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Neuroscience

Murine Cornea में neurotrophic keratitis और तंत्रिका उत्थान प्रेरित करने के लिए तीन रणनीतियाँ

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/66182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Institute for Neurosciences of Montpellier, University of Montpellier, INSERM, 2Department of Ophthalmology, Gui de Chauliac Hospital

Summary

यहां, हम कॉर्निया को संक्रमित करने वाले संवेदी तंतुओं को नुकसान पहुंचाने के तीन अलग-अलग तरीकों का प्रस्ताव करते हैं। ये विधियां चूहों में अक्षतंतु पुनर्जनन के अध्ययन की सुविधा प्रदान करती हैं। ये तीन तरीके, जो अन्य पशु मॉडल के अनुकूल हैं, कॉर्नियल संक्रमण शरीर विज्ञान और उत्थान के अध्ययन के लिए आदर्श हैं।

Abstract

कॉर्निया एक पारदर्शी ऊतक है जो आंख को ढकता है और स्पष्ट दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है। यह शरीर में सबसे अधिक संक्रमित ऊतक है। यह संरक्षण आंख को सनसनी और ट्रॉफिक फ़ंक्शन प्रदान करता है और कॉर्नियल अखंडता को संरक्षित करने में योगदान देता है। इस संक्रमण के पैथोलॉजिकल व्यवधान को न्यूरोट्रॉफिक केराटाइटिस कहा जाता है। यह आंख, सर्जरी या बीमारी की चोट से शुरू हो सकता है। इस अध्ययन में, हम उन तरीकों से संक्रमण पर नुकसान पहुंचाने के लिए तीन अलग-अलग प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं जो क्लिनिक में आम तौर पर सामने आने वाले तीन प्रकार के मामलों को पुन: प्राप्त करते हैं।

पहली विधि में एक नेत्र गड़गड़ाहट के साथ उपकला का घर्षण बनाना शामिल है। इसमें उपकला परत, मुक्त तंत्रिका अंत और सबबेसल प्लेक्सस को क्लिनिक में की गई फोटोरिफ्रेक्टिव केराटेक्टोमी सर्जरी के समान तरीके से हटाना शामिल है। दूसरी विधि केवल बायोप्सी पंच के साथ परिधि पर इसे खंडित करके संक्रमण को लक्षित करती है, उपकला की अखंडता को बनाए रखती है। यह विधि लैमेलर केराटोप्लास्टी के पहले चरणों के समान है और केंद्रीय कॉर्निया में अक्षतंतु के पुनर्विकास के बाद संक्रमण के अध: पतन की ओर जाता है। अंतिम विधि एक मल्टीफोटन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के संक्रमण को नुकसान पहुंचाती है, जो विशेष रूप से फ्लोरोसेंट तंत्रिका तंतुओं के cauterization की साइट को स्थानीयकृत करती है। यह विधि फोटोकैराटाइटिस के समान नुकसान पहुंचाती है, यूवी प्रकाश के लिए एक ओवरएक्सपोजर।

यह अध्ययन कॉर्नियल संक्रमण के फिजियोपैथोलॉजी की जांच के लिए विभिन्न विकल्पों का वर्णन करता है, विशेष रूप से अक्षतंतु के अध: पतन और पुनर्जनन। उत्थान को बढ़ावा देना उपकला दोष या यहां तक कि कॉर्निया के छिद्र जैसी जटिलताओं से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रस्तावित मॉडल नए औषधीय अणुओं या जीन थेरेपी का परीक्षण करने में मदद कर सकते हैं जो तंत्रिका पुनर्जनन को बढ़ाते हैं और रोग की प्रगति को सीमित करते हैं।

Introduction

कॉर्निया, जो आंख की पारदर्शी सतह है, तीन अलग-अलग परतों से बना है: उपकला, स्ट्रोमा और एंडोथेलियम। इस अंग में शरीर में संक्रमण का घनत्व सबसे अधिक होता है और यह मुख्य रूप से संवेदी तंतुओं (प्रकार Aδ और C) से बना होता है जो ट्राइजेमिनल नाड़ीग्रन्थि की नेत्र शाखा से उत्पन्न होता है। संवेदी फाइबर बड़े बंडलों के रूप में मध्य-स्ट्रोमा में कॉर्निया की परिधि में प्रवेश करते हैं जो सतह को कवर करने के लिए शाखा बनाते हैं। फिर वे बोमन की झिल्ली को छेदने के लिए द्विभाजित होते हैं और सबबेसल प्लेक्सस बनाते हैं, जो कॉर्निया के केंद्र में एक भंवर के गठन से आसानी से पहचानने योग्य होता है। वे तंतु उपकला की बाहरी सतह पर मुक्त तंत्रिका अंत के रूप में समाप्त होते हैं। वे थर्मल, मैकेनिकल और रासायनिक उत्तेजनाओं को ट्रांसड्यूस करने और उपकला होमियोस्टेसिस 1,2 के लिए आवश्यक ट्रॉफिक कारकों को जारी करने में सक्षम हैं। न्यूरोट्रॉफिक केराटाइटिस (एनके) कॉर्नियल संवेदी संक्रमण को प्रभावित करने वाली एक अपक्षयी बीमारी है। यह दुर्लभ बीमारी कॉर्नियल संवेदनशीलता में कमी या हानि से उपजी है जिसके परिणामस्वरूप कम आंसू उत्पादन और कॉर्निया3 के खराब उपचार गुण होते हैं। एनके तीन अच्छी तरह से वर्णित चरणों के माध्यम से प्रगति करता है, चरण 1 से जहां रोगियों को उपकला दोष होते हैं, चरण 3 तक जहां स्ट्रोमल पिघलने और / या कॉर्नियल वेधहोता है 4.

नैदानिक रूप से, इस बीमारी की उत्पत्ति विविध हो सकती है। मरीजों को आंख के लिए शारीरिक चोट के बाद कॉर्नियल संक्रमण खो सकते हैं, सर्जरी, या पुरानी बीमारियों के माध्यम से, मधुमेह 5,6 जैसे. आज तक, एनके रोगजनन प्रक्रिया खराब समझ में आती है, और इस दृष्टि-धमकी की स्थिति के लिए चिकित्सीय विकल्प बहुत सीमित हैं। इसलिए, उन तंतुओं के पुनर्जनन के पीछे तंत्र को बेहतर ढंग से समझने और संभावित रूप से उन्हें बढ़ावा देने के लिए उपकला दोषों की विशेषताओं की बेहतर समझ की आवश्यकता है। यहां, हम कॉर्नियल चोट के कई मॉडल प्रस्तावित करते हैं जो चूहों में एनके को प्रेरित करते हैं।

पहला मॉडल एक ओकुलर गड़गड़ाहट के साथ कॉर्निया की उपकला परत का घर्षण है। इस मॉडल का अध्ययन मुख्य रूप से कृन्तकों और मछली 7,8,9 जैसे विभिन्न जानवरों में उपकला के उत्थान के संदर्भ में किया गया है, और कॉर्नियल हीलिंग10,11को बढ़ावा देने वाले अणुओं का परीक्षण करने के लिए। शारीरिक रूप से, घाव को बंद करने के लिए उपकला कोशिकाओं के लिए 2-3 दिन लगते हैं। संरक्षण के शारीरिक पैटर्न, तथापि, घर्षण12,13 से उबरने के लिए चार सप्ताह से अधिक समय लगता है. सर्जरी के दौरान, ओकुलर गड़गड़ाहट कॉर्निया की उपकला परत को हटा देती है जिसमें सबबेसल प्लेक्सस और फाइबर के मुक्त तंत्रिका अंत होते हैं। आंखों के अपवर्तक दोषों को ठीक करने के लिए फोटोरिफ्रेक्टिव केराटेक्टोमी (पीआरके) वाले रोगियों की तुलना में इस प्रक्रिया की चिकित्सकीय तुलना की जा सकती है। प्रक्रिया में कॉर्निया के उपकला को हटाने और फिर लेजर14 के साथ स्ट्रोमा को फिर से आकार देना शामिल है। मरीजों को इस तरह की सर्जरी के बाद कई साइड इफेक्ट का अनुभव कर सकते हैं, इस तरह के लिए कॉर्नियल तंत्रिका घनत्व की कमी के रूप में 2 साल और की अवधि के लिए संवेदनशीलता में कमी 3 सर्जरी के बाद एक वर्ष के लिए 3 महीने15. यह देखते हुए कि सर्जरी कॉर्नियल माइक्रोएन्वायरमेंट की नाजुकता को प्रेरित करती है, यह मॉडल इन दुष्प्रभावों की जांच करने और चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने में मदद कर सकता है जो तेजी से पुनर्जन्म को बढ़ावा देगा, इस प्रकार प्रश्न में दुष्प्रभावों को कम करेगा।

दूसरे मॉडल में बायोप्सी पंच के साथ कॉर्निया की परिधि पर अक्षतंतु को विभाजित करना शामिल है, जो केंद्रीय संक्रमण 16 के वालेरियन अध: पतन को प्रेरित करता है। नैदानिक रूप से, इस विधि पूर्वकाल लैमेलर keratoplasty की तुलना में किया जा सकता है, जिसमें सर्जन कॉर्निया के पूर्वकाल मोटाई का एक हिस्सा को दूर करने और एक दाता प्रत्यारोपण 17 के साथ यह बदलने के लिए कॉर्निया के एक आंशिक trephination का एहसास है. लैमेलर केराटोप्लास्टी के बाद, रोगियों को सूखी आंख, कॉर्नियल संरक्षण और भ्रष्टाचार अस्वीकृति18 की हानि सहित लक्षणों की एक संख्या से पीड़ित हो सकता है. कॉर्नियल नसों पर किया गया यह एक्सोटॉमी मॉडल फाइबर अपघटन के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, जो एक ग्राफ्ट के बाद होता है, इसके बाद अक्षतंतु का उत्थान होता है।

तीसरी विधि एक लेजर के साथ कॉर्नियल नसों को नुकसान पहुंचाती है। संवेदनाहारी जानवरों के कॉर्निया पर एक multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, ऑप्टिकल क्षेत्र में स्थानीयकृत नसों के अध: पतन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) गठन का एक परिणाम के रूप में प्रेरित है, जो डीएनए क्षति और सेलुलर गुहिकायन19 की ओर जाता है. इस विधि भी आरओएस गठन से चलाता है, जो प्राकृतिक यूवी (सनबर्न) के लिए overexposure द्वारा प्रेरित कॉर्नियल photodamage recapitulates, डीएनए क्षति20 के लिए अग्रणी. कॉर्नियल सनबर्न से पीड़ित मरीजों को बहुत दर्द होता है, क्योंकि उपकला कोशिकाओं की गिरावट कॉर्नियल फाइबर के चरम सीमाओं को वंचित करती है।

यहां वर्णित तीन विधियों को एनके रोगजनन प्रक्रिया और अक्षतंतु पुनर्जनन की जांच को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। वे आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक हैं। इसके अलावा, वे जानवरों की त्वरित वसूली और आसान निगरानी की अनुमति देते हैं।

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Protocol

सभी प्रयोगों को राष्ट्रीय पशु प्रयोग बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. तैयारी

  1. संज्ञाहरण के लिए केटामाइन-xylazine का एक संवेदनाहारी समाधान तैयार करें। केटामाइन 80 मिलीग्राम/किग्रा पर केटामाइन और 10 मिलीग्राम/किग्रा पर xylazine इंजेक्ट करें, 200 μL केटामाइन (100 मिलीग्राम/एमएल) और 125 μL xylazine (20 मिलीग्राम/एमएल) को 2,175 एमएल बाँझ 0.9% NaCl में पतला करके।
  2. 0.02 mg/mL buprenorphine समाधान को बाँझ 0.9% NaCl के 1,400 mL में 0.3 mg/mL buprenorphine के 100 μL जोड़कर एनाल्जेसिक समाधान के रूप में तैयार करें।
  3. फ्लोरोसेंट धुंधला समाधान तैयार करें।
    1. फ्लोरेसिन नमक के 10 मिलीग्राम वजन करने के लिए एक ठीक पैमाने का उपयोग करें और 0.1% फ्लोरेसिन समाधान प्राप्त करने के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 10 एमएल में इसे पतला करें।
    2. प्रकाश से समाधान को सुरक्षित रखें और इसे 5 मिनट के लिए हिलाएं। समाधान को फ़िल्टर करने के लिए 10 एमएल सिरिंज और 0.2 माइक्रोन के सिरिंज फिल्टर का उपयोग करें।
      नोट: फ्लोरोसेंट समाधान को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए और 5 दिनों के लिए +4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. माउस की तैयारी
    1. माउस वजन और संवेदनाहारी समाधान के माउस वजन (मेगावाट) के 10 μL/g के intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन द्वारा संज्ञाहरण प्रेरित. जब माउस चलती बंद हो जाता है, यह एक गर्म प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस) पर जगह और सत्यापित करें कि यह पूरी तरह से अपने पैर की उंगलियों चुटकी से संवेदनाहारी है.
    2. सर्जरी से गुजरने वाली आंख पर कृत्रिम आंसू की एक बूंद और विपरीत आंख पर ओकुलर जेल की एक बूंद लागू करें।
    3. एक बार जब माउस चुटकी के लिए अनुत्तरदायी होता है, तो गर्दन में 0.1 मिलीग्राम/किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन को चमड़े के नीचे 0.1 मिलीग्राम/किग्रा प्रदान करने के लिए 5 माइक्रोन/ग्राम पर एनाल्जेसिया (0.02 मिलीग्राम/एमएल ब्यूप्रेनोर्फिन) इंजेक्ट करें।

2. कॉर्निया का घर्षण

  1. फ्लोरोसेंट धुंधला समाधान तैयार करने के लिए चरण 1.3 का पालन करें।
  2. माउस तैयार करने के लिए चरण 1.4 का पालन करें.
  3. घर्षण करने से पहले, ओकुलर गड़गड़ाहट को 70% EtOH में डुबोएं और फिर इसे साफ करने के लिए पीबीएस में।
  4. आसानी से सर्जरी के दौर से गुजर आंख का उपयोग करने के लिए पक्ष पर एक गर्म प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस) पर माउस रखें.
    1. कृत्रिम आंसू को अवशोषित करने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें और आंख को छूने के बिना पलकों को दूर करें।
    2. ओकुलर गड़गड़ाहट चालू करें, माउस की पलक को दो उंगलियों से खोलें, और साथ ही साथ कंपन को ब्लॉक करें ताकि वे गड़गड़ाहट में फंस न जाएं।
  5. पुतली या आंख के केंद्र को स्थानीयकृत करें और आंख की सतह पर ओकुलर गड़गड़ाहट लागू करें, और परिपत्र आंदोलनों को करें। बारीकी से देखने से, हटाए गए उपकला की सतह देखी जा सकती है। अन्यथा, कॉर्निया पर लगभग 20 परिपत्र आंदोलन करें।
  6. माउस को वापस उसके पेट पर रखें और जांचें कि क्या ओकुलर जेल अभी भी contralateral आंख में मौजूद है।
  7. एब्रेडेड आंख पर फ्लोरोसेंट धुंधला समाधान की एक बूंद लागू करें और 20 एस के लिए प्रतीक्षा करें। आंख को छूने के बिना एक ऊतक के साथ ड्रॉप को अवशोषित करें और इसे कृत्रिम आंसू की एक बूंद से कुल्ला। एक ऊतक के साथ कृत्रिम आंसू की बूंद को अवशोषित करें और नीले कोबाल्ट लैंप के साथ आंख को रोशन करें।
    नोट: घर्षण का एक गोलाकार आकार होना चाहिए। इसे प्राप्त करने के लिए कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है।
  8. एब्रेडेड आंख पर ओकुलर जेल की एक बूंद लागू करें और माउस को गर्म पैड पर जागने दें। जब माउस अपने आप आगे बढ़ रहा है, तो इसे वापस अपने पिंजरे में डाल दें।
  9. निम्नलिखित 2 दिनों के दौरान पशु की भलाई की जाँच करें।
  10. ओकुलर गड़गड़ाहट के उपयोग के बाद, गड़गड़ाहट के सिर में फंसी उपकला कोशिकाओं को हटाने के लिए एक नरम ऊतक का उपयोग करें और इसे 70% EtOH और फिर पीबीएस में डुबोएं।
    नोट: एक बार उपकला कोशिकाओं को नरम ऊतक के साथ हटा दिया जाता है, सुनिश्चित करें कि ऊतक का कोई टुकड़ा गड़गड़ाहट के सिर में फंस गया है।

3. कॉर्नियल नसों की एक्सोटॉमी

  1. माउस तैयार करने के लिए चरण 1.4 का पालन करें.
  2. सर्जरी के दौर से गुजर आंख का उपयोग करने के लिए पक्ष में एक दूरबीन लूप के नीचे माउस रखें. आंख क्षैतिज होने के लिए माउस के सिर के नीचे एक पेट्री डिश के नीचे रखो.
    नोट: दूरबीन लूप के माध्यम से देखकर निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन किया जाएगा।
  3. एक कपास झाड़ू के साथ कृत्रिम आंसू निकालें और आंख को छूने के बिना पलकों को हटा दें।
  4. कक्षा से बाहर निकलने के लिए जानवर की आंख के नीचे चिकनी घुमावदार सरौता रखें। सुनिश्चित करें कि आंख के लिए पर्याप्त रूप से सरौता को बंद कर दिया जाए ताकि दबाव लागू होने के बाद कक्षा में वापस जाने में सक्षम न हो, लेकिन ऑप्टिक तंत्रिका क्षति को रोकने के लिए अत्यधिक नहीं।
  5. कॉर्निया की सतह के साथ पंच के कुल संपर्क को सुनिश्चित करने के लिए दबाव के बिना आंख पर लंबवत 2.5 मिमी की बायोप्सी पंच लागू करें।
    नोट: एक बार कॉर्निया के खिलाफ पंच लागू होने के बाद, प्रयोगकर्ता का हाथ देखने के क्षेत्र में हस्तक्षेप कर सकता है।
  6. फिर, दबाव डालना शुरू करें और पंच को कई बार मोड़ें।
    नोट: दबाव के आधार पर, ट्विस्ट की संख्या भिन्न हो सकती है, लेकिन आम तौर पर यह लगभग 5 है। सही दबाव और गति महसूस करने के लिए प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। यदि बहुत अधिक दबाव डाला जाता है, तो आंख फट जाती है। इस मामले में, घाव से बाहर निकलने वाले तरल को देखा जा सकता है और आंख नरम हो जाती है। पशु की बलि देनी पड़ती है।
  7. बायोप्सी पंच निकालें। कॉर्निया पर एक सर्कल दिखाई देना चाहिए जहां बायोप्सी पंच लगाया गया था।
    नोट: अगले चरणों में दूरबीन लूप की आवश्यकता नहीं है।
  8. जांचें कि क्या कॉन्ट्रालेटरल आई में अभी भी ओकुलर जेल है और एक्सोटोमाइज्ड आंख पर कुछ लागू करें।
  9. माउस एक गर्म पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर जाग और यह अपने आप पर आगे बढ़ रहा है जब यह अपने पिंजरे में वापस डाल दिया.
  10. निम्नलिखित 2 दिनों के दौरान पशु की भलाई की जाँच करें।

4. कॉर्निया पूरे-माउंट प्रसंस्करण

  1. नमूना संग्रह और निर्धारण।
    1. माउस वजन और संवेदनाहारी समाधान के माउस वजन (मेगावाट) के 10 μL/g के एक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन द्वारा संज्ञाहरण प्रेरित.
    2. जब माउस चलती बंद हो जाता है और पैर की अंगुली चुटकी द्वारा सजगता नहीं है, एक ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन.
    3. दो उंगलियों का उपयोग करके आंख को कक्षा से बाहर निकालें और घुमावदार कैंची का उपयोग करके ऑप्टिक तंत्रिका को काटकर आंख को एन्यूक्लिएट करें।
    4. पीबीएस युक्त एक 2 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में आंख रखें.
    5. पीबीएस को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ बदलकर और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर एक प्रकार के बरतन (30 आरपीएम) पर रखकर आंख को ठीक करें।
    6. एक प्रकार के बरतन (30 आरपीएम) पर आरटी पर पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला.
  2. कॉर्निया का विच्छेदन
    1. पेट्री डिश के अंदर पैराफिल्म के एक टुकड़े पर पीबीएस की एक बूंद रखें।
    2. पीबीएस की इस बूंद में आंख रखें.
    3. दूरबीन लूप के नीचे पेट्री डिश रखें.
    4. microdissection कैंची और संदंश का उपयोग कॉर्निया काटना. लिम्बस रखने के लिए सिलिअरी बॉडी के ऊपर काटें।
    5. लेंस, सिलिअरी शरीर, और ठीक संदंश के साथ परितारिका निकालें.
    6. कॉर्निया को वापस 2 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में रखें।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल
    1. कॉर्निया को 2.5% मछली त्वचा जिलेटिन, 5% बकरी सीरम, और पीबीएस में 0.5% डिटर्जेंट के 2 एमएल में आरटी पर आरटी पर 1 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन (30 आरपीएम) पर इनक्यूबेट करें।
    2. 2.5% मछली त्वचा जिलेटिन, 5% बकरी सीरम, और पीबीएस में 0.1% डिटर्जेंट के समाधान के 150 माइक्रोन में कॉर्निया को इनक्यूबेट करें, जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी 1/1000 (एंटी βIII ट्यूबुलिन एंटीबॉडी) पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पतला होता है एक प्रकार के बरतन (30 आरपीएम)।
    3. एक प्रकार के बरतन (30 आरपीएम) पर आरटी पर पीबीएस में 0.1% डिटर्जेंट के साथ 1 घंटे के लिए 3 बार कुल्ला।
    4. चरण 4.3.2 के लिए एक ही समाधान में कॉर्निया को इनक्यूबेट करें, जिसमें माध्यमिक एंटीबॉडी एक प्रकार के बरतन (30 आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 1/500 पर पतला होता है।
    5. एक प्रकार के बरतन (30 आरपीएम) पर आरटी पर पीबीएस के साथ 1 घंटे के लिए 3 बार कुल्ला.
    6. डीएनए इंटरकलेटर के 150 माइक्रोन के साथ 10 मिन के लिए कॉर्निया को इनक्यूबेट करें, जो एक प्रकार के बरतन (30 आरपीएम) पर आरटी पर 1/5000 पर पतला हो।
    7. पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 2 बार कुल्ला.
  4. कॉर्निया का माउंटिंग
    1. कॉर्निया को स्लाइड पर रखें, स्लाइड का सामना करने वाले उपकला, और केंद्र तक पहुंचने के बिना चार खंड बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
      नोट: फूल का आकार बनाने के लिए एक दूसरे के विपरीत अनुभाग करें।
    2. कॉर्निया एंडोथेलियम स्लाइड का सामना करना पड़ प्लेस और एक ऊतक का उपयोग कॉर्निया के आसपास पीबीएस हटा दें.
      नोट: कॉर्निया के नीचे पीबीएस को न हटाएं; अन्यथा, हवा के बुलबुले दिखाई दे सकते हैं। यदि हां, तो कॉर्निया में पीबीएस जोड़ें और हवा के बुलबुले को हटा दें। उसके बाद चरण 4.3.2 से पुनरारंभ करें।
    3. एक आयताकार कवरस्लिप के चार कोनों पर मॉडल पेस्ट जोड़ें।
      नोट: मॉडल पेस्ट कवरस्लिप को ऊपर उठाता है क्योंकि कॉर्निया एक मोटा ऊतक है।
    4. कॉर्निया पर एक बढ़ते माध्यम के 50 माइक्रोन ड्रॉप करें और बुलबुला गठन से बचने के लिए ऊपर कवरस्लिप को ध्यान से रखें।
    5. नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें।
  5. इमेजिंग
    1. एक epifluorescent खुर्दबीन के तहत स्लाइड रखें.
    2. मोज़ेक के आकार और छवि की गहराई को परिभाषित करें और अधिग्रहण शुरू करें।
    3. अधिग्रहीत छवि पर एक deblurring और deconvolution कार्यक्रम लागू करें।
      नोट: चरण 4.6.3 अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (बड़ी मात्रा कम्प्यूटेशनल समाशोधन [LVCC]) पर चयनित एक विकल्प है

5. कॉर्नियल नसों का स्थानीयकृत लेजर पृथक्करण

  1. ईमानदार multiphoton खुर्दबीन और लेजर एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला के साथ संयुक्त पर मुड़ें. माइक्रोस्कोप (37 डिग्री सेल्सियस) के गर्म चरण को सक्रिय करें और माउस मॉडल के लिए आवश्यक तरंग दैर्ध्य के अनुरूप 850 एनएम और 1100 एनएम पर लेजर सेट करें।
  2. लगभग 20 मेगावाट पर एक साथ लेज़रों की शक्ति सेट करने के लिए बिजली मीटर का उपयोग करें।
  3. माउस तैयार करने के लिए चरण 1.4 का पालन करें और दोनों आंखों पर नेत्र जेल लागू करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जानवर एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन (जादू मार्कर ट्रांसजेनिक माउस21) कि कॉर्नियल तंत्रिका फाइबर में एक अंतर्जात फ्लोरोफोर व्यक्त से किया गया है.
  4. एक सिर धारक में पशु स्थापित करें. छत का सामना करने के लिए ब्याज की आंख के लिए जानवर 90 ° मुड़ें।
  5. आंख क्षेत्र को साफ करने के लिए जानवर के vibrissae पट्टा. सांस लेने से प्रेरित सिर की गति को कम करने के लिए जानवर के शरीर का पट्टा करें।
  6. ओकुलर जेल के ऊपर आंख पर एक गोलाकार कवरस्लिप रखें। कवरस्लिप क्षैतिज होना चाहिए। कवरस्लिप को सही ढंग से तैनात करने के लिए जानवर के सिर को स्थानांतरित करने में संकोच न करें।
  7. कवरस्लिप के ऊपर पीबीएस की एक बूंद जोड़ें। खुर्दबीन मंच पर जानवर ध्यान से प्लेस और सही दूरी पर उद्देश्य बुर्ज सेट.
  8. ऐपिस के माध्यम से आंख और संक्रमण को स्थानीय बनाने के लिए जलीय 20x उद्देश्य और एपिफ्लोरेसेंस का उपयोग करें।
  9. लेज़रों को सक्रिय करें और उस गहराई को परिभाषित करें जिसे रोशन करने की आवश्यकता है।
  10. अधिकतम स्कैन गति के 70% -85% की अधिग्रहण गति पर 1024 x 1024 (पिक्सल) छवि प्राप्त करें।
  11. एक बार छवि हासिल कर लिया है, खुर्दबीन से जानवर ले लो और coverslip और पट्टियों को हटा दें. सिर धारक से जानवर निकालें, यदि आवश्यक हो तो अधिक ओकुलर जेल जोड़ें, और इसे गर्म प्लेट पर पिंजरे में जगाने दें।
    नोट: इमेजिंग के 1 सप्ताह बाद संरक्षण का विनाश देखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को लेज़रों के कारण होने वाले नुकसान को बढ़ाने के लिए कई हफ्तों तक सप्ताह में एक बार दोहराया जा सकता है।
  12. जब जानवर अपने आप आगे बढ़ रहा हो, तो पिंजरे को वापस स्थिर में रख दें और अगले 2 दिनों के लिए उसकी भलाई की जांच करें।

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Representative Results

यह अध्ययन चूहों में कॉर्नियल संक्रमण पर नुकसान पहुंचाने के लिए कई प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करता है। जबकि इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग उपकला के उपचार के फिजियोपैथोलॉजी की जांच के लिए किया गया है, हमने कॉर्नियल संक्रमण पुनर्जनन की जांच के नए तरीकों को अनुकूलित और विकसित करना चुना। संरक्षण का निरीक्षण करने के लिए, हमने दो तकनीकों का उपयोग किया। सबसे पहले, हमने एक पैन-न्यूरोनल एंटीबॉडी (बीआईआई ट्यूबलिन) और एक इंटरकेलेटर के साथ नाभिक का उपयोग करके तंत्रिका तंतुओं को दागने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक को नियोजित किया। दूसरा, हमने तंत्रिका तंतुओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक माउस तनाव का लाभ उठाया। कॉर्निया को एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था।

पहली विधि ने कॉर्नियल उपकला परत(चित्रा 1ए)को हटाने के लिए 0.5 मिमी की जंग की अंगूठी हटानेवाला के साथ एक नेत्र गड़गड़ाहट का इस्तेमाल किया। यह अध्ययन उपकला के अंदर स्थित संक्रमण के कारण होने वाले नुकसान पर केंद्रित है, जो इसके उत्थान में शामिल सेलुलर और आणविक घटकों को समझने के साधन के रूप में है। सर्जरी से पहले, बेसल उपकला बरकरार थी। सबबेसल प्लेक्सस में तंत्रिका तंतुओं ने भंवर (चित्रा 1 बी) नामक एक विशिष्ट पैटर्न का गठन किया। इस तकनीक में इस्तेमाल की जाने वाली गड़गड़ाहट की नोक ने कॉर्निया की केवल पहली परत को हटा दिया, लेकिन स्ट्रोमा दोनों को संरक्षित किया, जहां फाइबर के बड़े बंडल स्थित हैं, और एंडोथेलियम। गड़गड़ाहट द्वारा हटाए गए उपकला का हिस्सा आसानी से दिखाई दे रहा था, क्योंकि बेसल उपकला और सबबेसल प्लेक्सस (चित्रा 1बी) का स्पष्ट टूटना था। केराटोसाइट्स के नाभिक को आसानी से पहचाना जा सकता है क्योंकि वे पूरे स्ट्रोमा में बहुत कम व्यवस्थित होते हैं। संक्रमण के संबंध में, सीमा भी स्पष्ट थी, सबबेसल प्लेक्सस के टूटने के साथ स्ट्रोमा के अंदर तंतुओं के बड़े बंडलों को देखा जा सकता था। जबकि उपकला को ठीक होने में लगभग 3 दिन लगते हैं, घर्षण के बाद संक्रमण के पुनर्जनन में 4 सप्ताह से अधिक समय लगता है। चित्रा 1 सर्जरी के 1 सप्ताह बाद उपकला के उत्थान को दिखाता है, जिसमें बेसल उपकला चिकनी होती है। हालांकि, कॉर्निया के केंद्र से भंवर अनुपस्थित है, यह देखते हुए कि संक्रमण अभी तक उस बिंदु पर वापस नहीं आया है।

दूसरी विधि में कॉर्निया की परिधि पर नसों को 2.5 मिमी व्यास की बायोप्सी पंच के साथ विभाजित करने के बजाय उन्हें गड़गड़ाहट(चित्रा 2ए)के साथ ब्रश करना शामिल है। यह विधि उपकला को घर्षण जितना बाधित नहीं करती है। सर्जरी के बाद, एक पतली परिधीय अंगूठी बिंदु पर मनाया जा सकता है जहां बायोप्सी पंच लागू किया गया था, बेसल उपकला(चित्रा 2बी)को नुकसान पहुंचा। हालांकि, परिधि पर नसों को खंडित किया गया है, जिससे अक्षतंतु के वालेरियन अध: पतन को ट्रिगर किया गया है। इस प्रकार के अध: पतन में कोशिका शरीर की ओर न्यूरॉन्स के टर्मिनल अंत से नसों का क्षय होता है और इस मामले में, बायोप्सी पंच द्वारा प्रेरित अनुभाग की ओर। एक्सोटॉमी की गहराई के आधार पर, क्षति गंभीर हो सकती है। यहां, हम देखते हैं कि भारी अध: पतन हुआ है, जिससे उपकला (चित्रा 2बी) में कॉर्निया के केंद्र में संक्रमण का कुल नुकसान हुआ है। चूंकि उपकला होमियोस्टेसिस के रखरखाव के लिए संक्रमण आवश्यक है, उपकला परत का विघटन शुरू किया जाता है, जिससे अल्सर(चित्रा 2बी)का निर्माण होता है। अल्सर का गठन केवल भारी क्षतिग्रस्त कॉर्निया में हुआ।

अंतिम तकनीक में स्थानीय रूप से विवो में जलने के होते हैं, एक मल्टीफोटन माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ए) के साथ संवेदनाहारी ट्रांसजेनिक चूहों की कॉर्नियल नसें। पहली छवि उस स्थान पर प्राप्त की जाती है जहां जला दिया जाएगा। इस अध्ययन में एक ट्रांसजेनिक माउस का उपयोग किया गया जिसका संक्रमण फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करता है। छवि कॉर्निया के केंद्र में अधिग्रहित की गई थी, जहां भंवर स्थित है (चित्र 3B), उपकला के शीर्ष से मध्य-स्ट्रोमा तक। भंवर अब दिखाई नहीं दे रहा है 1 पहली छवि अधिग्रहण के बाद सप्ताह. इसके बजाय, प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक समूह रोशनी स्थल पर चला गया है, जहां हम स्ट्रोमा में फाइबर के बंडल की पहचान कर सकते हैं, जो पहले अधिग्रहण(चित्रा 3बी)के बाद पतले हो गए हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ओकुलर गड़गड़ाहट और घर्षण के बाद कॉर्नियल संक्रमण का उदाहरण। (ए) घर्षण बनाने के लिए 0.5 मिमी की जंग की अंगूठी हटानेवाला के साथ एक नेत्र संबंधी गड़गड़ाहट का उपयोग किया गया था। (बी) विच्छेदित और immunostained कॉर्निया के उदाहरण. पूर्व-घर्षण छवियां केंद्र में चिकनी बेसल उपकला और भंवर (सफेद तीर) को दर्शाती हैं। पोस्ट-घर्षण छवियां सबबेसल प्लेक्सस का एक स्पष्ट परिसीमन दिखाती हैं, जिसे हटा दिया गया था (लाल तीरहेड्स)। 1 सप्ताह के बाद घर्षण (1WPAbr) में प्राप्त छवियां दिखाती हैं कि फाइबर कहां पुन: उत्पन्न हो रहे हैं (नारंगी तीर)। संक्रमण एंटी-बीआईआईआई ट्यूबलिन एंटीबॉडी (हरा) के साथ दाग दिया गया है। नाभिक एक डीएनए इंटरकलेटर (बैंगनी) के साथ दाग रहे हैं। छवियों को एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया गया था। स्केल सलाखों = 500 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बायोप्सी पंच और एक्सोटॉमी के बाद कॉर्नियल संक्रमण का उदाहरण। (ए) 2.5 मिमी व्यास का एक बाँझ बायोप्सी पंच एक अक्षतंतु प्रेरित करने के लिए आंख पर लागू होता है। (बी) विच्छेदित और immunostained कॉर्निया के उदाहरण. पूर्व-एक्सोटॉमी छवियां कॉर्निया (सफेद तीर) के केंद्र में भंवर की उपस्थिति को दर्शाती हैं। पोस्ट-एक्सोटॉमी छवियां उपकला में पंच द्वारा बनाई गई अंगूठी (लाल तीर) दिखाती हैं। 2 सप्ताह के बाद एक्सोटॉमी (2WPAx) में प्राप्त छवियां अल्सर (नारंगी तीर) के गठन को दर्शाती हैं। संरक्षण BIII ट्यूबुलिन (हरा) के साथ दाग दिया गया है। नाभिक एक इंटरकलेटर (बैंगनी) के साथ दाग रहे हैं। छवियों को एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया गया था। स्केल सलाखों = 500 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लेज़रों द्वारा कॉर्नियल तंत्रिका cauterization के लिए सेट करें और एक उदाहरण (ए) एनेस्थेटाइज्ड मैजिक-मार्कर ट्रांसजेनिक माउस21 को सिर-धारक द्वारा बनाए रखा जाता है, और इसकी आंख बिफोटॉन के 20x उद्देश्य का सामना कर रही है। माउस के शरीर अधिग्रहण के दौरान साँस लेने आंदोलन से बचने के लिए बंधा हुआ है. (बी) भंवर के एक ही स्थान पर फोटोडैमेज और 1 सप्ताह के बाद फोटोडैमेज (1WPPhDa) से पहले एक साथ तरंग दैर्ध्य 850 एनएम और 1100 एनएम का उपयोग करके भंवर के पहले अधिग्रहण का त्रि-आयामी (3 डी) दृश्य। लेज़रों ने प्रतिरक्षा कोशिकाओं (एरोहेड) के प्रवास को प्रेरित किया जहां भंवर स्थित होता है। स्केल सलाखों = 80 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तकनीक प्रभावित संरचना प्रभाव की डिग्री (+/-) अध्ययन का प्रकार हीलिंग अवधि
अपघर्षण उपकला ++ उपकला और संरक्षण पुनर्जनन उपकला <1 सप्ताह संरक्षण >2 महीने
संरक्षण ++
एक्सोटॉमी उपकला +/- संरक्षण पुनर्जनन न्यूरोट्रॉफिक केराटाइटिस संरक्षण >2 महीने एनके >2 सप्ताह
स्ट्रोमा +/-
संरक्षण ++
तंत्रिका cauterization उपकला + (स्थानीय) स्थानीय संरक्षण पुनर्जनन न्यूरोट्रॉफिक केराटाइटिस cauterization की आवृत्ति के आधार पर
स्ट्रोमा
संरक्षण

तालिका 1: तीन प्रस्तावित रणनीतियों की तुलना।

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Discussion

न्यूरोट्रॉफिक केराटाइटिस को एक दुर्लभ बीमारी माना जाता है, जो 10,000 व्यक्तियों में से 5 को प्रभावित करता है। हालांकि, रासायनिक जलने जैसे शारीरिक चोट के कारण एनके से पीड़ित लोग, या मधुमेह या मल्टीपल स्केलेरोसिस जैसे सिंड्रोम उन आंकड़ों में शामिल नहीं हैं3. इसके अलावा, यह स्थिति22 में काफी कम है, और बीमारी की व्यापकता को कम करके आंका गया है। नए उपचार और चिकित्सा की एक मजबूत आवश्यकता है जो रोगियों की दृष्टि को संरक्षित करने के साधन के रूप में अक्षतंतु पुनर्जनन को बढ़ावा देगा। वर्तमान में, एनके के शुरुआती चरणों से पीड़ित रोगियों को दिया जाने वाला एकमात्र उपलब्ध उपचार औषधीय आईड्रॉप्स23,24,25 का अनुप्रयोग है जो कॉर्नियल तंत्रिका पुनर्जनन का समर्थन करता है। हालाँकि, ये केवल एक निश्चित बिंदु तक प्रभावी हैं। कॉर्निया के अधिक गंभीर परिवर्तन के मामलों में, जैसे अल्सर, एमनियोटिक झिल्ली प्रत्यारोपण या केराटोप्लास्टी 3,4 घाव को बंद करने और संक्रमण से बचने के लिए एक अस्थायी समाधान प्रदान करते हैं। हालांकि, उन ग्राफ्ट को सीमित समय के बाद प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, प्रत्येक अतिरिक्त प्रक्रिया में अस्वीकृति का जोखिम बढ़ रहा है।

यह रिपोर्ट आमतौर पर क्लिनिक (तालिका 1) में सामना किए गए एनके के विभिन्न रूपों को पुन: प्रस्तुत करती है। इनका उपयोग कॉर्नियल संक्रमण के बारे में हमारे ज्ञान को गहरा करने और वर्तमान उपचारों के विकल्पों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। घर्षण मॉडल पीआरके सर्जरी से जुड़ा हो सकता है, यह देखते हुए कि यह संक्रमण की धीमी गति से पुनरावृत्ति को पुन: प्राप्त करता है, जो कि एब्रेडेड एपिथेलियम के उपचार के बाद होता है। इसके लाभ के लिए, इस तकनीक को अपेक्षाकृत आसानी से सिखाया और पुन: पेश किया जा सकता है जब नेत्र गड़गड़ाहट के साथ सही दबाव लागू किया जाता है, और एक नियमित रूप से घिसा हुआ क्षेत्र बनाया जाता है। इसके अलावा, इस तकनीक को प्रत्येक रोगी की विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या एब्रेडेड क्षेत्र के आकार को चुनकर उपयोगकर्ता के हित के अनुरूप बनाया जा सकता है।

एक्सोटॉमी लैमेलर केराटोप्लास्टी के समान है जो देर से चरण एनके26 से पीड़ित रोगियों द्वारा किया जाता है। यह तंतुओं के अध: पतन (वालेरियन अध: पतन) और केंद्रीय कॉर्निया में अक्षतंतु के पुन: उपनिवेशीकरण की जांच को सक्षम बनाता है। जबकि सर्जरी करने के लिए आवश्यक सामग्री अपेक्षाकृत सरल है, चिकित्सक को उचित तकनीक में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए, विशेष रूप से दबाव का सही अनुप्रयोग और बायोप्सी पंच के साथ सही संख्या में घुमाव। एक keratoplasty के संदर्भ में, चीरा की गहराई ठीक एक ट्रेफिन डिवाइस और intraoperative ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी के उपयोग के माध्यम से निर्धारित किया जाता है, जो तकनीक murine मॉडल17 के लिए अनुकूल नहीं हैं. केराटोप्लास्टी के लिए एक और असमानता यहां वर्णित तकनीक में दाता प्रत्यारोपण की अनुपस्थिति है, क्योंकि हमने केवल कॉर्निया का चीरा लगाया था। यह मॉडल एक स्वस्थ उपकला की उपस्थिति के कारण रुचि का है जिसमें संक्रमण वापस बढ़ना चाहिए। यह इसे घर्षण मॉडल से अलग करता है, जहां उपकला को संक्रमण के साथ हटा दिया जाता है।

तंत्रिका cauterization तकनीक, एक multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, धूप की कालिमा के कारण होने वाली क्षति की नकल करता है, लेकिन कॉर्निया के एक स्थानीय क्षेत्र पर ऐसा करता है, इस प्रकार डीएनए क्षति और आरओएस गठन19,20 ट्रिगर. इस पद्धति के साथ, कॉर्निया पर विभिन्न स्थानों से तंतुओं के पुनर्जनन का अध्ययन करना संभव है और यहां तक कि एक ही क्षेत्र में कई बार सावधानी दोहराने के लिए, अक्षतंतु विकास और प्रतिरक्षा कोशिका प्रवास पर प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है।

ये तीन प्रोटोकॉल पुनर्योजी तंत्र की जांच करके अक्षीय रेग्रोथ के मूलभूत पहलुओं का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करते हैं, साथ ही कॉर्निया और संक्रमण में मौजूद विभिन्न सेल प्रकारों के बीच बातचीत भी करते हैं। ये विधियां नए औषधीय अणुओं24 या जीन थेरेपी27 को लागू करके अक्षतंतु पुनर्जनन को बढ़ावा देने का एक साधन भी प्रदान करती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक ट्रांसजेनिक माउस लाइन मैजिक-मार्कर्स तक पहुंच के लिए डॉ. काराइन लौलियर को धन्यवाद देते हैं। लेखक रैम-न्यूरो पशु कोर सुविधा और इमेजिंग सुविधा एमआरआई का भी धन्यवाद करते हैं, जो फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-10-INBS-04, "भविष्य के लिए निवेश") द्वारा समर्थित फ्रांस-बायोइमेजिंग राष्ट्रीय बुनियादी ढांचे का सदस्य है। इस शोध को ATIP-Avenir कार्यक्रम, Inserm, Région Occitanie, मोंटपेलियर विश्वविद्यालय, फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM पुनर्योजी चिकित्सा, REP202110014140), और Groupama फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm seringe filter CLEARLINE 51733
0.5 mm rust ring remover Alger Equipment Company BU-5S
2 mL plastic tubes Eppendrof  30120094
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody Abcam ab18207
Antigenfix Diapath P0016
Artificial tear Larmes artificielles Martinet N/A
Buprecare Animalcare N/A
Cotton swab Any provider N/A
Dissecting tools Fine Science Tools N/A
Fluorescein Merck 103887
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7765
Goat serum Merck S26
Head Holder Narishige SGM 4
Heated plate BIOSEB LAB instruments BIO-HE002
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Imalgene 1000 BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France N/A French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software Leica N/A Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II Coherent N/A
Laser power meter Coherent N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope Leica N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope Zeiss N/A
Ocry-gel TVM lab N/A
Parametric oscillator Coherent N/A
Penlights with blue cobalt filtercap Bernell ALPEN
Petri dish Thermo Scientific 150318 Axotomy protocol
Petridish Thermo Scientific 150288 Cornea whole-mount processing
Rompun 2% Elanco N/A French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm LCH medical LCH-PUK-25
Triton X-100 VWR 0694
Vectashield EuroBioSciences H-1000 Mounting medium

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References

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Murine Cornea में neurotrophic keratitis और तंत्रिका उत्थान प्रेरित करने के लिए तीन रणनीतियाँ
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Meneux, L., Caballero, A.,… More

Meneux, L., Caballero, A., Boukhaddaoui, H., Michon, F. Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea. J. Vis. Exp. (202), e66182, doi:10.3791/66182 (2023).

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