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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

संभावित लक्ष्य पहचान और दवा की खोज के लिए एक मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल का विकास और अनुकूलन

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65785
Automatic Translation
*1,2, *3, *1,2, 4, 4, 1,2, 1,2, 1,2, 4, 1,2, 1,2
1Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Center for Cancer Research and Translational Medicine, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, 3Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, 4Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Cancer Hospital, Guangzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

हम हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) ऑर्गेनॉइड गठन के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल का एक व्यापक अवलोकन और शोधन प्रदान करते हैं, जिसमें ऑर्गेनॉइड खेती के सभी चरण शामिल हैं। यह प्रणाली संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और दवा उम्मीदवार प्रभावशीलता के आकलन के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप में कार्य करती है।

Abstract

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) दुनिया भर में एक अत्यधिक प्रचलित और घातक ट्यूमर है और इसकी देर से खोज और प्रभावी विशिष्ट चिकित्सीय एजेंटों की कमी के कारण इसके रोगजनन और उपचार में और शोध की आवश्यकता होती है। ऑर्गेनोइड्स, एक उपन्यास मॉडल जो देशी ट्यूमर ऊतक जैसा दिखता है और इन विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है, ने हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण रुचि प्राप्त की है, यकृत कैंसर के लिए ऑर्गेनोइड मॉडल के विकास पर कई रिपोर्टों के साथ। इस अध्ययन में, हमने प्रक्रिया को सफलतापूर्वक अनुकूलित किया है और एक संस्कृति प्रोटोकॉल स्थापित किया है जो स्थिर पासिंग और संस्कृति स्थितियों के साथ बड़े आकार के एचसीसी ऑर्गेनोइड के गठन को सक्षम बनाता है। हमने एचसीसी ऊतक पृथक्करण, ऑर्गेनॉइड चढ़ाना, संस्कृति, पासिंग, क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन की पूरी प्रक्रिया को कवर करते हुए प्रक्रिया के प्रत्येक चरण को व्यापक रूप से रेखांकित किया है, और इस पत्र में विस्तृत सावधानी बरती है। ये ऑर्गेनोइड मूल एचसीसी ऊतकों के लिए आनुवंशिक समानता प्रदर्शित करते हैं और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जा सकते हैं, जिसमें ट्यूमर के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और बाद में दवा विकास शामिल है।

Introduction

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी), एक प्रचलित और व्यापक रूप से विविध ट्यूमर1, ने चिकित्सा समुदाय के भीतर काफी ध्यान आकर्षित किया है। एचसीसी में वंश प्लास्टिसिटी और पर्याप्त विविधता की उपस्थिति से पता चलता है कि विभिन्न रोगियों से उत्पन्न ट्यूमर कोशिकाएं और यहां तक कि एक ही रोगी के भीतर अलग-अलग घाव असमान आणविक और फेनोटाइपिक लक्षण प्रकट कर सकते हैं, जिससे अभिनव चिकित्सीय दृष्टिकोण 2,3,4,5 की उन्नति में दुर्जेय बाधाएं पेश हो सकती हैं. नतीजतन, एचसीसी में जैविक विशेषताओं और दवा प्रतिरोध के तंत्र की बढ़ी हुई समझ की अनिवार्य आवश्यकता है ताकि अधिक प्रभावी उपचार रणनीतियों के निर्माण को सूचित किया जा सके।

हाल के दशकों में, शोधकर्ताओं ने एचसीसी 3,4 का अध्ययन करने के उद्देश्य से इन विट्रो मॉडल के विकास के लिए अपने प्रयासों को समर्पित किया है। कुछ प्रगति के बावजूद, सीमाएं बनी रहती हैं। इन मॉडलों में कई प्रकार की तकनीकें शामिल हैं, जैसे सेल लाइनों, प्राथमिक कोशिकाओं और रोगी-व्युत्पन्न एक्सनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) का उपयोग। सेल लाइनें एचसीसी रोगियों से प्राप्त ट्यूमर कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में काम करती हैं, जो सुविधा और आसान विस्तार के लाभ प्रदान करती हैं। प्राथमिक सेल मॉडल में रोगी ट्यूमर के ऊतकों से प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं का प्रत्यक्ष अलगाव और संस्कृति शामिल होती है, जिससे जैविक विशेषताओं का प्रतिनिधित्व होता है जो स्वयं रोगियों के समान होते हैं। पीडीएक्स मॉडल चूहों में रोगी ट्यूमर के ऊतकों के प्रत्यारोपण को लागू करता है, जिसका उद्देश्य ट्यूमर के विकास और प्रतिक्रिया को अधिक ईमानदारी से अनुकरण करना है। ये मॉडल एचसीसी अनुसंधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, फिर भी उनके पास कुछ सीमाएं हैं, जिनमें सेल लाइनों की विषमता और विवो स्थितियों में पूरी तरह से दोहराने में असमर्थता शामिल है। इसके अलावा, इन विट्रो की खेती में लंबे समय तक कोशिकाओं की मूल विशेषताओं और कार्यात्मकताओं में गिरावट हो सकती है, एचसीसी के जैविक गुणों का सटीक प्रतिनिधित्व करने में चुनौतियों का सामना करना पड़ सकता है। इसके अतिरिक्त, पीडीएक्स मॉडल का उपयोग समय लेने वाली और महंगादोनों है 3.

इन सीमाओं को संबोधित करने और एचसीसी की शारीरिक विशेषताओं को अधिक सटीक रूप से दोहराने के लिए, ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी के उपयोग को एक आशाजनक अनुसंधान मंच के रूप में पेश किया गया है जो पिछली बाधाओं को पार करने में सक्षम है। ऑर्गेनोइड्स, जो इन विट्रो में सुसंस्कृत त्रि-आयामी सेल मॉडल हैं, वास्तविक अंगों की संरचना और कार्यक्षमता को दोहराने की क्षमता रखते हैं। हालांकि, एचसीसी के संदर्भ में, ऑर्गेनॉइड मॉडल स्थापित करने में कुछ चुनौतियां मौजूद हैं। इन चुनौतियों एचसीसी organoid निर्माण प्रक्रियाओं के अपर्याप्त विस्तृत विवरण, एचसीसी organoid निर्माण की पूरी प्रक्रिया के लिए व्यापक प्रोटोकॉल की कमी, और आम तौर पर सुसंस्कृत organoids 6,7,8 के छोटे आकार शामिल हैं. सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स के आम तौर पर सीमित आयामों के प्रकाश में, हमने एचसीसी ऑर्गेनॉइड निर्माण6 की संपूर्णता को शामिल करते हुए एक व्यापक प्रोटोकॉल के विकास के माध्यम से इन चुनौतियों से निपटने का प्रयास किया। इस प्रोटोकॉल में ऊतक पृथक्करण, ऑर्गेनॉइड चढ़ाना, संस्कृति, पासिंग, क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन शामिल हैं। प्रक्रियात्मक चरणों का अनुकूलन और संस्कृति माध्यम की संरचना को परिष्कृत करके, हमने एचसीसी ऑर्गेनॉइड मॉडल को सफलतापूर्वक स्थापित किया है जो निरंतर विकास और दीर्घकालिक पासिंग 6,8 में सक्षम हैं। बाद के खंडों में, एचसीसी ऑर्गेनोइड के निर्माण में शामिल परिचालन जटिलताओं और प्रासंगिक कारकों का एक व्यापक खाता प्रस्तुत किया जाएगा।

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Protocol

संबद्ध कैंसर अस्पताल और गुआंगज़ौ मेडिकल यूनिवर्सिटी के संस्थान में संबंधित रोगी से मानव-बायोप्सीड ऊतक प्राप्त किए गए थे, और रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. सर्जिकल नमूनों से रोगी-व्युत्पन्न एचसीसी ऑर्गेनोइड स्थापित करना

नोट: एचसीसी ऑर्गेनोइड की स्थापना में विभिन्न चरण शामिल हैं, अर्थात् ऊतक पृथक्करण, ऑर्गेनॉइड चढ़ाना, संस्कृति, पासिंग, क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन। ऊतक पृथक्करण की प्रक्रिया में 2 घंटे की अवधि की आवश्यकता होती है, जबकि एक प्लेट पर ऑर्गेनोइड के बीजारोपण में लगभग 40 मिनट लगते हैं। इसके बाद, एचसीसी ऑर्गेनोइड की प्रारंभिक पीढ़ी एचसीसी अलगाव माध्यम का उपयोग करके 10-14 दिनों की संस्कृति अवधि से गुजरती है। एक बार एक संतोषजनक घनत्व प्राप्त हो जाने के बाद, ऑर्गेनॉइड मार्ग आयोजित किए जाते हैं, जिसके लिए 1 घंटे की आवश्यकता होती है। ऑर्गेनोइड की बाद की संस्कृतियों को 7-10 दिनों के लिए एचसीसी विस्तार माध्यम का उपयोग करके बनाए रखा जाता है, जो ऑर्गेनोइड की वृद्धि दर और स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकता है।

  1. ऊतक पृथक्करण
    1. आपूर्ति और सामग्री की तैयारी
      1. उन रोगियों से एचसीसी ऊतक का 1-2 सेमी3 लीजिए, जिन्हें ऑपरेशन से पहले कोई पिछला स्थानीय या प्रणालीगत उपचार नहीं मिला है। सर्जिकल लकीर के बाद, प्रसंस्करण तक ऊतक संरक्षण समाधान(तालिका 1)में ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
        नोट: ऑर्गेनोइड की सफल स्थापना के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ताजा ऊतक के नमूने आवश्यक हैं। यह तुरंत नमूने प्रक्रिया करने के लिए महत्वपूर्ण है, आदर्श ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए शल्य चिकित्सा लकीर के बाद 1-4 घंटे के भीतर. बाँझ सामग्री और अभिकर्मकों का उपयोग कर एक सड़न रोकनेवाला वातावरण में बाद की सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन.
      2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए अल्ट्रा कम लगाव सतह सेल संस्कृति प्लेटों (24 कुओं) पहले से गरम करें. जमे हुए तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं जब तक कि उपयोग करने से ठीक पहले तक।
        नोट: बीएमई के पूर्ण विगलन को सुनिश्चित करने के लिए, इसे कम से कम 3 घंटे के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए। बाद के चरणों में सफल ऑर्गेनॉइड कल्चर के लिए बीएमई का पूर्ण पिघलना आवश्यक है।
      3. उपयोग करने से पहले, सुनिश्चित करें कि पाचन समाधान (तालिका 1) 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर गर्म किया जाता है।
        नोट: पाचन समाधान को सड़न रोकनेवाला वातावरण में ताजा तैयार करें और तुरंत इसका उपयोग करें।
    2. संगठनात्मक प्रसंस्करण प्रवाह
      1. एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में, एक पेट्री डिश पर सर्जिकल कैंची का उपयोग कर छोटे टुकड़े (0.5-1 मिमी3) में ट्यूमर ऊतक कटौती. क्लिप किए गए ऊतक को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और बेसल माध्यम (तालिका 1) के 5-10 एमएल जोड़ें।
        नोट: बेसल माध्यम (तालिका 1) को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      2. जितना संभव हो उतना रक्त धोने के लिए एक बैरोट्रोपिक विंदुक का उपयोग करें और इसे किसी भी रक्त कोशिकाओं और अस्थायी वसा के थक्के सहित कुछ सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए 1-2 मिनट के लिए खड़े होने दें। इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
      3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर मिश्रण अपकेंद्रित्र, और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें। छंटनी ऊतक के लिए prewarmed पाचन समाधान (तालिका 1) के 5 एमएल जोड़ें.
      4. पाचन के लिए ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
      5. प्रारंभिक पाचन के 30 मिनट के बाद, खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं के छोटे समूहों के लिए देखो. ओवरअपच से बचने के लिए हर 5-10 मिनट में चेक करें।
        नोट: ऊतक पाचन के लिए आवश्यक समय ऊतक के आकार और प्रकार पर निर्भर करेगा। ऊतक पाचन 90 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए। अतिपचा हुआ ऊतक माइक्रोस्कोप के नीचे व्यक्तिगत कोशिकाओं की एक बड़ी शीट के रूप में दिखाई देगा। पाचन का उचित स्तर इस तथ्य से इंगित होता है कि इनमें से अधिकांश सेल क्लस्टर हैं और अंगूर जैसी उपस्थिति है।
      6. ठंड बेसल माध्यम (तालिका 1) जोड़कर पाचन बंद करें और 100 माइक्रोन सेल फिल्टर के साथ एक नई 50 एमएल ट्यूब में फ़िल्टर करें। 50 एमएल की मात्रा में ठंडा बेसल माध्यम जोड़ें।
      7. 8 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2 × ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें और ठंड बेसल माध्यम (तालिका 1) के एक और 50 एमएल जोड़कर गोली को फिर से निलंबित करें। इस चरण को दो बार दोहराएं।
        नोट: कम गति centrifugation छोटे सेल समूहों नीचे बसने के लिए अनुमति देने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि रक्त कोशिकाओं और सेल मलबे अभी भी सतह पर तैरनेवाला में निलंबित कर रहे हैं; अपेक्षाकृत शुद्ध ऊतक कोशिका द्रव्यमान प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया को कई बार दोहराया जाता है।
  2. ऑर्गेनॉइड चढ़ाना
    1. दूसरे धोने के बाद, जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला हटा दें और चढ़ाना के लिए उपयुक्त बीएमई में कोशिकाओं की वांछित संख्या (24-अच्छी प्लेट के प्रति 1,000-5,000 कोशिकाएं) को फिर से निलंबित करें।
      नोट: उपयोग करने से पहले बीएमई को हमेशा 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. बीएमई जोड़ें और बीएमई जोड़कर उन्नत डीएमईएम/एफ -12 में छोटे सेल समूहों को निलंबित करें और सेल समुच्चय पूरी तरह से निलंबित होने तक धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करें। बीएमई की एकाग्रता को 30% और 50% के बीच नियंत्रित करें।
    3. बीज 50 माइक्रोन बीएमई बूंदों 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के केंद्र में सेल समूहों के साथ मिश्रित.
      नोट: जहां तक संभव हो, बूंदों को अच्छी तरह से प्लेट के फुटपाथ पर फैलने न दें। कम-सोखना प्लेट का फुटपाथ कम-सोखना अवस्था में नहीं है, और बूंदों और फुटपाथ के बीच संपर्क से आसंजन हो जाएगा, जो बाद के इनक्यूबेशन के लिए अनुकूल नहीं है।
    4. जोड़ा बूंदों के साथ प्लेटों 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जम की अनुमति दें. इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक अच्छी तरह से प्रीवार्म्ड माध्यम (तालिका 1) के 500 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  3. ऑर्गेनॉइड संस्कृति
    1. हर 2-3 दिनों में एक बार संस्कृति माध्यम (तालिका 1) को ताज़ा करें। संस्कृति, संस्कृति की शुरुआत में एचसीसी 2 सप्ताह के लिए एचसीसी अलगाव माध्यम (तालिका 1) में organoids.
    2. एचसीसी अलगाव माध्यम के साथ इनक्यूबेशन के 2 सप्ताह के बाद, एचसीसी ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम (तालिका 1) (2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के साथ माध्यम को बदलें।
    3. हर 3 दिनों में एक बार संस्कृति माध्यम को ताज़ा करें।
    4. एचसीसी विस्तार माध्यम के साथ संवर्धन के 7-10 दिनों के बाद जब ऑर्गेनॉइड उचित घनत्व या आकार तक पहुंच गया है, तो प्रयोगात्मक हस्तक्षेप या मार्ग शुरू करें या आवश्यकतानुसार ऑर्गेनोइड को lyophilize करें।
  4. ऑर्गेनॉइड पासिंग
    1. आपूर्ति और सामग्री की तैयारी
      1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए अल्ट्रा कम लगाव सतह सेल संस्कृति प्लेटों (24 कुओं) पहले से गरम करें. उपयोग से ठीक पहले तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जमे हुए बीएमई को पिघलाएं।
      2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम organoid फसल समाधान और trypsin स्थानापन्न.
    2. पासिंग प्रक्रिया
      1. अच्छी तरह से थाली से संस्कृति माध्यम को हटाने के बाद, एक 15 एमएल ट्यूब के लिए अंग निलंबन हस्तांतरण.
      2. बीएमई की मात्रा के अनुसार ऑर्गेनॉइड हार्वेस्टिंग सॉल्यूशन जोड़ें (बीएमई के 500 माइक्रोन प्रति 50 माइक्रोन ऑर्गेनॉइड हार्वेस्टिंग सॉल्यूशन) 1,000 माइक्रोन पिपेट गन का उपयोग करके ऊपर और नीचे स्क्रैपिंग और पाइपिंग करके।
        नोट: ऑर्गेनोइड के नुकसान को रोकने के लिए पूरी प्रक्रिया में हवाई बुलबुले से बचें क्योंकि हवा के बुलबुले की उपस्थिति उच्च पाइपिंग दबाव को इंगित करती है।
      3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
      4. धीरे से बीएमई को 1,000 माइक्रोन पिपेट के साथ महाप्राण करें और देखें कि बीएमई पूरी तरह से भंग हो गया है। एक स्पष्ट organoid सेल क्लस्टर मनाया जाता है जब तक हर 10 मिनट का निरीक्षण करें, तो कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के रूप में ज्यादा हटा दें.
        नोट: इस स्तर पर, ऑर्गेनॉइड को जमे हुए और संरक्षित किया जा सकता है।
      5. ऑर्गेनोइड के एंजाइमेटिक पाचन के लिए, ट्रिप्सिन विकल्प (ऑर्गेनोइड की संख्या के अनुसार) के 1-5 एमएल जोड़ें और 2 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। माइक्रोस्कोप के नीचे एंजाइमी पाचन की डिग्री का निरीक्षण करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि ऑर्गेनोइड 2-10 कोशिकाओं के छोटे समूहों में विघटित होते हैं या नहीं; यदि नहीं, तो एंजाइमी पाचन जारी रखें।
        नोट: overdigestion एकल कोशिकाओं में organoid सेल समूहों के lysis में परिणाम होगा, उनकी व्यवहार्यता कम करने और बाद में संस्कृति समय को लम्बा खींचने.
      6. पाचन को रोकने के लिए ठंड बेसल माध्यम (तालिका 1) की उचित मात्रा जोड़ें।
      7. 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 × ग्राम पर ऑर्गेनोइड को सेंट्रीफ्यूज करें; जितना संभव हो सतह पर तैरनेवाला निकालें.
      8. चढ़ाना के लिए उपयुक्त मैट्रिक्स में ऑर्गेनोइड की वांछित संख्या (24-अच्छी प्लेट के कुएं प्रति 1,000-5,000 ऑर्गेनोइड्स) को फिर से निलंबित करें। अनुभाग 1.2 में दिए गए चरणों का पालन करें।
        नोट: चढ़ाना घनत्व को ऑर्गेनोइड की वृद्धि दर और आकार के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
      9. ऑर्गेनॉइड विकास के घनत्व के आधार पर हर 10 दिनों में 1: 3 या 1: 4 के अनुपात में ऑर्गेनोइड को पारित करें।
  5. ऑर्गेनॉइड क्रायोप्रेज़र्वेशन और पुनर्जीवन
    1. ऑर्गेनोइड का क्रायोप्रिजर्वेशन
      1. lyophilization ट्यूबों तैयार करें, प्रत्येक ट्यूब organoids युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं के साथ संगम करते हैं.
      2. बीएमई के बिना ऑर्गेनोइड प्राप्त करने के लिए ऑर्गेनॉइड पासिंग के लिए चरण 1.4.2.1 से 1.4.2.4 का पालन करें, और 24-वेल प्लेट में ऑर्गेनॉइड लियोफिलाइजेशन समाधान के 500 माइक्रोन/वेल को जोड़कर ऑर्गेनोइड को धीरे से फिर से निलंबित करें।
        नोट: ऑर्गेनोइड की वृद्धि की स्थिति और आकार के आधार पर, तीसरी पीढ़ी तक संस्कृति में ऑर्गेनोइड को क्रायोप्रोरिजर्व करने की सिफारिश की जाती है।
      3. निलंबन को lyophilization ट्यूबों में स्थानांतरित करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर ढाल-ठंडा बॉक्स में रखें। कम से कम 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ढाल ठंडा करने के बाद, लंबी अवधि के भंडारण के लिए ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
    2. ऑर्गेनोइड का पुनर्जीवन
      1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में lyophilized ट्यूबों सेते हैं और इनक्यूबेशन बंद करो जब बर्फ का केवल एक छोटा सा ब्लॉक रहता है.
      2. सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटाने के लिए 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
      3. बाद के कार्यों के लिए अनुभाग 1.2 और 1.3 का पालन करें।

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Representative Results

उपर्युक्त प्रक्रिया को लागू करने पर, एचसीसी ऑर्गेनॉइड स्फेरॉइड का उद्भव आमतौर पर 3 दिनों (चित्रा 1) की अवधि के भीतर देखने योग्य होता है। चित्रा 1 ए, बी स्थापित एचसीसी ऑर्गेनॉइड दिखाते हैं, जो स्थापना के शुरुआती दिन गोल किनारों और पारगम्य साइटोसोल की विशेषता वाले कॉम्पैक्ट स्फेरॉइड को तुरंत विकसित करता है। एचसीसी ऑर्गेनोइड की वृद्धि के दौरान, बीएमई की विभिन्न सांद्रता के उपयोग का ऑर्गेनोइड की वृद्धि दर पर अलग-अलग प्रभाव पड़ा। हमने एचसीसी विस्तार माध्यम (तालिका 1) में 12 दिनों के लिए बीएमई के 10%, 30%, 50% और 100% में दो रोगी-व्युत्पन्न एचसीसी ऑर्गेनोइड को सुसंस्कृत किया और पाया कि बीएमई 30% और 50% पर बरकरार था और ऑर्गेनोइड आकार में करीब थे और इन बीएमई सांद्रता में सबसे बड़ा व्यास था। 10% बीएमई पर, बीएमई सबसे खंडित था, जिसमें ऑर्गेनॉइड विकास के लिए एक संकीर्ण स्थान और सबसे छोटा व्यास था। 100% बीएमई पर, बीएमई सबसे बरकरार था, लेकिन ऑर्गेनोइड का व्यास बीच में था। इसलिए, एचसीसी ऑर्गेनॉइड संस्कृति(चित्रा 2)में 30-50% पर बीएमई की एकाग्रता को नियंत्रित करने की सिफारिश की जाती है। प्रसार एचसीसी ऑर्गेनॉइड को निर्धारित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रभावी ढंग से प्रचारित किया जा सकता है, संस्कृति की तीन पीढ़ियों (चित्रा 3) के बाद प्रत्येक संस्कृति में 500 माइक्रोन से अधिक आकार प्राप्त करना। दवा हस्तक्षेप और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला सहित बाद के प्रयोगों, इस आकार को प्राप्त करने पर आयोजित किया जा सकता है। इस संवर्धन रणनीति का उपयोग करते हुए, हमने एचसीसी ऑर्गेनोइड की पर्याप्त वृद्धि हासिल की, जो 20-दिवसीय संस्कृति अवधि (चित्रा 4) के भीतर 1,000 माइक्रोन से अधिक आकार तक पहुंच गया। एचसीसी ऑर्गेनोइड और युग्मित ट्यूमर ऊतकों दोनों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला हो जाना मार्कर जीन (चित्रा 5) की अभिव्यक्ति में समानताएं प्रकट करता है।

Figure 1
चित्रा 1: रोगियों के सर्जिकल ऊतकों से प्राप्त एचसीसी ऑर्गेनोइड। (ए, बी) चढ़ाना के पहले दिन मजबूत एचसीसी organoid संस्कृतियों के प्रतिनिधि छवियों. (सी, डी) एचसीसी खेती के 5 दिनों के बाद संस्कृतियों का आयोजन करता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन (ए, सी), 250 माइक्रोन (बी, डी)। संक्षिप्त: एचसीसी = हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न बीएमई सांद्रता में एचसीसी ऑर्गेनॉइड मॉडल के विकास की जांच करने के लिए। एचसीसी ऑर्गेनोइड ए और बी एचसीसी विस्तार माध्यम (तालिका 1) का उपयोग करके 10%, 30%, 50% और 100% बीएमई में 12 दिनों के लिए एक ही रोपण घनत्व पर सुसंस्कृत थे। स्केल बार = 1,000 माइक्रोन (ए), 250 माइक्रोन (बी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दीर्घकालिक प्रवर्धन में एचसीसी ऑर्गेनोइड्स। (ए, बी) पारित होने के दसवें दिन एचसीसी ऑर्गेनोइड की प्रतिनिधि छवियां 8. स्केल बार = 500 माइक्रोन (ए), 250 माइक्रोन (बी)। संक्षिप्त: एचसीसी = हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एचसीसी ऑर्गेनोइड का अधिकतम आकार। मार्ग 8 में 20 दिनों की संस्कृति अवधि में एचसीसी ऑर्गेनोइड की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 250 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एचसीसी ऑर्गेनोइड और युग्मित ट्यूमर ऊतकों की हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताएं। एचसीसी ऑर्गेनोइड और युग्मित ट्यूमर ऊतकों, एचसीसी मार्कर एएफपी, विभेदित हेपेटोसाइट मार्करों एचएनएफ 4 ए और एएलबी, डक्टल मार्कर एसओएक्स 9 और ईपीसीएएम, और पित्त मार्कर केआरटी 19 के लिए जीन मार्करों की अभिव्यक्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा पता लगाया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: एएफपी = अल्फा भ्रूणप्रोटीन; HNF4A = हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा; एएलबी = एल्ब्यूमिन; SOX9 = SRY-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 9; EPCAM = उपकला कोशिका आसंजन अणु; KRT19 = केरातिन 19. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: मीडिया और समाधान की संरचना. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल का एक उल्लेखनीय लाभ ट्यूमर की जैविक विशेषताओं को ईमानदारी से दोहराने, ऊतक संरचना और जीनोमिक परिदृश्य को शामिल करने की उनकी क्षमता में निहित है। ये मॉडल सटीकता का एक उल्लेखनीय स्तर प्रदर्शित करते हैं और प्रभावी रूप से विषमता और ट्यूमर की प्रगति को दर्पण करते हैं, यहां तक कि खेती 6,8,9 की विस्तारित अवधि में भी। इस परिष्कृत ऑर्गेनॉइड कल्चर प्रोटोकॉल के उपयोग के माध्यम से, हमने रोगी-व्युत्पन्न एचसीसी ऑर्गेनॉइड मॉडल को प्रभावी ढंग से स्थापित किया है, जो इन विट्रो में निरंतर वृद्धि की सुविधा प्रदान करता है, साथ ही साथ क्रायोप्रिजर्व करने की क्षमता और बाद में प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए आवश्यक ऑर्गेनोइड को पुनर्जीवित करता है। पूर्ववर्ती प्रोटोकॉल की तुलना में, ये ऑर्गेनोइड बढ़ी हुई विकास दर प्रदर्शित करते हैं और संस्कृति में अधिक आयाम प्राप्त करने में सक्षम हैं। इसके बाद, हमने अच्छी तरह से स्थापित ऑर्गेनोइड को प्रीस्क्रीन किए गए संभावित ऑन्कोजेनिक लक्ष्यों से प्राप्त एंटीबॉडी-युग्मित दवाओं के अधीन किया, जिससे उल्लेखनीय चिकित्सीय परिणाम सामने आए जो विवो पीडीएक्स पशु मॉडल10,11 के साथ संरेखित होते हैं।

इस अध्ययन का उद्देश्य पिछले एचसीसी ऑर्गेनॉइड स्थापना प्रोटोकॉल की कमियों में सुधार करना था, जिसके परिणामस्वरूप स्थिर पासिंग और संस्कृति स्थितियों के तहत बड़े आकार के एचसीसी ऑर्गेनोइड का गठन हुआ। हमने प्रयोग की लागत को कम करते हुए ऑर्गेनोइड की वृद्धि दर में सुधार करने के लिए बीएमई की एकाग्रता को अनुकूलित किया; मूल संस्कृति सूत्र में CHIR99021 एक महत्वपूर्ण कारक जोड़ा गया, जो ऑर्गेनोइड में स्टेम कोशिकाओं के आत्म-नवीकरण को बढ़ावा दे सकता है और ऑर्गेनॉइड के प्रसार को बढ़ा सकता है; बीएमई की हटाने की विधि में सुधार, मूल यांत्रिक पृथक्करण विधि से एक विशेष कटाई समाधान के उपयोग के लिए, प्राप्त ऑर्गेनॉइड की मात्रा बढ़ाने और दक्षता में सुधार करने के लिए; ऑर्गेनॉइड क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन के संचालन चरणों को पूरक करते हुए, एचसीसी ऑर्गेनॉइड संस्कृति की पूरी प्रक्रिया का निर्माण किया। इस ऑर्गेनॉइड कल्चर प्रोटोकॉल के साथ, 20-दिवसीय संस्कृति अवधि में 800 माइक्रोन का औसत ऑर्गेनॉइड आकार प्राप्त करना संभव है, जिसमें कुछ मजबूत एचसीसी ऑर्गेनोइड 1,000 माइक्रोन से अधिक तक बढ़ रहे हैं। अंतिम लक्ष्य एचसीसी के लिए उपचार रणनीतियों की सटीकता को बढ़ाना और दवा विकास के लिए एक भरोसेमंद मॉडल और मंच स्थापित करना है। ये प्रयास एचसीसी रोगी जीवित रहने की दर में सुधार और दवा प्रतिरोध चुनौतियों 11,12,13 से निपटने के लिए उपन्यास समाधान के प्रावधान में योगदान देंगे।

हालांकि, प्रवचन के कई पहलुओं पर विचार करना अनिवार्य है। मुख्य रूप से, एचसीसी ऑर्गेनोइड की स्थापना की कम प्रभावकारिता से एक महत्वपूर्ण बाधा उत्पन्न होती है, विशेष रूप से मध्यवर्ती से उन्नत चरण एचसीसी वाले रोगियों के रोगियों के लिए, जो ट्रांसकैथेटर धमनी केमोम्बोलाइजेशन (टीएसीई), कीमोथेरेपी, और लक्षित चिकित्सा 4,5 सहित विविध चिकित्सीय हस्तक्षेपों से गुजर चुके हैं. अक्सर, उत्तेजित एचसीसी नमूनों की ट्यूमर गतिविधि से समझौता किया जाता है, जिससे ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने में सफलता की दर कम हो जाती है। इस बीच, अन्य टीमों द्वारा एचसीसी ऑर्गेनोइड की पिछली स्थापना में, यह पाया गया कि ट्यूमर में प्रसार कोशिकाओं के अनुपात, ट्यूमर के भेदभाव के ग्रेड और ऑर्गेनोइड 6,9 की स्थापना के बीच एक संबंध है। इसलिए, एचसीसी ऑर्गेनोइड के विकास में एक उच्च सफलता दर की उपलब्धि रोगी की सर्जरी से पहले नियोजित उपचारों से जटिल रूप से जुड़ी हुई है, साथ ही ट्यूमर के ऊतकों को प्राप्त करने के बाद रोगविज्ञानी के सहायक निर्णय की आवश्यकता भी है। इसके अतिरिक्त, जबकि ऑर्गेनोइड को एचसीसी की विषमता को दोहराने के लिए कथित किया जाता है, यह समझना कि क्या संस्कृति में एक ऑर्गेनॉइड एक एकल सेल क्लोन से उत्पन्न होता है या अलग-अलग आनुवंशिक प्रोफाइल वाले कोशिकाओं के मिश्रण को शामिल करता है, एक चुनौती बन जाता है। नतीजतन, एचसीसी ऑर्गेनोइड के भीतर क्लोनल गतिशीलता और आनुवंशिक विविधता की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए आगे की पूछताछ जरूरी है। इसके अलावा, वर्तमान प्लेट-आधारित ऑर्गेनॉइड संस्कृति तकनीकों की अंतर्निहित सीमाओं को संबोधित करना अनिवार्य है। एक उल्लेखनीय बाधा ऑर्गेनोइड की प्रतिबंधित विकास क्षमता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एचसीसी ऑर्गेनोइड की संस्कृति, 1,000 माइक्रोन से अधिक के व्यास को प्राप्त करना संभव है। हालांकि, संस्कृति के बाद के चरणों में, अपर्याप्त पोषक तत्व और ऑक्सीजन की आपूर्ति के कारण, ऑर्गेनॉइड के मुख्य क्षेत्र में अक्सर काला परिगलन होता है, जो ऑर्गेनोइड की विकास क्षमता को सीमित करता है। इसलिए, ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम के भीतर पोषक तत्व वितरण और ऑक्सीजन को बढ़ाने के उद्देश्य से रणनीतियों को तैयार करने की तत्काल आवश्यकता है।

सारांश में, रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल एचसीसी की जैविक विशेषताओं को सटीक रूप से पुन: पेश करने में उल्लेखनीय लाभ प्रस्तुत करते हैं। फिर भी, ऑर्गेनॉइड स्थापना, क्लोनल गतिशीलता और ऑर्गेनॉइड संस्कृति तकनीकों में निहित सीमाओं की प्रभावकारिता के बारे में अभी भी बाधाएं हैं। इन चुनौतियों का समाधान करके, बीमारी को समझने और दवा विकास के प्रयासों को आगे बढ़ाने के लिए एचसीसी ऑर्गेनॉइड मॉडल की उपयोगिता को और बढ़ाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (82122048; 82003773; 82203380) और ग्वांगडोंग बेसिक एंड एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (2023A1515011416) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-gastrin I human Merck G9145
1.5 mL Microtubes Merck AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor) Tocris Bioscience 2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (503), serum-free Thermo Fisher Scientific 17504044
BMP7 Peprotech 120-03P
Cell strainer size 100 μm Merck CLS352360
CHIR99021 Merck SML1046
Collagenase D Merck 11088858001
Corning Costar Ultra-Low Merck CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile Corning 3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile Corning 3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution R&D SYSTEMS 3700-100-01 Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) Merck 3533-005-02
DAPT Merck D5942
Dexamethasone Merck D4902
DMSO Merck C6164
DNaseI Merck DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Thermo Fisher Scientific 12634028 Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS) Thermo Fisher Scientific 24010043
Forceps N/A N/A
Forskolin Tocris Bioscience 1099
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061
HEPES, 1 M Thermo Fisher Scientific 15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope Leica N/A
N2 supplement (1003) Thermo Fisher Scientific 17502048
N-acetylcysteine Merck A0737-5MG
Nicotinamide Merck N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15
Recombinant human FGF10 Peprotech 100-26
Recombinant human FGF19 Peprotech 100-32
Recombinant human HGF Peprotech 100-39
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride Merck Y0503
R-spodin1-conditioned medium (Broutier et al.) N/A Secretion of cell lines
Surgical scissors N/A N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University N/A
TNFα Peprotech 315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Thermo Fisher Scientific 12604013 Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium (Broutier et al.) N/A Secretion of cell lines

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References

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Zhang, C. Y., Zhang, X. F., Yuan,… More

Zhang, C. Y., Zhang, X. F., Yuan, J., Gong, Y. F., Tang, H., Guo, W. Y., Li, T. Y., Li, C. W., Tang, Y. Q., Ma, N. F., Liu, M. Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery. J. Vis. Exp. (198), e65785, doi:10.3791/65785 (2023).

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