Summary
Vi giver et omfattende overblik og forfining af eksisterende protokoller for hepatocellulært carcinom (HCC) organoiddannelse, der omfatter alle stadier af organoid dyrkning. Dette system tjener som en værdifuld model til identifikation af potentielle terapeutiske mål og vurdering af lægemiddelkandidaters effektivitet.
Abstract
Hepatocellulært karcinom (HCC) er en meget udbredt og dødelig tumor over hele verden, og dens sene opdagelse og mangel på effektive specifikke terapeutiske midler nødvendiggør yderligere forskning i dets patogenese og behandling. Organoider, en ny model, der ligner naturligt tumorvæv og kan dyrkes in vitro, har fået betydelig interesse i de senere år med adskillige rapporter om udviklingen af organoidmodeller for leverkræft. I denne undersøgelse har vi med succes optimeret proceduren og etableret en kulturprotokol, der muliggør dannelsen af større HCC-organoider med stabile passerings- og dyrkningsbetingelser. Vi har omfattende skitseret hvert trin i proceduren, der dækker hele processen med HCC-vævsdissociation, organoidplettering, kultur, passaging, kryopræservering og genoplivning og givet detaljerede forholdsregler i dette papir. Disse organoider udviser genetisk lighed med de oprindelige HCC-væv og kan anvendes til forskellige applikationer, herunder identifikation af potentielle terapeutiske mål for tumorer og efterfølgende lægemiddeludvikling.
Introduction
Hepatocellulært carcinom (HCC), en udbredt og omfattende forskelligartet tumor1, har fået stor opmærksomhed inden for det medicinske samfund. Tilstedeværelsen af afstamningsplasticitet og betydelig heterogenitet i HCC antyder, at tumorceller, der stammer fra forskellige patienter og endda forskellige læsioner inden for samme patient, kan manifestere forskellige molekylære og fænotypiske træk og derved udgøre formidable hindringer for udviklingen af innovative terapeutiske tilgange 2,3,4,5 . Derfor er der et bydende behov for øget forståelse af de biologiske egenskaber og mekanismer for lægemiddelresistens i HCC for at informere formuleringen af mere effektive behandlingsstrategier.
I de seneste årtier har forskere dedikeret deres indsats til udvikling af in vitro-modeller med det formål at studere HCC 3,4. På trods af nogle fremskridt er der stadig begrænsninger. Disse modeller omfatter en række teknikker, såsom udnyttelse af cellelinjer, primære celler og patientafledte xenotransplantater (PDX). Cellelinjer tjener som in vitro-modeller til langsigtet dyrkning af tumorceller opnået fra HCC-patienter, hvilket giver fordelene ved bekvemmelighed og let ekspansion. Primære cellemodeller involverer direkte isolering og dyrkning af primære tumorceller fra patientens tumorvæv, hvilket giver en repræsentation af biologiske egenskaber, der ligner patienterne selv. PDX-modeller indebærer transplantation af patientens tumorvæv i mus med det formål mere trofast at simulere tumorvækst og respons. Disse modeller har været medvirkende til HCC-forskning, men de har visse begrænsninger, herunder heterogeniteten af cellelinjer og manglende evne til fuldt ud at replikere in vivo-forhold. Desuden kan langvarig in vitro-dyrkning resultere i forringelse af cellernes oprindelige egenskaber og funktionaliteter, hvilket giver udfordringer med nøjagtigt at repræsentere HCC's biologiske egenskaber. Derudover er brugen af PDX-modeller både tidskrævende og dyr3.
For at løse disse begrænsninger og mere præcist replikere HCC's fysiologiske egenskaber er brugen af organoidteknologi blevet introduceret som en lovende forskningsplatform, der er i stand til at overgå tidligere begrænsninger. Organoider, som er tredimensionelle cellemodeller dyrket in vitro, har evnen til at replikere strukturen og funktionaliteten af faktiske organer. I forbindelse med HCC er der dog visse udfordringer med at etablere organoidmodeller. Disse udfordringer omfatter utilstrækkeligt detaljerede beskrivelser af HCC-organoidkonstruktionsprocedurer, mangel på omfattende protokoller for hele processen med HCC-organoidkonstruktion og den typisk lille størrelse af dyrkede organoider 6,7,8. I lyset af de typisk begrænsede dimensioner af dyrkede organoider bestræbte vi os på at tackle disse udfordringer gennem udviklingen af en omfattende protokol, der omfatter hele HCC-organoidkonstruktionen6. Denne protokol omfatter vævsdissociation, organoidplettering, kultur, passering, kryopræservering og genoplivning. Ved at optimere de proceduremæssige trin og forfine sammensætningen af kulturmediet har vi med succes etableret HCC-organoidmodeller, der er i stand til vedvarende vækst og langsigtet passering 6,8. I de efterfølgende afsnit vil en omfattende redegørelse for de operationelle forviklinger og relevante faktorer, der er involveret i konstruktionen af HCC-organoider, blive præsenteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human-biopsied væv blev opnået fra den respektive patient på Affiliated Cancer Hospital og Institute of Guangzhou Medical University, og informeret samtykke blev opnået fra patienterne. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter, der anvendes i denne protokol.
1. Etablering af patientafledte HCC-organoider fra kirurgiske prøver
BEMÆRK: Etableringen af HCC-organoider omfatter forskellige stadier, nemlig vævsdissociation, organoidplettering, kultur, passering, kryopræservering og genoplivning. Processen med vævsdissociation kræver en varighed på 2 timer, mens såning af organoider på en plade tager ca. 40 minutter. Herefter gennemgår den første generation af HCC-organoider en dyrkningsperiode på 10-14 dage ved anvendelse af HCC-isolationsmedium. Når en tilfredsstillende tæthed er opnået, udføres organoidpassager, hvilket kræver 1 time. Efterfølgende kulturer af organoiderne opretholdes derefter ved hjælp af HCC-ekspansionsmedium i 7-10 dage, hvilket kan variere afhængigt af organoidernes væksthastighed og tilstand.
- Vævsdissociation
- Forberedelse af forsyninger og materialer
- Opsaml 1-2 cm3 HCC-væv fra patienter, der ikke tidligere har modtaget lokal eller systemisk behandling før operationen. Efter kirurgisk resektion opbevares vævet ved 4 °C i vævskonserveringsopløsning (tabel 1) indtil behandling.
BEMÆRK: Friske vævsprøver af høj kvalitet er afgørende for en vellykket etablering af organoider. Det er vigtigt at behandle prøver hurtigt, ideelt inden for 1-4 timer efter kirurgisk resektion for at opretholde vævets levedygtighed. Udfør alle efterfølgende procedurer i et aseptisk miljø ved hjælp af sterile materialer og reagenser. - Forvarm overfladecellekulturplader med ultralav fastgørelse (24 huller) i 1 time i en inkubator ved 37 °C. Optø det frosne kældermembranekstrakt (BME) natten over ved 4 °C indtil lige før brug.
BEMÆRK: For at sikre fuldstændig optøning af BME skal den lægges på is i mindst 3 timer. Fuldstændig smeltning af BME er afgørende for vellykket organoidkultur i de efterfølgende trin. - Før brug skal det sikres, at nedbrydningsopløsningen (tabel 1) opvarmes til en temperatur på 37 °C.
BEMÆRK: Forbered fordøjelsesopløsningen frisk i et aseptisk miljø og brug den straks.
- Opsaml 1-2 cm3 HCC-væv fra patienter, der ikke tidligere har modtaget lokal eller systemisk behandling før operationen. Efter kirurgisk resektion opbevares vævet ved 4 °C i vævskonserveringsopløsning (tabel 1) indtil behandling.
- Organisatorisk behandlingsflow
- I et laminært strømningsskab skæres tumorvævet i små stykker (0,5-1 mm3) ved hjælp af kirurgisk saks på en petriskål. Overfør det afklippede væv til et 15 ml konisk rør og tilsæt 5-10 ml basalmedium (tabel 1).
BEMÆRK: Basalmediet (tabel 1) kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned. - Brug en barotropisk pipette til at vaske så meget blod væk som muligt, og lad den stå i 1-2 minutter for at fjerne noget af supernatanten, herunder eventuelle blodlegemer og flydende fedtpropper. Gentag denne procedure to gange.
- Blandingen centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes forsigtigt. Der tilsættes 5 ml af den forvarmede fordøjelsesopløsning (tabel 1) til det trimmede væv.
- Drej røret ved 37 °C for fordøjelsen.
- Efter 30 minutters indledende fordøjelse skal du kigge efter små klynger af celler under mikroskopet. Kontroller hvert 5-10 minut for at undgå overfordøjelse.
BEMÆRK: Den tid, der kræves til vævsfordøjelse, afhænger af vævets størrelse og type. Vævsfordøjelsen bør ikke overstige 90 min. Overfordøjet væv vises under mikroskopet som et stort ark af individuelle celler. Det passende fordøjelsesniveau er indikeret ved, at de fleste af disse er celleklynger og har et druelignende udseende. - Stop fordøjelsen ved at tilsætte koldt basalmedium (tabel 1) og filtrer i et nyt 50 ml rør med et 100 μm cellefilter. Tilsæt koldt basalmedium til et volumen på 50 ml.
- Cellerne centrifugeres ved 2 × g i 10 minutter ved 8 °C. Supernatanten fjernes forsigtigt, og pelletpen opslæmmes igen ved tilsætning af yderligere 50 ml koldt basalsubstrat (tabel 1). Gentag dette trin to gange.
BEMÆRK: Lavhastighedscentrifugering bruges til at lade små celleklynger slå sig ned, mens blodlegemer og cellerester stadig er suspenderet i supernatanten; Processen gentages flere gange for at opnå en relativt ren vævscellemasse.
- I et laminært strømningsskab skæres tumorvævet i små stykker (0,5-1 mm3) ved hjælp af kirurgisk saks på en petriskål. Overfør det afklippede væv til et 15 ml konisk rør og tilsæt 5-10 ml basalmedium (tabel 1).
- Forberedelse af forsyninger og materialer
- Organoid plettering
- Efter den anden vask fjernes så meget af supernatanten som muligt, og det ønskede antal celler (1.000-5.000 celler pr. hul i en plade med 24 huller) resuspenderes i den relevante BME til plettering.
BEMÆRK: Opbevar altid BME ved 4 °C før brug. - Tilføj BME, og suspender små celleklynger i Advanced DMEM/F-12 ved at tilføje BME og forsigtigt pipettere op og ned, indtil celleaggregaterne er helt suspenderet. Kontroller koncentrationen af BME mellem 30% og 50%.
- Frø 50 μL BME-dråber blandet med celleklynger i midten af 24-brønds kulturplader.
BEMÆRK: Lad så vidt muligt ikke dråberne sprede sig til brøndpladens sidevæg. Sidevæggen af lavadsorptionspladen er ikke i en lavadsorptionstilstand, og kontakt mellem dråberne og sidevæggen vil føre til vedhæftning, hvilket ikke er befordrende for den efterfølgende inkubation. - Lad pladerne med de tilsatte dråber størkne ved 37 °C i 20 minutter. Ved inkubationens afslutning tilsættes 500 μL forvarmet substrat (tabel 1) til hvert hul og inkuberes i en celleinkubator ved 37 °C.
- Efter den anden vask fjernes så meget af supernatanten som muligt, og det ønskede antal celler (1.000-5.000 celler pr. hul i en plade med 24 huller) resuspenderes i den relevante BME til plettering.
- Organoid kultur
- Opdater kulturmediet (tabel 1) en gang hver 2-3 dage. I begyndelsen af kulturen dyrkes HCC-organoiderne i HCC-isolationsmedium (tabel 1) i 2 uger.
- Efter 2 ugers inkubation med HCC-isolationsmedium erstattes substratet med HCC-organoidekspansionsmedium (tabel 1) (opbevares ved 4 °C i op til 2 uger).
- Opdater kulturmediet en gang hver 3. dag.
- Efter 7-10 dages dyrkning med HCC-ekspansionsmedium, når organoiden har nået den passende tæthed eller størrelse, initieres eksperimentelle indgreb eller passage eller frysetørrede organoiderne efter behov.
- Organoid passaging
- Forberedelse af forsyninger og materialer
- Forvarm overfladecellekulturplader med ultralav fastgørelse (24 huller) i 1 time i en inkubator ved 37 °C. Optø frossen BME natten over ved 4 °C indtil lige før brug.
- Forvarm organoid høstopløsning og trypsin erstatning ved 37 °C i 30 minutter.
- Passaging proces
- Efter fjernelse af dyrkningsmediet fra brøndpladen overføres organoidsuspensionen til et 15 ml rør.
- Tilsæt organoid høstopløsning i henhold til mængden af BME (500 μL organoid høstopløsning pr. 50 μL BME) ved at skrabe og pipettere op og ned ved hjælp af en 1.000 μL pipettepistol.
BEMÆRK: Undgå luftbobler under hele processen for at forhindre tab af organoider, da tilstedeværelsen af luftbobler indikerer højere pipetteringstryk. - Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Smør forsigtigt BME med en 1.000 μL pipette og observer, at BME er helt opløst. Hvert 10. minut observeres, indtil der observeres en klar organoid celleklynge, centrifugeres derefter ved 400 × g i 5 minutter ved stuetemperatur og fjerner så meget af supernatanten som muligt.
BEMÆRK: På dette stadium kan organoiden fryses og bevares. - Til enzymatisk fordøjelse af organoider tilsættes 1-5 ml trypsinerstatning (alt efter antallet af organoider) og inkuberes ved 37 °C i 2 minutter. Overhold under mikroskopet graden af enzymatisk fordøjelse for at bestemme, om organoiderne dissocieres i små klynger på 2-10 celler; Hvis ikke, fortsæt den enzymatiske fordøjelse.
BEMÆRK: Overfordøjelse vil resultere i lysering af organoide celleklynger i enkeltceller, hvilket reducerer deres levedygtighed og forlænger efterfølgende dyrkningstid. - Tilsæt den passende mængde koldt basalmedium (tabel 1) for at stoppe fordøjelsen.
- Organoiderne centrifugeres ved 400 × g i 5 minutter ved 8 °C; Supernatanten fjernes så meget som muligt.
- Resuspender det ønskede antal organoider (1.000-5.000 organoider pr. brønd i en 24-brøndplade) i den passende matrix til plettering. Følg de samme trin som i afsnit 1.2.
BEMÆRK: Pletteringstætheden skal optimeres i henhold til organoidernes væksthastighed og størrelse. - Passage organoiderne hver 10. dag i et forhold på 1: 3 eller 1: 4 afhængigt af tætheden af organoidvækst.
- Forberedelse af forsyninger og materialer
- Organoid kryopræservering og genoplivning
- Kryopræservering af organoider
- Forbered frysetørringsrør, hvert rør flyder sammen med to brønde i en 24-brøndplade indeholdende organoider.
- Følg trin 1.4.2.1 til 1.4.2.4 for organoidpassaging for at opnå organoider uden BME, og resuspender forsigtigt organoiderne ved at tilsætte 500 μL / hul organoid lyofiliseringsopløsning til en 24-brøndplade.
BEMÆRK: Afhængigt af organoidernes vækststatus og størrelse anbefales det at kryopræservere organoiderne i kultur op til tredje generation. - Suspensionen overføres til frysetørringsrør og anbringes i en gradientkølet kasse ved -80 °C. Efter gradientafkøling ved -80 °C i mindst 24 timer overføres glassene til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
- Genoplivning af organoider
- Der inkuberes frysetørrede rør i et 37 °C vandbad, og inkubationen stoppes, når der kun er en lille isblok tilbage.
- Der centrifugeres ved 400 × g i 5 minutter ved 8 °C for at fjerne supernatanten fuldstændigt.
- Følg pkt. 1.2 og 1.3 for efterfølgende operationer.
- Kryopræservering af organoider
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter implementering af ovennævnte procedure observeres fremkomsten af HCC-organoidsfæroider typisk inden for et tidsrum på 3 dage (figur 1). Figur 1A, B viser den etablerede HCC-organoid, som straks udvikler kompakte sfæroider karakteriseret ved afrundede kanter og permeabel cytosol på den første etableringsdag. Under væksten af HCC-organoider havde brugen af forskellige koncentrationer af BME forskellige virkninger på organoidernes væksthastighed. Vi dyrkede to patientafledte HCC-organoider i 10%, 30%, 50% og 100% af BME i 12 dage i HCC-ekspansionsmedium (tabel 1) og fandt, at BME var intakt ved 30% og 50%, og organoiderne var tæt på størrelse og havde den største diameter ved disse BME-koncentrationer. Ved 10% BME var BME den mest fragmenterede med et smalt rum til organoid vækst og den mindste diameter. Ved 100% BME var BME den mest intakte, men organoidernes diameter var i midten. Det anbefales derfor at kontrollere koncentrationen af BME ved 30-50% i HCC-organoidkultur (figur 2). Den prolifererende HCC-organoid kan formeres effektivt i overensstemmelse med den foreskrevne protokol og opnå en størrelse på over 500 μm i hver kultur efter tre generationers kultur (figur 3). Efterfølgende forsøg, herunder lægemiddelintervention og immunohistokemisk farvning, kan udføres efter opnåelse af denne størrelse. Ved hjælp af denne dyrkningsstrategi opnåede vi en betydelig vækst af HCC-organoider og nåede størrelser på over 1.000 μm inden for en 20-dages dyrkningsperiode (figur 4). Immunohistokemisk farvning af både HCC-organoider og parrede tumorvæv afslørede ligheder i ekspressionen af markørgener (figur 5).
Figur 1: HCC-organoider afledt af patienters kirurgiske væv. (A,B) Repræsentative billeder af robuste HCC-organoidkulturer på pletteringens første dag. (C,D) HCC organoid kulturer efter 5 dages dyrkning. Skalastænger = 500 μm (A,C), 250 μm (B,D). Forkortelse: HCC = hepatocellulært karcinom. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: At undersøge væksten af HCC-organoidmodeller ved forskellige BME-koncentrationer. HCC-organoider A og B blev dyrket med samme plantetæthed i 12 dage i 10%, 30%, 50% og 100% BME ved hjælp af HCC-ekspansionsmedium (tabel 1). Skalastænger = 1.000 μm (A), 250 μm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: HCC-organoider i langtidsforstærkning. (A,B) Repræsentative billeder af HCC-organoider på den tiende dag i passage 8. Skalabjælke = 500 μm (A), 250 μm (B). Forkortelse: HCC = hepatocellulært karcinom. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Maksimal størrelse af HCC-organoider. Repræsentative billeder af HCC-organoider i en 20-dages kulturperiode i passage 8 . Skalabjælke = 250 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Histopatologiske egenskaber ved HCC-organoider og parrede tumorvæv. Ekspressionen af genmarkører for HCC-organoider og parrede tumorvæv, HCC-markør AFP, differentierede hepatocytmarkører HNF4A og ALB, duktale markører SOX9 og EPCAM og galdemarkør KRT19 blev påvist ved immunhistokemi. Skalabjælke = 100 μm. Forkortelser: AFP = Alpha Fetoprotein; HNF4A = hepatocyt nuklear faktor 4 alfa; ALB = albumin; SOX9 = SRY-Box transkriptionsfaktor 9; EPCAM = epitelcelleadhæsionsmolekyle; KRT19 = Keratin 19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammensætning af medier og opløsninger. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En bemærkelsesværdig fordel ved patientafledte organoidmodeller ligger i deres evne til trofast at replikere tumorernes biologiske egenskaber, der omfatter vævsstruktur og genomisk landskab. Disse modeller viser et bemærkelsesværdigt niveau af nøjagtighed og afspejler effektivt heterogeniteten og progressionen af tumorer, selv over længere perioder med dyrkning 6,8,9. Gennem brugen af denne raffinerede organoidkulturprotokol har vi effektivt etableret patientafledte HCC-organoidmodeller, der letter vedvarende vækst in vitro samt evnen til at kryopræservere og efterfølgende genoplive organoider efter behov til eksperimentelle formål. I sammenligning med tidligere protokoller udviser disse organoider forbedrede vækstrater og er i stand til at opnå større dimensioner i kultur. Derefter udsatte vi de veletablerede organoider for antistofkoblede lægemidler afledt af præscreenede potentielle onkogene mål, hvilket førte til bemærkelsesværdige terapeutiske resultater, der stemmer overens med in vivo PDX-dyremodeller10,11.
Formålet med denne undersøgelse var at forbedre manglerne ved tidligere HCC-organoidetableringsprotokoller, hvilket resulterede i dannelsen af større HCC-organoider under stabile passage- og dyrkningsforhold. Vi optimerede koncentrationen af BME for at forbedre væksthastigheden af organoider og samtidig reducere omkostningerne ved eksperimentet; tilføjede CHIR99021 en vigtig faktor til den oprindelige kulturformel, som kan fremme selvfornyelsen af stamceller i organoider og øge spredningen af organoid; forbedrede fjernelsesmetoden for BME, fra den oprindelige mekaniske separationsmetode til brugen af en speciel høstopløsning, for at øge mængden af opnået organoid og forbedre effektiviteten; supplerede driftstrinnene med organoid kryopræservering og genoplivning, konstruerede hele processen med HCC organoid kultur. Med denne organoidkulturprotokol er det muligt at opnå en gennemsnitlig organoidstørrelse på 800 μm i en enkelt 20-dages dyrkningsperiode, hvor nogle få robuste HCC-organoider vokser til over 1.000 μm. Det endelige mål er at forbedre præcisionen af behandlingsstrategier for HCC og etablere en pålidelig model og platform for lægemiddeludvikling. Disse bestræbelser vil bidrage til forbedring af HCC-patienters overlevelsesrater og tilvejebringelse af nye løsninger til bekæmpelse af lægemiddelresistensudfordringer 11,12,13.
Det er dog bydende nødvendigt at overveje flere aspekter af diskursen. Primært opstår en betydelig hindring fra den nedsatte effekt af etablering af HCC-organoider, især for patienter hos patienter med HCC i mellem- til avanceret stadium, der har gennemgået forskellige terapeutiske interventioner, herunder transkateterarteriel kemoembolisering (TACE), kemoterapi og målrettet terapi 4,5. Ofte kompromitteres tumoraktiviteten af udskårne HCC-prøver, hvilket fører til en nedsat succesrate ved generering af organoider. I mellemtiden blev det i den tidligere etablering af HCC-organoider af andre hold konstateret, at der er en sammenhæng mellem andelen af prolifererende celler i tumoren, graden af differentiering af tumoren og etableringen af organoider 6,9. Derfor er opnåelsen af en høj succesrate i udviklingen af HCC-organoider indviklet bundet til de behandlinger, der anvendes forud for patientens operation, samt behovet for supplerende vurderinger af patologen, efter at tumorvævene er opnået. Derudover, mens organoider påstås at replikere heterogeniteten af HCC, udgør det en udfordring at skelne mellem, om en organoid i kultur stammer fra en ensom celleklon eller omfatter en blanding af celler med forskellige genetiske profiler. Derfor er yderligere undersøgelser afgørende for at øge vores forståelse af den klonale dynamik og genetiske mangfoldighed inden for HCC-organoider. Desuden er det bydende nødvendigt at tage fat på de iboende begrænsninger ved de nuværende pladebaserede organoidkulturteknikker. En bemærkelsesværdig begrænsning er organoidernes begrænsede vækstpotentiale. Kulturen af HCC-organoider ved hjælp af denne protokol er det muligt at opnå diametre på mere end 1.000 μm. I de senere stadier af kulturen forekommer imidlertid ofte sorte nekrose i organoidens kerneregion på grund af utilstrækkelig næringsstof- og iltforsyning, hvilket begrænser organoidernes udviklingspotentiale. Derfor er der et presserende behov for at udarbejde strategier, der sigter mod at forbedre næringsstoftilførsel og iltning inden for organoidkultursystemet.
Sammenfattende giver patientafledte organoidmodeller bemærkelsesværdige fordele ved nøjagtigt at gengive HCC's biologiske egenskaber. Ikke desto mindre er der stadig hindringer, der skal overvindes med hensyn til effektiviteten af organoidetablering, klonal dynamik og de begrænsninger, der er forbundet med organoidkulturteknikker. Ved at løse disse udfordringer kan nytten af HCC-organoidmodeller til forståelse af sygdommen og fremme af lægemiddeludviklingsbestræbelser øges yderligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82122048; 82003773; 82203380) og Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A.
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A.
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
