Summary
Vi gir en omfattende oversikt og forbedring av eksisterende protokoller for organoiddannelse av hepatocellulært karsinom (HCC), som omfatter alle stadier av organoiddyrking. Dette systemet fungerer som en verdifull modell for identifisering av potensielle terapeutiske mål og vurdering av legemiddelkandidateffektivitet.
Abstract
Hepatocellulært karsinom (HCC) er en svært utbredt og dødelig svulst over hele verden, og dens sene oppdagelse og mangel på effektive spesifikke terapeutiske midler nødvendiggjør videre forskning på patogenesen og behandlingen. Organoider, en ny modell som ligner innfødt tumorvev og kan dyrkes in vitro, har fått betydelig interesse de siste årene, med mange rapporter om utvikling av organoidmodeller for leverkreft. I denne studien har vi lykkes med å optimalisere prosedyren og etablert en kulturprotokoll som muliggjør dannelse av større HCC-organoider med stabile passasje- og kulturforhold. Vi har omfattende skissert hvert trinn i prosedyren, som dekker hele prosessen med HCC-vevsdissosiasjon, organoid plating, kultur, passaging, kryopreservering og gjenopplivning, og gitt detaljerte forholdsregler i dette papiret. Disse organoider utviser genetisk likhet med det opprinnelige HCC-vevet og kan brukes til forskjellige applikasjoner, inkludert identifisering av potensielle terapeutiske mål for svulster og påfølgende legemiddelutvikling.
Introduction
Hepatocellulært karsinom (HCC), en utbredt og omfattende mangfoldig svulst1, har fått betydelig oppmerksomhet i det medisinske samfunnet. Tilstedeværelsen av avstamningsplastisitet og betydelig heterogenitet i HCC antyder at tumorceller som stammer fra forskjellige pasienter og til og med forskjellige lesjoner hos samme pasient, kan manifestere forskjellige molekylære og fenotypiske egenskaper, og dermed presentere formidable hindringer i utviklingen av innovative terapeutiske tilnærminger 2,3,4,5 . Det er derfor et tvingende behov for økt forståelse av de biologiske egenskapene og mekanismene for legemiddelresistens i HCC for å informere formuleringen av mer effektive behandlingsstrategier.
I de siste tiårene har forskere dedikert sin innsats til utvikling av in vitro-modeller med det formål å studere HCC 3,4. Til tross for noen fremskritt, fortsetter begrensningene. Disse modellene omfatter en rekke teknikker, for eksempel bruk av cellelinjer, primære celler og pasientavledede xenotransplantater (PDX). Cellelinjer fungerer som in vitro-modeller for langsiktig kultur av tumorceller oppnådd fra HCC-pasienter, og tilbyr fordelene med bekvemmelighet og lett ekspansjon. Primære cellemodeller involverer direkte isolasjon og kultur av primære tumorceller fra pasientens tumorvev, og gir dermed en representasjon av biologiske egenskaper som ligner pasientene selv. PDX-modeller innebærer transplantasjon av pasientens tumorvev i mus, med sikte på mer trofast å simulere tumorvekst og respons. Disse modellene har vært medvirkende til HCC-forskning, men de har visse begrensninger, inkludert heterogeniteten til cellelinjer og manglende evne til å replikere in vivo-forhold fullt ut. Videre kan langvarig in vitro-dyrking føre til forringelse av cellenes opprinnelige egenskaper og funksjon, noe som gir utfordringer med å nøyaktig representere de biologiske egenskapene til HCC. I tillegg er bruken av PDX-modeller både tidkrevende og kostbar3.
For å løse disse begrensningene og mer nøyaktig replikere de fysiologiske egenskapene til HCC, har bruken av organoidteknologi blitt introdusert som en lovende forskningsplattform som er i stand til å overgå tidligere begrensninger. Organoider, som er tredimensjonale cellemodeller dyrket in vitro, har evnen til å replikere strukturen og funksjonaliteten til faktiske organer. I HCC-sammenheng eksisterer det imidlertid visse utfordringer med å etablere organoide modeller. Disse utfordringene inkluderer utilstrekkelig detaljerte beskrivelser av HCC-organoidkonstruksjonsprosedyrer, mangel på omfattende protokoller for hele prosessen med HCC-organoidkonstruksjon, og den typisk lille størrelsen på dyrkede organoider 6,7,8. I lys av de typisk begrensede dimensjonene av dyrkede organoider, forsøkte vi å takle disse utfordringene gjennom utviklingen av en omfattende protokoll som omfatter hele HCC-organoidkonstruksjonen6. Denne protokollen omfatter vevsdissosiasjon, organoid plating, kultur, passasje, kryopreservering og gjenopplivning. Ved å optimalisere de prosessuelle trinnene og raffinere sammensetningen av kulturmediet, har vi lykkes med å etablere HCC-organoidmodeller som er i stand til vedvarende vekst og langsiktig passasje 6,8. I de påfølgende avsnittene vil en omfattende redegjørelse for de operasjonelle vanskelighetene og relevante faktorer involvert i konstruksjonen av HCC-organoider bli presentert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humanbiopsert vev ble innhentet fra den respektive pasienten ved Affiliated Cancer Hospital og Institute of Guangzhou Medical University, og informert samtykke ble innhentet fra pasientene. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen.
1. Etablering av pasientavledede HCC-organoider fra kirurgiske prøver
MERK: Etableringen av HCC-organoider omfatter ulike stadier, nemlig vevsdissosiasjon, organoidbelegg, kultur, passasje, kryopreservering og gjenopplivning. Prosessen med vevsdissosiasjon krever en varighet på 2 timer, mens såing av organoider på en tallerken tar ca. 40 minutter. Etter dette gjennomgår den første generasjonen av HCC-organoider en kulturperiode på 10-14 dager ved bruk av HCC-isolasjonsmedium. Når en tilfredsstillende tetthet er oppnådd, utføres organoidpassasjer, noe som krever 1 time. Etterfølgende kulturer av organoidene opprettholdes deretter ved bruk av HCC-ekspansjonsmedium i 7-10 dager, som kan variere avhengig av organoidernes veksthastighet og tilstand.
- Vev dissosiasjon
- Forberedelse av forsyninger og materialer
- Samle 1-2 cm3 HCC-vev fra pasienter som ikke har fått noen tidligere lokal eller systemisk behandling før operasjonen. Etter kirurgisk reseksjon skal vevet holdes ved 4 °C i vevskonserveringsløsning (tab 1) inntil behandling.
MERK: Ferske vevsprøver av høy kvalitet er avgjørende for vellykket etablering av organoider. Det er viktig å behandle prøver raskt, ideelt innen 1-4 timer etter kirurgisk reseksjon for å opprettholde vevets levedyktighet. Utfør alle påfølgende prosedyrer i et aseptisk miljø ved bruk av sterile materialer og reagenser. - Forvarm overflatecellekulturplater med ultralav tilknytning (24 brønner) i 1 time i en inkubator ved 37 °C. Tine det frosne membranekstraktet fra kjelleren (BME) over natten ved 4 °C til rett før bruk.
MERK: For å sikre fullstendig tining av BME, må den legges på is i minst 3 timer. Fullstendig smelting av BME er avgjørende for vellykket organoidkultur i de påfølgende trinnene. - Før bruk, sørg for at fordøyelsessystemet (tabell 1) varmes opp til en temperatur på 37 °C.
MERK: Tilbered fordøyelsesløsningen på nytt i et aseptisk miljø og bruk den omgående.
- Samle 1-2 cm3 HCC-vev fra pasienter som ikke har fått noen tidligere lokal eller systemisk behandling før operasjonen. Etter kirurgisk reseksjon skal vevet holdes ved 4 °C i vevskonserveringsløsning (tab 1) inntil behandling.
- Flyt for organisatorisk behandling
- I et laminært strømningskabinett kutter du tumorvevet i små biter (0,5-1 mm3) ved hjelp av kirurgisk saks på en petriskål. Overfør det klippede vevet til et 15 ml konisk rør og tilsett 5-10 ml basalmedium (tabell 1).
MERK: Basalmediet (tabell 1) kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned. - Bruk en barotrop pipette til å vaske bort så mye blod som mulig og la det stå i 1-2 minutter for å fjerne noe av supernatanten, inkludert blodceller og flytende fettpropper. Gjenta denne prosedyren to ganger.
- Sentrifuger blandingen ved 300 × g i 5 minutter ved romtemperatur, og fjern forsiktig supernatanten. Tilsett 5 ml av den forvarmede fordøyelsesløsningen (tabell 1) til det trimmede vevet.
- Roter tuben ved 37 °C for fordøyelsen.
- Etter 30 minutter med innledende fordøyelse, se etter små klynger av celler under mikroskopet. Sjekk hvert 5-10 minutt for å unngå overfordøyelse.
MERK: Tiden som kreves for vevsfordøyelse vil avhenge av størrelsen og typen vev. Vev fordøyelse bør ikke overstige 90 min. Overfordøyd vev vil vises under mikroskopet som et stort ark med individuelle celler. Det riktige nivået av fordøyelse indikeres av det faktum at de fleste av disse er celleklynger og har et druelignende utseende. - Stopp fordøyelsen ved å tilsette kaldt basalmedium (tabell 1) og filtrer inn i et nytt 50 ml rør med et 100 μm cellefilter. Tilsett kaldt basalmedium til et volum på 50 ml.
- Sentrifuger cellene ved 2 × g i 10 minutter ved 8 °C. Fjern forsiktig supernatanten og resuspender pelleten ved å tilsette ytterligere 50 ml kaldt basalmedium (tabell 1). Gjenta dette trinnet to ganger.
MERK: Sentrifugering med lav hastighet brukes til å tillate småcelleklynger å slå seg ned, mens blodceller og cellerester fortsatt er suspendert i supernatanten; Prosessen gjentas flere ganger for å oppnå en relativt ren vevscellemasse.
- I et laminært strømningskabinett kutter du tumorvevet i små biter (0,5-1 mm3) ved hjelp av kirurgisk saks på en petriskål. Overfør det klippede vevet til et 15 ml konisk rør og tilsett 5-10 ml basalmedium (tabell 1).
- Forberedelse av forsyninger og materialer
- Organoid plating
- Etter den andre vasken, fjern så mye av supernatanten som mulig og resuspender ønsket antall celler (1000-5000 celler per brønn på en 24-brønnsplate) i riktig BME for plettering.
MERK: Oppbevar alltid BME ved 4 °C før bruk. - Legg til BME og suspender småcelleklynger i avansert DMEM/F-12 ved å legge til BME og pipettere forsiktig opp og ned til celleaggregatene er fullstendig suspendert. Kontroller konsentrasjonen av BME mellom 30% og 50%.
- Frø 50 μL BME-dråper blandet med celleklynger i midten av 24-brønnkulturplater.
MERK: Så langt som mulig, ikke la dråpene spre seg til sideveggen på brønnplaten. Sideveggen til lavadsorpsjonsplaten er ikke i lavadsorpsjonstilstand, og kontakt mellom dråpene og sidevæggen vil føre til vedheft, noe som ikke bidrar til den etterfølgende inkubasjonen. - La platene med de tilsatte dråpene stivne ved 37 °C i 20 minutter. Ved slutten av inkubasjonen, tilsett 500 μL forvarmet medium (tabell 1) til hver brønn og inkuber i en celleinkubator ved 37 ° C.
- Etter den andre vasken, fjern så mye av supernatanten som mulig og resuspender ønsket antall celler (1000-5000 celler per brønn på en 24-brønnsplate) i riktig BME for plettering.
- Organoid kultur
- Oppdater kulturmediet (tabell 1) en gang hver 2-3 dag. I begynnelsen av dyrkingen dyrket HCC-organoidene i HCC-isolasjonsmedium (tab 1) i 2 uker.
- Etter 2 ukers inkubasjon med HCC isolasjonsmedium, erstatt mediet med HCC organoid ekspansjonsmedium (tabell 1) (lagret ved 4 °C i opptil 2 uker).
- Oppdater kulturmediet en gang hver 3.
- Etter 7-10 dager med dyrking med HCC-ekspansjonsmedium når organoiden har nådd riktig tetthet eller størrelse, initier eksperimentelle inngrep eller passasje eller lyofiliser organoider etter behov.
- Organoid passasje
- Forberedelse av forsyninger og materialer
- Forvarm overflatecellekulturplater med ultralav tilknytning (24 brønner) i 1 time i en inkubator ved 37 °C. Tine frossen BME over natten ved 4 °C til rett før bruk.
- Forvarm organoid høsteløsning og trypsinerstatning ved 37 °C i 30 minutter.
- Passasjeprosess
- Etter å ha fjernet kulturmediet fra brønnplaten, overfør organoidsuspensjonen til et 15 ml rør.
- Tilsett organoid høstingsløsning i henhold til mengden BME (500 μL organoid høstingsløsning per 50 μL BME) ved å skrape og pipette opp og ned med en 1000 μL pipettekon.
MERK: Unngå luftbobler gjennom hele prosessen for å forhindre tap av organoider, da tilstedeværelsen av luftbobler indikerer høyere pipetteringstrykk. - Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer BME forsiktig med en 1000 μL pipette og observer at BME er helt oppløst. Observer hvert 10. minutt til en klar organoidcelleklynge er observert, sentrifuge deretter ved 400 × g i 5 minutter ved romtemperatur og fjern så mye av supernatanten som mulig.
MERK: På dette stadiet kan organoiden fryses og bevares. - For enzymatisk fordøyelse av organoider, tilsett 1-5 ml av trypsinsubstitutten (i henhold til antall organoider) og inkuber ved 37 ° C i 2 minutter. Observer under mikroskopet graden av enzymatisk fordøyelse for å avgjøre om organoider dissocierer i små klynger på 2-10 celler; Hvis ikke, fortsett den enzymatiske fordøyelsen.
MERK: Overfordøyelse vil resultere i lysis av organoidcelleklynger i enkeltceller, redusere levedyktigheten og forlenge påfølgende kulturtid. - Tilsett passende volum kaldt basalmedium (tabell 1) for å stoppe fordøyelsen.
- Sentrifuger organoidene ved 400 × g i 5 minutter ved 8 °C; Fjern Supernatant så mye som mulig.
- Resuspender ønsket antall organoider (1000-5000 organoider per brønn på en 24-brønnsplate) i passende matrise for plettering. Følg de samme trinnene som i avsnitt 1.2.
MERK: Pletteringstettheten bør optimaliseres i henhold til veksthastigheten og størrelsen på organoidene. - Pass organoider hver 10. dag i forholdet 1: 3 eller 1: 4, avhengig av tettheten av organoid vekst.
- Forberedelse av forsyninger og materialer
- Organoid kryopreservering og gjenopplivning
- Kryopreservering av organoider
- Forbered lyofiliseringsrør, hvert rør sammenløpende med to brønner av en 24-brønnplate som inneholder organoider.
- Følg trinn 1.4.2.1 til 1.4.2.4 for organoid passasje for å oppnå organoider uten BME, og resuspender organoidene forsiktig ved å tilsette 500 μL / brønn av organoid lyofiliseringsløsning til en 24-brønnsplate.
MERK: Avhengig av organoidenes vekststatus og størrelse, anbefales det å kryobevare organoidene i kultur opp til tredje generasjon. - Overfør suspensjonen til lyofiliseringsrør og legg den i en gradientkjølt eske ved -80 °C. Etter gradientkjøling ved -80 °C i minst 24 timer, overfør rørene til flytende nitrogen for langtidslagring.
- Gjenoppliving av organoider
- Inkuber lyofiliserte rør i et vannbad på 37 °C og stopp inkubasjonen når bare en liten isblokk gjenstår.
- Sentrifuge ved 400 × g i 5 minutter ved 8 °C for å fjerne supernatanten helt.
- Følg pkt. 1.2 og 1.3 for senere operasjoner.
- Kryopreservering av organoider
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved implementering av ovennevnte prosedyre kan fremveksten av HCC-organoide sfæroider typisk observeres i løpet av 3 dager (figur 1). Figur 1A,B viser det etablerte HCC-organoidet, som raskt utvikler kompakte sfæroider preget av avrundede kanter og permeabel cytosol på den første etableringsdagen. Under veksten av HCC-organoider hadde bruken av forskjellige konsentrasjoner av BME forskjellige effekter på organoidernes veksthastighet. Vi dyrket to pasientavledede HCC-organoider i 10%, 30%, 50% og 100% av BME i 12 dager i HCC-ekspansjonsmedium (tabell 1) og fant at BME var intakt ved 30% og 50% og organoidene var nær i størrelse og hadde størst diameter ved disse BME-konsentrasjonene. Ved 10% BME var BME den mest fragmenterte, med et smalt rom for organoid vekst og den minste diameteren. Ved 100% BME var BME den mest intakte, men diameteren av organoider var i midten. Derfor anbefales det å kontrollere konsentrasjonen av BME ved 30-50% i HCC-organoidkultur (figur 2). Den prolifererende HCC-organoiden kan effektivt forplantes i samsvar med den foreskrevne protokollen, og oppnår en størrelse på over 500 μm i hver kultur etter tre generasjoner kultur (figur 3). Etterfølgende eksperimenter, inkludert legemiddelintervensjon og immunhistokjemisk farging, kan utføres ved oppnåelse av denne størrelsen. Ved hjelp av denne dyrkingsstrategien oppnådde vi betydelig vekst av HCC-organoider, og nådde størrelser på over 1000 μm i løpet av en 20-dagers kulturperiode (figur 4). Immunhistokjemisk farging av både HCC-organoider og paret tumorvev viste likheter i uttrykket av markørgener (figur 5).
Figur 1 HCC-organoider utledet fra pasienters kirurgiske vev. (A,B) Representative bilder av robuste HCC-organoidkulturer på første dag av plating. (C,D) HCC organoidkulturer etter 5 dager med dyrking. Skalastenger = 500 μm (A,C), 250 μm (B,D). Forkortelse: HCC = hepatocellulært karsinom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: For å undersøke veksten av HCC-organoidmodeller ved forskjellige BME-konsentrasjoner. HCC-organoider A og B ble dyrket ved samme plantetetthet i 12 dager i 10%, 30%, 50% og 100% BME ved bruk av HCC-ekspansjonsmedium (tabell 1). Skalastenger = 1000 μm (A), 250 μm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: HCC-organoider ved langtidsforsterkning. (A,B) Representative bilder av HCC-organoider på den tiende dagen av passasjen 8. Skala bar = 500 μm (A), 250 μm (B). Forkortelse: HCC = hepatocellulært karsinom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Maksimal størrelse på HCC-organoider. Representative bilder av HCC-organoider i en 20-dagers kulturperiode i passasje 8 . Skala bar = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Histopatologiske egenskaper ved HCC-organoider og parede tumorvev. Ekspresjonen av genmarkører for HCC-organoider og parede tumorvev, HCC-markør AFP, differensierte hepatocyttmarkører HNF4A og ALB, duktale markører SOX9 og EPCAM, og gallemarkør KRT19 ble påvist ved immunhistokjemi. Skala bar = 100 μm. Forkortelser: AFP = Alpha Fetoprotein; HNF4A = hepatocytt nukleær faktor 4 alfa; ALB = albumin; SOX9 = SRY-boks transkripsjonsfaktor 9; EPCAM = epitelcelleadhesjonsmolekyl; KRT19 = Keratin 19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammensetning av medier og løsninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En bemerkelsesverdig fordel med pasientavledede organoidmodeller ligger i deres evne til trofast å replikere de biologiske egenskapene til svulster, som omfatter vevstruktur og genomisk landskap. Disse modellene viser et bemerkelsesverdig nivå av nøyaktighet og speiler effektivt heterogeniteten og progresjonen av svulster, selv over lengre perioder med dyrking 6,8,9. Gjennom bruken av denne raffinerte organoidkulturprotokollen har vi effektivt etablert pasientavledede HCC-organoidmodeller, som legger til rette for vedvarende vekst in vitro, samt evnen til å kryobevare og deretter gjenopplive organoider etter behov for eksperimentelle formål. I forhold til foregående protokoller viser disse organoidene forbedrede vekstrater og er i stand til å oppnå større dimensjoner i kulturen. Deretter utsatte vi de veletablerte organoidene for antistoffkoblede legemidler avledet fra forhåndsscreenede potensielle onkogene mål, noe som førte til bemerkelsesverdige terapeutiske resultater som samsvarer med in vivo PDX dyremodeller10,11.
Målet med denne studien var å forbedre manglene i tidligere HCC-organoide etableringsprotokoller, noe som resulterte i dannelsen av større HCC-organoider under stabile passasje- og kulturforhold. Vi optimaliserte konsentrasjonen av BME for å forbedre vekstraten til organoider samtidig som vi reduserte kostnadene ved eksperimentet; lagt til en viktig faktor, CHIR99021, til den opprinnelige kulturformelen, som kan fremme selvfornyelse av stamceller i organoider og forbedre spredning av organoid; forbedret fjerningsmetoden for BME, fra den opprinnelige mekaniske separasjonsmetoden til bruk av en spesiell høstingsløsning, for å øke mengden organoid oppnådd og forbedre effektiviteten; supplert operasjonstrinnene for organoid kryopreservering og gjenopplivning, konstruerte hele prosessen med HCC-organoidkultur. Med denne organoidkulturprotokollen er det mulig å oppnå en gjennomsnittlig organoidstørrelse på 800 μm i en enkelt 20-dagers kulturperiode, med noen få robuste HCC-organoider som vokser til over 1000 μm. Det endelige målet er å forbedre presisjonen av behandlingsstrategier for HCC og etablere en pålitelig modell og plattform for legemiddelutvikling. Disse anstrengelsene vil bidra til forbedring i HCC-pasientoverlevelse og levering av nye løsninger for å bekjempe legemiddelresistensutfordringer 11,12,13.
Det er imidlertid viktig å vurdere flere aspekter av diskursen. Primært oppstår en betydelig hindring fra den reduserte effekten av å etablere HCC-organoider, spesielt for pasienter med mellomliggende til avansert stadium HCC som har gjennomgått ulike terapeutiske inngrep, inkludert transkateterarteriell kjemoembolisering (TACE), kjemoterapi og målrettet terapi 4,5. Ofte blir tumoraktiviteten til utskårne HCC-prøver kompromittert, noe som fører til redusert suksessrate ved generering av organoider. I mellomtiden, i den forrige etableringen av HCC-organoider av andre lag, ble det funnet at det er en sammenheng mellom andelen prolifererende celler i svulsten, graden av differensiering av svulsten og etableringen av organoider 6,9. Derfor er oppnåelsen av en høy suksessrate i utviklingen av HCC-organoider intrikat knyttet til behandlingene som ble brukt før pasientens operasjon, samt behovet for tilleggsvurderinger av patologen etter at tumorvevet er oppnådd. I tillegg, mens organoider påstås å replikere heterogeniteten til HCC, er det en utfordring å skille om en organoid i kultur stammer fra en enslig celleklon eller omfatter en blanding av celler med distinkte genetiske profiler. Følgelig er ytterligere undersøkelser avgjørende for å øke vår forståelse av klonal dynamikk og genetisk mangfold innen HCC-organoider. Videre er det viktig å adressere de iboende begrensningene i dagens platebaserte organoidkulturteknikker. En bemerkelsesverdig begrensning er det begrensede vekstpotensialet til organoider. Kulturen av HCC-organoider Ved hjelp av denne protokollen er det mulig å oppnå diametre på mer enn 1000 μm. Imidlertid forekommer svertet nekrose i organoidens kjerneområde i de senere stadier av kulturen på grunn av utilstrekkelig nærings- og oksygenforsyning, noe som begrenser utviklingspotensialet til organoider. Derfor er det et presserende behov for å utarbeide strategier for å øke næringstilførsel og oksygenering i organoidkultursystemet.
Oppsummert presenterer pasientavledede organoidmodeller bemerkelsesverdige fordeler ved nøyaktig gjengivelse av de biologiske egenskapene til HCC. Likevel er det fortsatt hindringer som må overvinnes angående effekten av organoid etablering, klonal dynamikk og begrensningene som ligger i organoidkulturteknikker. Ved å møte disse utfordringene kan nytten av HCC-organoidmodeller for å forstå sykdommen og fremme legemiddelutviklingsarbeid økes ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82122048; 82003773; 82203380) og Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A.
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A.
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
