Summary
Hepatoselüler karsinom (HCC) organoid oluşumu için organoid kültivasyonun tüm aşamalarını kapsayan mevcut protokollere kapsamlı bir genel bakış ve iyileştirme sunuyoruz. Bu sistem, potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve ilaç adaylarının etkinliğinin değerlendirilmesi için değerli bir model görevi görmektedir.
Abstract
Hepatosellüler karsinom (HCC) dünya çapında oldukça yaygın ve ölümcül bir tümördür ve geç keşfi ve etkili spesifik terapötik ajanların eksikliği, patogenezi ve tedavisi ile ilgili daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Doğal tümör dokusuna çok benzeyen ve in vitro kültürlenebilen yeni bir model olan organoidler, karaciğer kanseri için organoid modellerin geliştirilmesine ilişkin çok sayıda raporla son yıllarda büyük ilgi görmüştür. Bu çalışmada, prosedürü başarılı bir şekilde optimize ettik ve stabil pasajlama ve kültür koşulları ile daha büyük boyutlu HCC organoidlerinin oluşumunu sağlayan bir kültür protokolü oluşturduk. Bu yazıda, HCC doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyon sürecinin tamamını kapsayan prosedürün her adımını kapsamlı bir şekilde özetledik ve ayrıntılı önlemler sağladık. Bu organoidler, orijinal HCC dokularına genetik benzerlik gösterir ve tümörler için potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve müteakip ilaç geliştirme dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.
Introduction
Yaygın ve çok çeşitli bir tümörolan hepatosellüler karsinom (HCC) 1, tıp camiasında büyük ilgi görmüştür. HCC'de soy plastisitesinin ve önemli heterojenliğin varlığı, çeşitli hastalardan kaynaklanan tümör hücrelerinin ve hatta aynı hastadaki farklı lezyonların farklı moleküler ve fenotipik özellikler gösterebileceğini ve böylece yenilikçi terapötik yaklaşımların ilerlemesinde zorlu engeller oluşturabileceğini düşündürmektedir 2,3,4,5 . Sonuç olarak, daha etkili tedavi stratejilerinin formülasyonunu bilgilendirmek için HCC'de ilaç direncinin biyolojik özelliklerinin ve mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç vardır.
Son yıllarda, araştırmacılar çabalarını HCC 3,4'ü incelemek amacıyla in vitro modellerin geliştirilmesine adamışlardır. Bazı gelişmelere rağmen, sınırlamalar devam etmektedir. Bu modeller, hücre hatlarının, birincil hücrelerin ve hastadan türetilen ksenogreftlerin (PDX) kullanımı gibi bir dizi tekniği kapsar. Hücre hatları, HCC hastalarından elde edilen tümör hücrelerinin uzun süreli kültürü için in vitro modeller olarak hizmet eder ve kolaylık ve kolay genişleme avantajları sunar. Primer hücre modelleri, primer tümör hücrelerinin hasta tümör dokularından doğrudan izolasyonunu ve kültürünü içerir, böylece hastaların kendilerine çok benzeyen biyolojik özelliklerin bir temsilini sağlar. PDX modelleri, tümör büyümesini ve yanıtını daha sadık bir şekilde simüle etmek amacıyla hasta tümör dokularının farelere nakledilmesini gerektirir. Bu modeller HCC araştırmalarında etkili olmuştur, ancak hücre hatlarının heterojenliği ve in vivo koşullarda tam olarak kopyalanamaması dahil olmak üzere belirli sınırlamalara sahiptirler. Ayrıca, uzun süreli in vitro kültivasyon, hücrelerin orijinal özelliklerinin ve işlevlerinin bozulmasına neden olabilir ve HCC'nin biyolojik özelliklerini doğru bir şekilde temsil etmede zorluklar ortaya çıkarabilir. Ek olarak, PDX modellerinin kullanımı hem zaman alıcı hem de maliyetlidir3.
Bu sınırlamaları ele almak ve HCC'nin fizyolojik özelliklerini daha doğru bir şekilde çoğaltmak için, organoid teknolojisinin kullanımı, önceki kısıtlamaları aşabilen umut verici bir araştırma platformu olarak tanıtılmıştır. İn vitro kültürlenmiş üç boyutlu hücre modelleri olan organoidler, gerçek organların yapısını ve işlevselliğini kopyalama yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, HCC bağlamında, organoid modellerin oluşturulmasında bazı zorluklar vardır. Bu zorluklar arasında HCC organoid yapım prosedürlerinin yeterince ayrıntılı olmayan açıklamaları, HCC organoid yapımının tüm süreci için kapsamlı protokollerin eksikliği ve tipik olarak küçük boyutlu kültürlenmiş organoidler 6,7,8 yer almaktadır. Kültürlenmiş organoidlerin tipik olarak sınırlı boyutları ışığında, HCC organoid yapısının tamamını kapsayan kapsamlı bir protokol geliştirerek bu zorlukların üstesinden gelmeye çalıştık6. Bu protokol doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyonu kapsar. Prosedürel adımları optimize ederek ve kültür ortamının bileşimini iyileştirerek, sürekli büyüme ve uzun vadeli geçiş yapabilen HCC organoid modellerini başarıyla kurduk 6,8. Sonraki bölümlerde, HCC organoidlerinin yapımında yer alan operasyonel karmaşıklıkların ve ilgili faktörlerin kapsamlı bir açıklaması sunulacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Guangzhou Tıp Üniversitesi'ne bağlı Kanser Hastanesi ve Enstitüsü'ndeki ilgili hastadan insan biyopsisi alınan dokular alındı ve hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Cerrahi örneklerden hasta kaynaklı HCC organoidlerinin oluşturulması
NOT: HCC organoidlerinin kurulması, doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyon gibi çeşitli aşamaları kapsar. Doku ayrışma işlemi 2 saatlik bir süre gerektirirken, organoidlerin bir plakaya tohumlanması yaklaşık 40 dakika sürer. Bunu takiben, HCC organoidlerinin ilk nesli, HCC izolasyon ortamı kullanılarak 10-14 günlük bir kültür periyoduna tabi tutulur. Tatmin edici bir yoğunluğa ulaşıldığında, 1 saat gerektiren organoid geçişler gerçekleştirilir. Organoidlerin müteakip kültürleri daha sonra 7-10 gün boyunca HCC genişleme ortamı kullanılarak korunur, bu da organoidlerin büyüme hızına ve durumuna bağlı olarak değişebilir.
- Doku ayrışması
- Sarf malzemeleri ve malzemelerin hazırlanması
- Operasyon öncesi daha önce herhangi bir lokal veya sistemik tedavi almamış hastalardan 1-2cm3 HCC dokusu toplayın. Cerrahi rezeksiyondan sonra, işleme kadar dokuyu doku koruma solüsyonunda (Tablo 1) 4 ° C'de tutun.
NOT: Organoidlerin başarılı bir şekilde oluşturulması için yüksek kaliteli taze doku örnekleri gereklidir. Doku canlılığını korumak için numunelerin derhal, ideal olarak cerrahi rezeksiyondan sonraki 1-4 saat içinde işlenmesi önemlidir. Sonraki tüm prosedürleri steril malzemeler ve reaktifler kullanarak aseptik bir ortamda gerçekleştirin. - Ultra düşük ataşman yüzeyli hücre kültürü plakalarını (24 oyuk) 37 °C'de bir inkübatörde 1 saat önceden ısıtın. Dondurulmuş bazal membran ekstraktını (BME) gece boyunca 4 °C'de kullanımdan hemen öncesine kadar çözdürün.
NOT: BME'nin tamamen çözülmesini sağlamak için en az 3 saat buz üzerine yerleştirilmelidir. BME'nin tamamen erimesi, sonraki adımlarda başarılı organoid kültürü için gereklidir. - Kullanmadan önce, sindirim solüsyonunun (Tablo 1) 37 °C'ye kadar ısıtıldığından emin olun.
NOT: Çürütme solüsyonunu aseptik bir ortamda taze olarak hazırlayın ve hemen kullanın.
- Operasyon öncesi daha önce herhangi bir lokal veya sistemik tedavi almamış hastalardan 1-2cm3 HCC dokusu toplayın. Cerrahi rezeksiyondan sonra, işleme kadar dokuyu doku koruma solüsyonunda (Tablo 1) 4 ° C'de tutun.
- Organizasyonel işlem akışı
- Laminer akış kabininde, bir Petri kabı üzerinde cerrahi makas kullanarak tümör dokusunu küçük parçalara (0,5-1mm3) kesin. Kırpılmış dokuyu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 5-10 mL bazal ortam ekleyin (Tablo 1).
NOT: Bazal ortam (Tablo 1) 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir. - Mümkün olduğunca fazla kanı yıkamak için barotropik bir pipet kullanın ve kan hücreleri ve yüzen yağ pıhtıları da dahil olmak üzere süpernatantın bir kısmını çıkarmak için 1-2 dakika bekletin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın.
- Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Kesilmiş dokuya 5 mL önceden ısıtılmış sindirim solüsyonu (Tablo 1) ekleyin.
- Sindirim için tüpü 37 °C'de döndürün.
- 30 dakikalık ilk sindirimden sonra, mikroskop altında küçük hücre kümeleri arayın. Aşırı sindirimi önlemek için her 5-10 dakikada bir kontrol edin.
NOT: Doku sindirimi için gereken süre, dokunun boyutuna ve türüne bağlı olacaktır. Doku sindirimi 90 dakikayı geçmemelidir. Aşırı sindirilmiş doku, mikroskop altında büyük bir hücre tabakası olarak görünecektir. Uygun sindirim seviyesi, bunların çoğunun hücre kümeleri olması ve üzüm benzeri bir görünüme sahip olması ile gösterilir. - Soğuk bazal ortam ekleyerek sindirimi durdurun (Tablo 1) ve 100 μm hücre filtreli yeni bir 50 mL tüpe süzün. 50 mL'lik bir hacme soğuk bazal ortam ekleyin.
- Hücreleri 2 × g'da 8 ° C'de 10 dakika santrifüj edin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 50 mL daha soğuk bazal ortam ekleyerek peleti yeniden süspanse edin (Tablo 1). Bu adımı iki kez tekrarlayın.
NOT: Düşük hızlı santrifüjleme, küçük hücre kümelerinin yerleşmesine izin vermek için kullanılırken, kan hücreleri ve hücre kalıntıları hala süpernatantta asılı kalır; Nispeten saf bir doku hücresi kütlesi elde etmek için işlem birkaç kez tekrarlanır.
- Laminer akış kabininde, bir Petri kabı üzerinde cerrahi makas kullanarak tümör dokusunu küçük parçalara (0,5-1mm3) kesin. Kırpılmış dokuyu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 5-10 mL bazal ortam ekleyin (Tablo 1).
- Sarf malzemeleri ve malzemelerin hazırlanması
- Organoid kaplama
- İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı mümkün olduğunca çıkarın ve istenen sayıda hücreyi (24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1.000-5.000 hücre) kaplama için uygun BME'de yeniden süspanse edin.
NOT: BME'yi kullanmadan önce daima 4 °C'de tutun. - BME ekleyin ve BME ekleyerek ve hücre agregaları tamamen süspanse olana kadar hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek Gelişmiş DMEM/F-12'de küçük hücre kümelerini askıya alın. BME konsantrasyonunu %30 ile %50 arasında kontrol edin.
- Tohum 50 μL BME damlacıkları, 24 oyuklu kültür plakalarının merkezinde hücre kümeleri ile karıştırılır.
NOT: Mümkün olduğunca, damlacıkların kuyu plakasının yan duvarına yayılmasına izin vermeyin. Düşük adsorpsiyonlu plakanın yan duvarı düşük adsorpsiyon durumunda değildir ve damlacıklar ile yan duvar arasındaki temas, sonraki inkübasyona elverişli olmayan yapışmaya yol açacaktır. - Eklenen damlacıkların bulunduğu plakaların 37 °C'de 20 dakika katılaşmasına izin verin. İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 500 μL önceden ısıtılmış ortam (Tablo 1) ekleyin ve 37 ° C'de bir hücre inkübatöründe inkübe edin.
- İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı mümkün olduğunca çıkarın ve istenen sayıda hücreyi (24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1.000-5.000 hücre) kaplama için uygun BME'de yeniden süspanse edin.
- Organoid kültür
- Kültür ortamını (Tablo 1) 2-3 günde bir yenileyin. Kültürün başlangıcında, HCC organoidlerini HCC izolasyon ortamında (Tablo 1) 2 hafta boyunca kültürleyin.
- HCC izolasyon ortamı ile 2 haftalık inkübasyondan sonra, ortamı HCC organoid genleşme ortamı (Tablo 1) ile değiştirin (4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanır).
- Kültür ortamını her 3 günde bir yenileyin.
- HCC genleşme ortamı ile 7-10 günlük kültürlemeden sonra, organoid uygun yoğunluğa veya boyuta ulaştığında, deneysel müdahaleler veya geçiş başlatın veya organoidleri gerektiği gibi liyofilize edin.
- Organoid pasaj
- Sarf malzemeleri ve malzemelerin hazırlanması
- Ultra düşük ataşman yüzeyli hücre kültürü plakalarını (24 oyuk) 37 °C'de bir inkübatörde 1 saat önceden ısıtın. Dondurulmuş BME'yi kullanımdan hemen öncesine kadar gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
- Organoid hasat çözeltisini ve tripsin ikamesini 37 °C'de 30 dakika önceden ısıtın.
- Geçiş işlemi
- Kültür ortamını kuyu plakasından çıkardıktan sonra, organoid süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 1.000 μL'lik bir pipet tabancası kullanarak kazıyarak ve yukarı ve aşağı pipetleyerek BME miktarına göre organoid hasat solüsyonu (50 μL BME başına 500 μL organoid hasat solüsyonu) ekleyin.
NOT: Hava kabarcıklarının varlığı daha yüksek pipetleme basıncına işaret ettiğinden, organoid kaybını önlemek için proses boyunca hava kabarcıklarından kaçının. - Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- BME'yi 1.000 μL'lik bir pipetle nazikçe aspire edin ve BME'nin tamamen çözündüğünü gözlemleyin. Berrak bir organoid hücre kümesi gözlenene kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin, ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin ve mümkün olduğunca süpernatanı çıkarın.
NOT: Bu aşamada, organoid dondurulabilir ve korunabilir. - Organoidlerin enzimatik sindirimi için, 1-5 mL tripsin ikamesi (organoid sayısına göre) ekleyin ve 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin. Organoidlerin 2-10 hücreden oluşan küçük kümelere ayrılıp ayrışmadığını belirlemek için mikroskop altında enzimatik sindirim derecesini gözlemleyin; Değilse, enzimatik sindirime devam edin.
NOT: Aşırı sindirim, organoid hücre kümelerinin tek hücrelere bölünmesine, canlılıklarının azalmasına ve sonraki kültür süresinin uzamasına neden olacaktır. - Sindirimi durdurmak için uygun hacimde soğuk bazal ortam ekleyin (Tablo 1).
- Organoidleri 400 × g'da 8 °C'de 5 dakika santrifüjleyin; Süpernatanı mümkün olduğunca çıkarın.
- İstenilen sayıda organoidi (24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1.000-5.000 organoid) kaplama için uygun matriste yeniden süspanse edin. Bölüm 1.2'deki adımların aynısını izleyin.
NOT: Kaplama yoğunluğu, organoidlerin büyüme hızına ve boyutuna göre optimize edilmelidir. - Organoidleri, organoid büyümesinin yoğunluğuna bağlı olarak her 10 günde bir 1: 3 veya 1: 4 oranında geçirin.
- Sarf malzemeleri ve malzemelerin hazırlanması
- Organoid kriyoprezervasyon ve resüsitasyon
- Organoidlerin dondurularak saklanması
- Liyofilizasyon tüpleri hazırlayın, her tüp organoidler içeren 24 oyuklu bir plakanın iki oyuğu ile birleşir.
- BME'siz organoidler elde etmek için organoid geçişi için 1.4.2.1 ila 1.4.2.4 arasındaki adımları izleyin ve 24 oyuklu bir plakaya 500 μL / oyuklu organoid liyofilizasyon çözeltisi ekleyerek organoidleri nazikçe yeniden süspanse edin.
NOT: Organoidlerin büyüme durumuna ve boyutuna bağlı olarak, organoidlerin üçüncü nesle kadar kültürde dondurularak saklanması önerilir. - Süspansiyonu liyofilizasyon tüplerine aktarın ve -80 °C'de gradyan soğutmalı bir kutuya yerleştirin. En az 24 saat boyunca -80 °C'de gradyan soğutmadan sonra, uzun süreli depolama için tüpleri sıvı nitrojene aktarın.
- Organoidlerin resüsitasyonu
- Liyofilize tüpleri 37 °C'lik bir su banyosunda inkübe edin ve sadece küçük bir buz bloğu kaldığında inkübasyonu durdurun.
- Süpernatanı tamamen çıkarmak için 400 × g'da 8 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Sonraki işlemler için bölüm 1.2 ve 1.3'ü izleyin.
- Organoidlerin dondurularak saklanması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda belirtilen prosedürün uygulanmasından sonra, HCC organoid sferoidlerinin ortaya çıkışı tipik olarak 3 günlük bir süre içinde gözlemlenebilir (Şekil 1). Şekil 1A,B, kuruluşun ilk gününde yuvarlatılmış kenarlar ve geçirgen sitozol ile karakterize edilen kompakt sferoidleri hemen geliştiren yerleşik HCC organoidini göstermektedir. HCC organoidlerinin büyümesi sırasında, farklı konsantrasyonlarda BME kullanımı, organoidlerin büyüme hızı üzerinde farklı etkilere sahipti. HCC genişleme ortamında 12 gün boyunca BME'nin %10, %30, %50 ve %100'ünde hasta kaynaklı iki HCC organoidini kültürledik (Tablo 1) ve BME'nin %30 ve %50'de sağlam olduğunu ve organoidlerin boyut olarak yakın olduğunu ve bu BME konsantrasyonlarında en büyük çapa sahip olduğunu bulduk. % 10 BME'de, BME, organoid büyüme için dar bir alana ve en küçük çapa sahip en parçalanmış olanıydı. % 100 BME'de, BME en sağlam olanıydı, ancak organoidlerin çapı ortadaydı. Bu nedenle, HCC organoid kültüründe BME konsantrasyonunun %30-50'de kontrol edilmesi önerilir (Şekil 2). Proliferatif HCC organoidi, öngörülen protokole uygun olarak etkili bir şekilde çoğaltılabilir ve üç nesil kültürden sonra her kültürde 500 μm'yi aşan bir boyuta ulaşır (Şekil 3). Bu boyuta ulaşıldıktan sonra ilaç müdahalesi ve immünohistokimyasal boyama dahil olmak üzere sonraki deneyler yapılabilir. Bu kültürleme stratejisini kullanarak, 20 günlük bir kültür periyodu içinde 1.000 μm'yi aşan boyutlara ulaşan HCC organoidlerinde önemli bir büyüme elde ettik (Şekil 4). Hem HCC organoidlerinin hem de eşleştirilmiş tümör dokularının immünohistokimyasal boyanması, marker genlerin ekspresyonunda benzerlikler gösterdi (Şekil 5).
Şekil 1: Hastaların cerrahi dokularından elde edilen HCC organoidleri. (A,B) Kaplamanın ilk gününde sağlam HCC organoid kültürlerinin temsili görüntüleri. (C,D) HCC organoid kültürleri 5 günlük ekimden sonra. Ölçek çubukları = 500 μm (A,C), 250 μm (B,D). Kısaltma: HCC = hepatosellüler karsinom. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı BME konsantrasyonlarında HCC organoid modellerinin büyümesini araştırmak. HCC organoidleri A ve B , HCC genleşme ortamı kullanılarak %10, %30, %50 ve %100 BME'de 12 gün boyunca aynı ekim yoğunluğunda kültürlendi (Tablo 1). Ölçek çubukları = 1.000 μm (A), 250 μm (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Uzun süreli amplifikasyonda HCC organoidleri. (A,B) Geçiş 8'in onuncu gününde HCC organoidlerinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 500 μm (A), 250 μm (B). Kısaltma: HCC = hepatosellüler karsinom. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: HCC organoidlerinin maksimum boyutu. Pasaj 8'de 20 günlük bir kültür periyodunda HCC organoidlerinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 250 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: HCC organoidlerinin ve eşleştirilmiş tümör dokularının histopatolojik özellikleri. İmmünohistokimya ile HCC organoidleri ve eşleştirilmiş tümör dokuları için gen belirteçleri, HCC belirteci AFP, diferansiye hepatosit belirteçleri HNF4A ve ALB, duktal belirteçler SOX9 ve EPCAM ve safra belirteci KRT19 ekspresyonu tespit edildi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: AFP = Alfa Fetoprotein; HNF4A = hepatosit nükleer faktör 4 alfa; ALB = albümin; SOX9 = SRY-Kutusu Transkripsiyon Faktörü 9; EPCAM = epitel hücresi adezyon molekülü; KRT19 = Keratin 19. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Ortam ve çözeltilerin bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hasta kaynaklı organoid modellerin dikkate değer bir yararı, doku yapısını ve genomik manzarayı kapsayan tümörlerin biyolojik özelliklerini aslına uygun olarak kopyalama kapasitelerinde yatmaktadır. Bu modeller dikkate değer bir doğruluk düzeyi gösterir ve uzun süreli ekim dönemlerinde bile tümörlerin heterojenliğini ve ilerlemesini etkili bir şekilde yansıtır 6,8,9. Bu rafine organoid kültür protokolünün kullanılmasıyla, in vitro olarak sürekli büyümeyi kolaylaştırmanın yanı sıra deneysel amaçlar için gerekli olan organoidleri kriyoprezervasyon ve ardından resüsitasyon yeteneğini kolaylaştıran, hasta kaynaklı HCC organoid modellerini etkili bir şekilde oluşturduk. Önceki protokollerle karşılaştırıldığında, bu organoidler gelişmiş büyüme oranları sergiler ve kültürde daha büyük boyutlara ulaşabilirler. Daha sonra, iyi kurulmuş organoidleri, önceden taranmış potansiyel onkojenik hedeflerden türetilen antikora bağlı ilaçlara maruz bıraktık ve bu da in vivo PDX hayvan modelleri10,11 ile uyumlu kayda değer terapötik sonuçlara yol açtı.
Bu çalışmanın amacı, önceki HCC organoid kuruluş protokollerinin eksikliklerini iyileştirmek, bu da stabil geçiş ve kültür koşulları altında daha büyük boyutlu HCC organoidlerinin oluşumuna yol açmaktır. Deneyin maliyetini düşürürken organoidlerin büyüme oranını artırmak için BME konsantrasyonunu optimize ettik; organoidlerde kök hücrelerin kendi kendini yenilemesini teşvik edebilen ve organoidlerin çoğalmasını artırabilen orijinal kültür formülüne önemli bir faktör CHIR99021 ekledi; elde edilen organoid miktarını artırmak ve verimliliği artırmak için orijinal mekanik ayırma yönteminden özel bir hasat çözeltisinin kullanımına kadar BME'nin çıkarma yöntemini geliştirdi; organoid kriyoprezervasyon ve resüsitasyonun operasyon adımlarını destekledi, HCC organoid kültürünün tüm sürecini oluşturdu. Bu organoid kültür protokolü ile, 20 günlük tek bir kültür periyodunda ortalama 800 μm'lik bir organoid boyutu elde etmek mümkündür ve birkaç sağlam HCC organoidi 1.000 μm'nin üzerine çıkar. Nihai hedef, HCC için tedavi stratejilerinin kesinliğini artırmak ve ilaç geliştirme için güvenilir bir model ve platform oluşturmaktır. Bu çabalar, HCC hasta sağkalım oranlarındaki iyileşmeye ve ilaç direnci zorluklarıyla mücadele etmek için yeni çözümlerin sağlanmasına katkıda bulunacaktır 11,12,13.
Bununla birlikte, söylemin birçok yönünü dikkate almak zorunludur. Öncelikle, özellikle transkateter arteriyel kemoembolizasyon (TACE), kemoterapi ve hedefe yönelik tedavi dahil olmak üzere çeşitli terapötik müdahaleler geçirmiş orta ila ileri evre HCC'li hastalarda HCC organoidlerinin oluşturulmasının etkinliğinin azalmasından önemli bir engel kaynaklanmaktadır 4,5. Sıklıkla, eksize edilen HCC örneklerinin tümör aktivitesi tehlikeye girer ve bu da organoidlerin üretilmesinde başarı oranının azalmasına neden olur. Bu arada, HCC organoidlerinin diğer ekipler tarafından daha önce kurulmasında, tümördeki çoğalan hücrelerin oranı, tümörün farklılaşma derecesi ve organoidlerin kurulması arasında bir korelasyon olduğu bulunmuştur 6,9. Bu nedenle, HCC organoidlerinin geliştirilmesinde yüksek bir başarı oranının elde edilmesi, hastanın ameliyatından önce kullanılan tedavilere ve ayrıca tümör dokuları elde edildikten sonra patoloğun yardımcı kararlarına duyulan ihtiyaca karmaşık bir şekilde bağlıdır. Ek olarak, organoidlerin HCC'nin heterojenliğini kopyaladığı iddia edilirken, kültürdeki bir organoidin tek bir hücre klonundan mı kaynaklandığını yoksa farklı genetik profillere sahip hücrelerin bir karışımını mı kapsadığını ayırt etmek zor bir zorluk teşkil etmektedir. Sonuç olarak, HCC organoidleri içindeki klonal dinamikler ve genetik çeşitlilik hakkındaki anlayışımızı artırmak için daha fazla araştırma zorunludur. Ayrıca, mevcut plaka bazlı organoid kültür tekniklerinin doğasında var olan sınırlamaları ele almak zorunludur. Dikkate değer bir kısıtlama, organoidlerin sınırlı büyüme potansiyelidir. Bu protokolü kullanarak HCC organoidlerinin kültürü, 1.000 μm'den daha büyük çaplar elde etmek mümkündür. Bununla birlikte, kültürün sonraki aşamalarında, organoidlerin gelişme potansiyelini sınırlayan yetersiz besin ve oksijen kaynağı nedeniyle organoidin çekirdek bölgesinde kararmış nekroz sıklıkla meydana gelir. Bu nedenle, organoid kültür sistemi içinde besin dağıtımını ve oksijenasyonu arttırmayı amaçlayan stratejiler geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır.
Özetle, hastadan türetilen organoid modeller, HCC'nin biyolojik özelliklerinin doğru bir şekilde yeniden üretilmesinde dikkate değer faydalar sunar. Bununla birlikte, organoid oluşumunun etkinliği, klonal dinamikler ve organoid kültür tekniklerinin doğasında bulunan sınırlamalar ile ilgili olarak hala üstesinden gelinmesi gereken engeller vardır. Bu zorlukların ele alınmasıyla, HCC organoid modellerinin hastalığı anlamak ve ilaç geliştirme çabalarını ilerletmek için kullanışlılığı daha da artırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82122048; 82003773; 82203380) ve Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2023A1515011416) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A.
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A.
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
