Summary
Мы предоставляем всесторонний обзор и уточнение существующих протоколов формирования органоидов гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), охватывающих все этапы культивирования органоидов. Эта система служит ценной моделью для идентификации потенциальных терапевтических мишеней и оценки эффективности препаратов-кандидатов.
Abstract
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является широко распространенной и смертельной опухолью во всем мире, и ее позднее обнаружение и отсутствие эффективных специфических терапевтических агентов требуют дальнейших исследований ее патогенеза и лечения. Органоиды, новая модель, которая очень похожа на нативную опухолевую ткань и может быть культивирована in vitro, вызвали значительный интерес в последние годы, с многочисленными сообщениями о разработке органоидных моделей для рака печени. В этом исследовании мы успешно оптимизировали процедуру и разработали протокол культивирования, который позволяет формировать органоиды ГЦК более крупного размера со стабильными условиями пассажа и культивирования. В этой статье мы подробно описали каждый этап процедуры, охватывая весь процесс диссоциации тканей ГЦК, органоидного покрытия, культивирования, пассажа, криоконсервации и реанимации, а также подробно описали меры предосторожности. Эти органоиды демонстрируют генетическое сходство с исходными тканями ГЦК и могут быть использованы для различных применений, включая идентификацию потенциальных терапевтических мишеней для опухолей и последующую разработку лекарств.
Introduction
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), широко распространенная и широко разнообразная опухоль1, привлекла значительное внимание в медицинском сообществе. Наличие линейной пластичности и существенной гетерогенности в ГЦК позволяет предположить, что опухолевые клетки, происходящие от разных пациентов, и даже различные поражения у одного и того же пациента могут проявлять несхожие молекулярные и фенотипические признаки, тем самым создавая огромные препятствия для продвижения инновационных терапевтических подходов 2,3,4,5 . Следовательно, существует настоятельная необходимость в более глубоком понимании биологических свойств и механизмов лекарственной устойчивости при ГЦК для разработки более эффективных стратегий лечения.
В последние десятилетия исследователи посвятили свои усилия разработке моделей in vitro с целью изучения ГЦК 3,4. Несмотря на некоторые достижения, ограничения сохраняются. Эти модели охватывают целый ряд методов, таких как использование клеточных линий, первичных клеток и ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX). Клеточные линии служат моделями in vitro для долгосрочного культивирования опухолевых клеток, полученных от пациентов с ГЦК, предлагая преимущества удобства и легкого расширения. Модели первичных клеток предполагают прямое выделение и культивирование первичных опухолевых клеток из опухолевых тканей пациента, тем самым обеспечивая представление биологических характеристик, которые очень похожи на характеристики самих пациентов. PDX-модели предполагают трансплантацию опухолевых тканей пациента мышам с целью более точного моделирования роста опухоли и ответной реакции. Эти модели сыграли важную роль в исследованиях ГЦК, но они обладают определенными ограничениями, включая гетерогенность клеточных линий и неспособность полностью реплицироваться в условиях in vivo. Кроме того, длительное культивирование in vitro может привести к ухудшению исходных характеристик и функциональности клеток, что создает проблемы с точным представлением биологических свойств ГЦК. Кроме того, использование моделей PDX отнимает много времени и средств3.
Для устранения этих ограничений и более точного воспроизведения физиологических свойств ГЦК было введено использование органоидной технологии в качестве перспективной исследовательской платформы, способной превзойти предыдущие ограничения. Органоиды, которые представляют собой трехмерные клеточные модели, культивируемые in vitro, обладают способностью воспроизводить структуру и функциональность реальных органов. Тем не менее, в контексте ГЦК существуют определенные проблемы в создании органоидных моделей. Эти проблемы включают в себя недостаточно подробное описание процедур конструирования органоидов ГЦК, отсутствие всеобъемлющих протоколов для всего процесса конструирования органоидов ГЦК и, как правило, небольшой размер культивируемых органоидов 6,7,8. В свете обычно ограниченных размеров культивируемых органоидов мы попытались решить эти проблемы путем разработки всеобъемлющего протокола, охватывающего всю конструкцию органоида ГЦК6. Этот протокол включает в себя диссоциацию тканей, органоидное покрытие, культивирование, пассаж, криоконсервацию и реанимацию. Оптимизировав технологические этапы и уточнив состав питательной среды, мы успешно создали модели органоидов ГЦК, способные к устойчивому росту и длительному пассажу 6,8. В последующих разделах будет представлен всесторонний отчет об эксплуатационных тонкостях и соответствующих факторах, участвующих в построении органоидов ГЦК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Биопсия тканей человека была получена от соответствующего пациента в Аффилированной онкологической больнице и Институте Медицинского университета Гуанчжоу, и от пациентов было получено информированное согласие. Подробные сведения обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Получение органоидов ГЦК из хирургических образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Создание органоидов ГЦК включает в себя различные стадии, а именно диссоциацию тканей, покрытие органоидами, культивирование, пассаж, криоконсервацию и реанимацию. Процесс диссоциации тканей занимает 2 часа, в то время как посев органоидов на пластину занимает около 40 минут. После этого первоначальное поколение органоидов ГЦК подвергается культивированию продолжительностью 10-14 дней с использованием изоляционной среды ГЦК. После достижения удовлетворительной плотности проводятся органоидные пассажи, для которых требуется 1 ч. Последующие культуры органоидов затем выдерживают с помощью расширительной среды ГЦК в течение 7-10 дней, которые могут варьироваться в зависимости от скорости роста и состояния органоидов.
- Диссоциация тканей
- Подготовка расходных материалов и материалов
- Возьмите 1-2см3 ткани ГЦК у пациентов, которые ранее не получали местного или системного лечения до операции. После хирургической резекции ткань выдерживают при температуре 4 °С в тканкоконсервирующем растворе (табл. 1) до обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высококачественные образцы свежих тканей необходимы для успешного создания органоидов. Важно обрабатывать образцы быстро, в идеале в течение 1-4 ч после хирургической резекции, чтобы сохранить жизнеспособность тканей. Все последующие процедуры проводить в асептической среде с использованием стерильных материалов и реагентов. - Предварительно нагрейте планшеты клеточных культур со сверхнизкой поверхностью присоединения (24 лунки) в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C. Разморозьте замороженный экстракт базальной мембраны (BME) в течение ночи при температуре 4 °C непосредственно перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить полное оттаивание BME, его необходимо поместить на лед не менее чем на 3 часа. Полное плавление БМЭ необходимо для успешного культивирования органоидов на последующих этапах. - Перед применением убедитесь, что раствор для сбраживания (таблица 1) подогрет до температуры 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор для сбраживания свежим в асептической среде и немедленно утилизируйте его.
- Возьмите 1-2см3 ткани ГЦК у пациентов, которые ранее не получали местного или системного лечения до операции. После хирургической резекции ткань выдерживают при температуре 4 °С в тканкоконсервирующем растворе (табл. 1) до обработки.
- Организационный поток обработки
- В ламинарном проточном кабинете хирургическими ножницами на чашке Петри разрезать опухолевую ткань на мелкие кусочки (0,5-1мм3). Переложите обрезанную ткань в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте 5-10 мл базальной среды (табл. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Базальную среду (табл. 1) можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца. - Используйте баротропную пипетку, чтобы смыть как можно больше крови, и дайте ей постоять 1-2 минуты, чтобы удалить часть надосадочной жидкости, включая любые клетки крови и плавающие жировые сгустки. Повторите эту процедуру дважды.
- Центрифужируют смесь при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре и осторожно удаляют надосадочную жидкость. Добавьте 5 мл предварительно подогретого раствора для сбраживания (табл. 1) к обрезанной ткани.
- Поверните трубку на 37 °C для разложения.
- Через 30 минут после первоначального пищеварения ищите небольшие скопления клеток под микроскопом. Проверяйте каждые 5-10 минут, чтобы избежать переваривания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для переваривания тканей, будет зависеть от размера и типа ткани. Переваривание тканей не должно превышать 90 мин. Переваренная ткань будет выглядеть под микроскопом в виде большого листа отдельных клеток. На соответствующий уровень пищеварения указывает тот факт, что большинство из них представляют собой скопления клеток и имеют виноградоподобный вид. - Остановите пищеварение, добавив холодную базальную среду (Таблица 1), и отфильтруйте в новую пробирку объемом 50 мл с клеточным фильтром 100 мкм. Добавить холодную базальную среду до объема 50 мл.
- Центрифугируют клетки при 2 × г в течение 10 мин при 8 °С. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, добавив еще 50 мл холодной базальной среды (Таблица 1). Повторите этот шаг дважды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Низкоскоростное центрифугирование используется для того, чтобы небольшие клеточные кластеры оседали, в то время как клетки крови и клеточный мусор все еще находятся во взвешенном состоянии в надосадочной жидкости; Процесс повторяют несколько раз для получения относительно чистой клеточной массы ткани.
- В ламинарном проточном кабинете хирургическими ножницами на чашке Петри разрезать опухолевую ткань на мелкие кусочки (0,5-1мм3). Переложите обрезанную ткань в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте 5-10 мл базальной среды (табл. 1).
- Подготовка расходных материалов и материалов
- Органоидное покрытие
- После второй промывки удалите как можно больше надосадочной жидкости и повторно суспендируйте желаемое количество клеток (1000-5000 клеток на лунку 24-луночного планшета) в соответствующем BME для покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием всегда держите BME при температуре 4 °C. - Добавьте BME и приостановите кластеры малых сот в Advanced DMEM/F-12, добавив BME и осторожно пипетируя вверх и вниз до тех пор, пока агрегаты клеток не будут полностью приостановлены. Контролируйте концентрацию BME в диапазоне от 30% до 50%.
- Высевают 50 мкл капель BME, смешанных с клеточными кластерами, в центр 24-луночных культуральных планшетов.
ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности не допускайте попадания капель на боковую стенку лунки. Боковая стенка низкоадсорбционной пластины не находится в низкоадсорбционном состоянии, и контакт между каплями и боковой стенкой приведет к адгезии, что не способствует последующей инкубации. - Дайте пластинам с добавленными каплями затвердеть при температуре 37 °C в течение 20 минут. По окончании инкубации в каждую лунку добавляют по 500 мкл предварительно подогретой среды (табл. 1) и инкубируют в клеточном инкубаторе при температуре 37 °С.
- После второй промывки удалите как можно больше надосадочной жидкости и повторно суспендируйте желаемое количество клеток (1000-5000 клеток на лунку 24-луночного планшета) в соответствующем BME для покрытия.
- Органоидная культура
- Обновляйте питательную среду (табл. 1) один раз в 2-3 дня. В начале культивирования культивируют органоиды ГЦК в изоляционной среде ГЦК (табл. 1) в течение 2 недель.
- После 2 недель инкубации с изолирующей средой ГЦК замените среду органоидным расширением ГЦК (Таблица 1) (хранить при 4 °C до 2 недель).
- Обновляйте питательную среду один раз в 3 дня.
- После 7-10 дней культивирования с помощью расширительной среды ГЦК, когда органоид достигнет соответствующей плотности или размера, начинайте экспериментальные вмешательства или пассаж или лиофилизацию органоидов по мере необходимости.
- Органоидный пассаж
- Подготовка расходных материалов и материалов
- Предварительно нагрейте планшеты клеточных культур со сверхнизкой поверхностью присоединения (24 лунки) в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C. Разморозьте замороженный BME в течение ночи при температуре 4 °C непосредственно перед использованием.
- Раствор органоидов и заменитель трипсина разогреть при 37 °C в течение 30 минут.
- Процесс пассажа
- После извлечения питательной среды из луночного планшета переложите органоидную суспензию в пробирку объемом 15 мл.
- Добавьте раствор для забора органоидов в соответствии с количеством BME (500 мкл раствора для сбора органоидов на 50 мкл BME) путем соскабливания и пипетирования вверх и вниз с помощью пистолета-пипетки объемом 1 000 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха на протяжении всего процесса, чтобы предотвратить потерю органоидов, так как наличие пузырьков воздуха указывает на более высокое давление пипетирования. - Выдерживать 30 мин при комнатной температуре.
- Осторожно аспирируйте BME с помощью пипетки на 1 000 мкл и наблюдайте, что BME полностью растворился. Наблюдайте каждые 10 мин до появления прозрачного кластера органоидных клеток, затем центрифугируйте при 400 × г в течение 5 минут при комнатной температуре и удаляйте как можно больше надосадочной жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе органоид можно заморозить и законсервировать. - Для ферментативного расщепления органоидов добавляют 1-5 мл заменителя трипсина (в зависимости от количества органоидов) и инкубируют при 37 °С в течение 2 мин. Понаблюдайте под микроскопом за степенью ферментативного расщепления, чтобы определить, диссоциируют ли органоиды на небольшие кластеры по 2-10 клеток; Если нет, продолжайте ферментативное сбраживание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Переваривание приводит к лизису кластеров органоидных клеток в отдельные клетки, снижая их жизнеспособность и продлевая время последующего культивирования. - Добавьте соответствующий объем холодной базальной среды (табл. 1), чтобы остановить пищеварение.
- Центрифугируют органоиды при 400 × г в течение 5 мин при 8 °С; Удалите надосадочную жидкость по мере возможности.
- Ресуспендируйте желаемое количество органоидов (1000-5000 органоидов на лунку 24-луночного планшета) в соответствующую матрицу для гальванизации. Выполните те же действия, что и в разделе 1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность покрытия должна быть оптимизирована в соответствии со скоростью роста и размером органоидов. - Пропускают органоиды каждые 10 дней в соотношении 1:3 или 1:4 в зависимости от плотности роста органоидов.
- Подготовка расходных материалов и материалов
- Криоконсервация и реанимация органоидов
- Криоконсервация органоидов
- Подготовьте пробирки для лиофилизации, каждая из которых сливается с двумя лунками 24-луночной пластины, содержащей органоиды.
- Выполните шаги 1.4.2.1 - 1.4.2.4 для пропуска органоидов для получения органоидов без BME и осторожно ресуспендируйте органоиды, добавив 500 мкл/лунку раствора лиофилизации органоидов в 24-луночный планшет.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от статуса роста и размера органоидов рекомендуется криоконсервировать органоиды в культуре до третьего поколения. - Перелейте суспензию в пробирки для лиофилизации и поместите ее в бокс с градиентным охлаждением при температуре -80 °C. После градиентного охлаждения при -80 °C в течение не менее 24 ч переведите пробирки в жидкий азот для длительного хранения.
- Реанимация органоидов
- Инкубируйте лиофилизированные пробирки на водяной бане с температурой 37 °C и прекратите инкубацию, когда останется только небольшой кусок льда.
- Центрифугу при 400 × г в течение 5 мин при 8 °C до полного удаления надосадочной жидкости.
- Следуйте разделам 1.2 и 1.3 для последующих операций.
- Криоконсервация органоидов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После выполнения вышеупомянутой процедуры появление сфероидных сфероидов ГЦК обычно наблюдается в течение 3 дней (рис. 1). На рисунках 1А, Б показан установленный органоид ГЦК, который быстро развивает компактные сфероиды, характеризующиеся закругленными краями и проницаемым цитозолем в начальный день укоренения. Во время роста органоидов ГЦК использование различных концентраций БМЭ по-разному влияло на скорость роста органоидов. Мы культивировали два органоида ГЦК, полученные от пациентов, в 10%, 30%, 50% и 100% БМЭ в течение 12 дней в экспансионной среде ГЦК (Таблица 1) и обнаружили, что БМЭ был интактным при 30% и 50%, а органоиды были близки по размеру и имели наибольший диаметр при этих концентрациях БМЭ. При 10% BME был наиболее фрагментированным, с узким пространством для роста органоидов и наименьшим диаметром. При 100% БМЭ БМЭ был наиболее интактным, но диаметр органоидов был посередине. Поэтому рекомендуется контролировать концентрацию БМЭ на уровне 30-50% в культуре органоидов ГЦК (рис. 2). Пролиферирующий органоид ГЦК можно эффективно размножать в соответствии с предписанным протоколом, достигая размера более 500 мкм в каждой культуре после трех поколений культуры (рис. 3). Последующие эксперименты, включая медикаментозное вмешательство и иммуногистохимическое окрашивание, могут быть проведены при достижении этого размера. Используя эту стратегию культивирования, мы добились значительного роста органоидов ГЦК, достигнув размеров, превышающих 1000 мкм в течение 20-дневного периода культивирования (рис. 4). Иммуногистохимическое окрашивание как органоидов ГЦК, так и парных опухолевых тканей выявило сходство в экспрессии генов-маркеров (рис. 5).
Рисунок 1: Органоиды ГЦК, полученные из хирургических тканей пациентов. (A,B) Репрезентативные изображения устойчивых культур органоидов ГЦК в первый день нанесения покрытия. (С,Д) Органоидные культуры ГЦК после 5 дней культивирования. Масштабные линейки = 500 мкм (A,C), 250 мкм (B,D). Аббревиатура: ГЦК = гепатоцеллюлярная карцинома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Исследовать рост моделей органоидов ГЦК при различных концентрациях БМЭ. Органоиды ГЦК А и В культивировали при одинаковой плотности посадки в течение 12 дней в 10%, 30%, 50% и 100% БМЭ с использованием расширительной среды ГЦК (табл. 1). Масштабные линейки = 1 000 мкм (А), 250 мкм (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Органоиды ГЦК в длительной амплификации. (А,Б) Репрезентативные изображения органоидов ГЦК на десятый день прохождения 8. Масштабная линейка = 500 мкм (А), 250 мкм (В). Аббревиатура: ГЦК = гепатоцеллюлярная карцинома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Максимальный размер органоидов ГЦК. Репрезентативные изображения органоидов ГЦК в 20-дневном культивируемом периоде в пассаже 8 . Масштабная линейка = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Гистопатологическая характеристика органоидов ГЦК и парных опухолевых тканей. Методом иммуногистохимии выявлена экспрессия генных маркеров органоидов ГЦК и парных опухолевых тканей, маркера ГЦК АФП, дифференцированных маркеров гепатоцитов HNF4A и ALB, протоковых маркеров SOX9 и EPCAM, желчного маркера KRT19. Масштабная линейка = 100 мкм. Сокращения: АФП = альфа-фетопротеин; HNF4A = ядерный фактор гепатоцитов 4 альфа; ALB = альбумин; SOX9 = фактор транскрипции SRY-Box 9; EPCAM = молекула адгезии эпителиальных клеток; KRT19 = Кератин 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав сред и растворов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из заметных преимуществ органоидных моделей, полученных от пациентов, является их способность точно воспроизводить биологические характеристики опухолей, охватывая структуру тканей и геномный ландшафт. Эти модели демонстрируют выдающийся уровень точности и эффективно отражают гетерогенность и прогрессирование опухолей даже в течение длительных периодов культивирования 6,8,9. Благодаря использованию этого усовершенствованного протокола культивирования органоидов мы эффективно создали модели органоидов ГЦК, полученные от пациентов, способствуя устойчивому росту in vitro, а также способности криоконсервировать и впоследствии реанимировать органоиды по мере необходимости для экспериментальных целей. По сравнению с предыдущими протоколами, эти органоиды демонстрируют повышенные темпы роста и способны достигать больших размеров в культуре. Впоследствии мы подвергли хорошо зарекомендовавшие себя органоиды воздействию препаратов, связанных с антителами, полученных из предварительно отобранных потенциальных онкогенных мишеней, что привело к заметным терапевтическим результатам, которые согласуются с моделями PDX на животных in vivo 10,11.
Цель данного исследования состояла в том, чтобы исправить недостатки предыдущих протоколов установления органоидов ГЦК, что привело к образованию органоидов ГЦК большего размера в стабильных условиях пассации и культивирования. Мы оптимизировали концентрацию БМЭ для улучшения скорости роста органоидов при одновременном снижении стоимости эксперимента; добавил в исходную формулу культуры важный фактор CHIR99021, который может способствовать самообновлению стволовых клеток в органоидах и усиливать пролиферацию органоидов; усовершенствовал метод удаления БМЭ, от первоначального метода механической сепарации до использования специального уборочного раствора, для увеличения количества получаемого органоида и повышения эффективности; дополнил операционные этапы криоконсервации и реанимации органоидов, выстроил весь процесс культивирования органоидов ГЦК. С помощью этого протокола культивирования органоидов можно достичь среднего размера органоида 800 мкм за один 20-дневный период культивирования, при этом несколько устойчивых органоидов ГЦК вырастают до более чем 1000 мкм. Конечная цель состоит в том, чтобы повысить точность стратегий лечения ГЦК и создать надежную модель и платформу для разработки лекарственных препаратов. Эти усилия будут способствовать улучшению показателей выживаемости пациентов с ГЦК и предоставлению новых решений для борьбы с проблемами лекарственной устойчивости 11,12,13.
Тем не менее, необходимо учитывать множество аспектов дискурса. В первую очередь, существенным препятствием является снижение эффективности создания органоидов ГЦК, особенно у пациентов с ГЦК средней и поздней стадии, перенесших различные терапевтические вмешательства, включая транскатетерную артериальную химиоэмболизацию (TACE), химиотерапию и таргетную терапию 4,5. Часто опухолевая активность иссеченных образцов ГЦК нарушается, что приводит к снижению успешности генерации органоидов. Между тем, при предыдущем установлении органоидов ГЦК другими группами было обнаружено, что существует корреляция между долей пролиферирующих клеток в опухоли, степенью дифференцировки опухоли и установлением органоидов 6,9. Таким образом, достижение высокого уровня успеха в развитии органоидов ГЦК тесно связано с лечением, применяемым до операции пациента, а также с необходимостью дополнительных суждений патологоанатома после получения опухолевых тканей. Кроме того, несмотря на то, что органоиды должны воспроизводить гетерогенность ГЦК, определение того, происходит ли органоид в культуре от одиночного клеточного клона или включает в себя смесь клеток с различными генетическими профилями, представляет собой сложную задачу. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования, чтобы расширить наше понимание клональной динамики и генетического разнообразия органоидов ГЦК. Кроме того, крайне важно устранить ограничения, присущие современным методам культивирования органоидов на основе планшетов. Одним из заметных ограничений является ограниченный потенциал роста органоидов. Культивирование органоидов ГЦК с помощью этого протокола позволяет достичь диаметров более 1000 мкм. Однако на более поздних стадиях культивирования почерневший некроз часто возникает в области ядра органоида, из-за недостаточного поступления питательных веществ и кислорода, что ограничивает потенциал развития органоидов. Таким образом, существует острая необходимость в разработке стратегий, направленных на улучшение доставки питательных веществ и насыщения кислородом в системе органоидных культур.
Таким образом, органоидные модели, полученные от пациентов, дают заметные преимущества в точном воспроизведении биологических характеристик ГЦК. Тем не менее, все еще существуют препятствия, которые необходимо преодолеть в отношении эффективности установления органоидов, клональной динамики и ограничений, присущих методам культивирования органоидов. Решая эти проблемы, можно еще больше повысить полезность органоидных моделей ГЦК для понимания болезни и продвижения усилий по разработке лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Исследование выполнено при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82122048; 82003773; 82203380) и Фонда фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований провинции Гуандун (2023A1515011416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A.
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A.
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
