatanten som möjligt.
OBS: I detta skede kan organoiden frysas och konserveras. - För enzymatisk nedbrytning av organoider, tillsätt 1-5 ml trypsinersättning (beroende på antalet organoider) och inkubera vid 37 °C i 2 minuter. Observera under mikroskopet graden av enzymatisk matsmältning för att avgöra om organoiderna dissocierar i små kluster av 2-10 celler; Om inte, fortsätt den enzymatiska matsmältningen.
OBS: Översmältning kommer att resultera i att organoida cellkluster lyses till enskilda celler, vilket minskar deras livskraft och förlänger efterföljande odlingstid. - Tillsätt lämplig volym kallt basalmedium (tabell 1) för att stoppa matsmältningen.
- Centrifugera organoiderna vid 400 × g i 5 minuter vid 8 °C. Ta bort supernatanten så mycket som möjligt.
- Återsuspendera det önskade antalet organoider (1 000–5 000 organoider per brunn på en platta med 24 brunnar) i lämplig matris för plätering. Följ samma steg som i avsnitt 1.2.
OBS: Pläteringsdensiteten bör optimeras efter organoidernas tillväxthastighet och storlek. - Passera organoiderna var 10:e dag i förhållandet 1:3 eller 1:4 beroende på organoidtillväxtens densitet.
- Förberedelse av förnödenheter och material
- Kryokonservering och återupplivning av organoider
- Kryokonservering av organoider
- Förbered frystorkningsrör, varje rör sammanflyter med två brunnar på en 24-brunnars platta som innehåller organoider.
- Följ steg 1.4.2.1 till 1.4.2.4 för organoidpassage för att erhålla organoider utan BME, och återsuspendera försiktigt organoiderna genom att tillsätta 500 μL/brunn av organoid frystorkningslösning till en 24-hålars platta.
OBS: Beroende på organoidernas tillväxtstatus och storlek rekommenderas det att kryokonservera organoiderna i odling upp till tredje generationen. - Överför suspensionen till frystorkningsrör och placera den i en gradientkyld låda vid -80 °C. Efter gradientkylning vid -80 °C i minst 24 timmar, överför rören till flytande kväve för långtidsförvaring.
- Återupplivning av organoider
- Inkubera frystorkade rör i ett 37 °C vattenbad och stoppa inkubationen när endast ett litet isblock återstår.
- Centrifugera vid 400 × g i 5 minuter vid 8 °C för att avlägsna supernatanten helt.
- Följ avsnitt 1.2 och 1.3 för efterföljande åtgärder.
- Kryokonservering av organoider
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid implementering av ovannämnda procedur kan uppkomsten av HCC-organoidsfäroider vanligtvis observeras inom ett intervall av 3 dagar (Figur 1). Figur 1A,B visar den etablerade HCC-organoiden, som snabbt utvecklar kompakta sfäroider som kännetecknas av rundade kanter och permeabel cytosol på den första etableringsdagen. Under tillväxten av HCC-organoider hade användningen av olika koncentrationer av BME olika effekter på organoidernas tillväxthastighet. Vi odlade två HCC-organoider från patienter i 10 %, 30 %, 50 % och 100 % av BME i 12 dagar i HCC-expansionsmedium (tabell 1) och fann att BME var intakt vid 30 % och 50 % och organoiderna var nära i storlek och hade den största diametern vid dessa BME-koncentrationer. Med 10 % BME var BME den mest fragmenterade, med ett smalt utrymme för organoidtillväxt och den minsta diametern. Vid 100 % BME var BME den mest intakta, men organoidernas diameter var i mitten. Därför rekommenderas det att kontrollera koncentrationen av BME vid 30-50 % i HCC-organoidkultur (Figur 2). Den prolifererande HCC-organoiden kan förökas effektivt i enlighet med det föreskrivna protokollet och uppnå en storlek som överstiger 500 μm i varje odling efter tre generationers odling (figur 3). Efterföljande experiment, inklusive läkemedelsintervention och immunhistokemisk färgning, kan utföras när denna storlek uppnås. Genom att använda denna odlingsstrategi uppnådde vi en betydande tillväxt av HCC-organoider och nådde storlekar som överstiger 1 000 μm inom en 20-dagars odlingsperiod (figur 4). Immunohistokemisk färgning av både HCC-organoider och parade tumörvävnader visade likheter i uttrycket av markörgener (Figur 5).
Figur 1: HCC-organoider från patienters kirurgiska vävnader. (A,B) Representativa bilder av robusta HCC-organoidkulturer på den första dagen av pläteringen. (C,D) HCC-organoidkulturerna efter 5 dagars odling. Skalstreck = 500 μm (A,C), 250 μm (B,D). Förkortning: HCC = hepatocellulärt karcinom. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Att undersöka tillväxten av HCC-organoidmodeller vid olika BME-koncentrationer. HCC-organoider A och B odlades vid samma planteringstäthet under 12 dagar i 10 %, 30 %, 50 % och 100 % BME med HCC-expansionsmedium (tabell 1). Skalstaplar = 1 000 μm (A), 250 μm (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: HCC-organoider i långtidsamplifiering. (A,B) Representativa bilder av HCC-organoider på den tionde dagen av passage 8. Skalstapel = 500 μm (A), 250 μm (B). Förkortning: HCC = hepatocellulärt karcinom. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Maximal storlek på HCC-organoider. Representativa bilder av HCC-organoider under en 20-dagars odlingsperiod i passage 8 . Skalstapel = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Histopatologiska egenskaper hos HCC-organoider och parade tumörvävnader. Uttrycket av genmarkörer för HCC-organoider och parade tumörvävnader, HCC-markören AFP, differentierade hepatocytmarkörerna HNF4A och ALB, duktalmarkörerna SOX9 och EPCAM samt gallmarkören KRT19 detekterades med immunhistokemi. Skalstapel = 100 μm. Förkortningar: AFP = alfafetoprotein; HNF4A = hepatocytkärnfaktor 4 alfa, ALB = albumin; SOX9 = SRY-Box transkriptionsfaktor 9; EPCAM = epitelcelladhesionsmolekyl; KRT19 = Keratin 19. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Sammansättning av medier och lösningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En anmärkningsvärd fördel med patienthärledda organoidmodeller ligger i deras förmåga att troget replikera de biologiska egenskaperna hos tumörer, vilket omfattar vävnadsstruktur och genomiskt landskap. Dessa modeller uppvisar en anmärkningsvärd nivå av noggrannhet och speglar effektivt heterogeniteten och progressionen av tumörer, även under längre perioder av odling 6,8,9. Genom att använda detta förfinade organoidodlingsprotokoll har vi effektivt etablerat patienthärledda HCC-organoidmodeller, vilket underlättar hållbar tillväxt in vitro, såväl som förmågan att kryokonservera och därefter återuppliva organoider som krävs för experimentella ändamål. I jämförelse med tidigare protokoll uppvisar dessa organoider ökade tillväxthastigheter och kan uppnå större dimensioner i kulturen. Därefter utsatte vi de väletablerade organoiderna för antikroppskopplade läkemedel som härrör från förscreenade potentiella onkogena mål, vilket ledde till anmärkningsvärda terapeutiska resultat som överensstämmer med in vivo PDX-djurmodeller10,11.
Syftet med denna studie var att förbättra bristerna i tidigare HCC-organoidetableringsprotokoll, vilket resulterade i bildandet av större HCC-organoider under stabila passage- och odlingsförhållanden. Vi optimerade koncentrationen av BME för att förbättra tillväxthastigheten för organoider samtidigt som kostnaden för experimentet minskade; lade till en viktig faktor, CHIR99021, till den ursprungliga kulturformeln, som kan främja självförnyelsen av stamceller i organoider och öka spridningen av organoider; förbättrade borttagningsmetoden för BME, från den ursprungliga mekaniska separationsmetoden till användningen av en speciell skördelösning, för att öka mängden erhållen organoid och förbättra effektiviteten; kompletterade operationsstegen för kryokonservering och återupplivning av organoider, konstruerade hela processen för HCC-organoidkultur. Med detta organoidodlingsprotokoll är det möjligt att uppnå en genomsnittlig organoidstorlek på 800 μm under en enda 20-dagars odlingsperiod, med ett fåtal robusta HCC-organoider som växer till över 1 000 μm. Det slutliga målet är att öka precisionen i behandlingsstrategier för HCC och etablera en pålitlig modell och plattform för läkemedelsutveckling. Dessa insatser kommer att bidra till att förbättra överlevnaden hos HCC-patienter och tillhandahålla nya lösningar för att bekämpa läkemedelsresistens 11,12,13.
Det är dock absolut nödvändigt att ta hänsyn till flera aspekter av diskursen. I första hand uppstår ett betydande hinder från den minskade effekten av att etablera HCC-organoider, särskilt för patienter hos patienter med HCC i mellanstadium till avancerat stadium som har genomgått olika terapeutiska interventioner, inklusive kateterburen arteriell kemoembolisering (TACE), kemoterapi och riktad terapi 4,5. Ofta äventyras tumöraktiviteten hos utskurna HCC-prover, vilket leder till en minskad framgångsgrad när det gäller att generera organoider. Under tiden, i den tidigare etableringen av HCC-organoider av andra team, fann man att det finns ett samband mellan andelen prolifererande celler i tumören, graden av differentiering av tumören och etableringen av organoider 6,9. Därför är uppnåendet av en hög framgångsfrekvens i utvecklingen av HCC-organoider intrikat knutet till de behandlingar som används före patientens operation, liksom behovet av kompletterande bedömningar av patologen efter att tumörvävnaderna har erhållits. Dessutom, även om organoider påstås replikera heterogeniteten hos HCC, är det en utmaning att urskilja om en organoid i odling kommer från en ensam cellklon eller omfattar en blandning av celler med distinkta genetiska profiler. Följaktligen är ytterligare undersökningar absolut nödvändiga för att öka vår förståelse av den klonala dynamiken och genetiska mångfalden inom HCC-organoider. Dessutom är det absolut nödvändigt att ta itu med de inneboende begränsningarna hos nuvarande plattbaserade organoidodlingstekniker. En anmärkningsvärd begränsning är den begränsade tillväxtpotentialen hos organoider. Odlingen av HCC-organoider med hjälp av detta protokoll är det möjligt att uppnå diametrar på mer än 1 000 μm. Men i de senare stadierna av odlingen förekommer svärtad nekros ofta i organoidens kärnregion, på grund av otillräcklig närings- och syretillförsel, vilket begränsar organoidernas utvecklingspotential. Därför finns det ett akut behov av att utforma strategier som syftar till att förbättra näringstillförseln och syresättningen inom organoidodlingssystemet.
Sammanfattningsvis uppvisar patienthärledda organoidmodeller anmärkningsvärda fördelar när det gäller att korrekt reproducera de biologiska egenskaperna hos HCC. Ändå finns det fortfarande hinder att övervinna när det gäller effektiviteten av organoidetablering, klonal dynamik och de begränsningar som är inneboende i organoidodlingstekniker. Genom att ta itu med dessa utmaningar kan användbarheten av HCC-organoidmodeller för att förstå sjukdomen och främja läkemedelsutveckling ökas ytterligare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China (82122048; 82003773; 82203380) och Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A.
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A.
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
