Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/66182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Institute for Neurosciences of Montpellier, University of Montpellier, INSERM, 2Department of Ophthalmology, Gui de Chauliac Hospital

Summary

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

Abstract

הקרנית היא רקמה שקופה המכסה את העין והיא חיונית לראייה ברורה. זוהי הרקמה העצבנית ביותר בגוף. עצבוב זה מספק תחושה ותפקוד טרופי לעין ותורם לשמירה על שלמות הקרנית. השיבוש הפתולוגי של עצבוב זה נקרא קרטיטיס נוירוטרופית. זה יכול להיות מופעלות על ידי פגיעה בעין, ניתוח, או מחלה. במחקר זה, אנו מציעים שלושה פרוטוקולים שונים לגרימת נזק לעצבוב בדרכים המשחזרות את שלושת סוגי המקרים בהם נתקלים בדרך כלל במרפאה.

השיטה הראשונה מורכבת בביצוע שחיקה של אפיתל עם בור אופתלמי. מדובר בהסרת שכבת האפיתל, קצות העצבים החופשיים והמקלעת התת-בזאלית באופן דומה לניתוח כריתת קרניים פוטו-רפרקטיבי המבוצע במרפאה. השיטה השנייה מכוונת לעצבוב רק על ידי חתיכתו בפריפריה עם ניקוב ביופסיה, תוך שמירה על שלמות האפיתל. שיטה זו דומה לשלבים הראשונים של קרטופלסטיקה למלרית ומובילה לניוון של העצבוב ואחריו צמיחה מחודשת של האקסונים בקרנית המרכזית. השיטה האחרונה פוגעת בעצבוב של מודל עכבר מהונדס באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון, אשר ממקם באופן ספציפי את אתר הצריבה של סיבי העצב הפלואורסצנטיים. שיטה זו גורמת לאותו נזק כמו פוטוקרטיטיס, חשיפת יתר לאור UV.

מחקר זה מתאר אפשרויות שונות לחקר הפיזיופתולוגיה של עצבוב הקרנית, במיוחד הניוון וההתחדשות של האקסונים. קידום התחדשות הוא חיוני למניעת סיבוכים כגון פגמים אפיתל או אפילו ניקוב של הקרנית. המודלים המוצעים יכולים לסייע בבדיקת מולקולות פרמקולוגיות חדשות או ריפוי גנטי המשפרים את התחדשות העצבים ומגבילים את התקדמות המחלה.

Introduction

הקרנית, שהיא פני השטח השקופים של העין, מורכבת משלוש שכבות נפרדות: האפיתל, הסטרומה והאנדותל. לאיבר זה יש את צפיפות העצבוב הגבוהה ביותר בגוף והוא מורכב בעיקר מסיבי חישה (סוגים Aδ ו- C) שמקורם בענף העיניים של הגנגליון הטריגמינלי. סיבי החישה חודרים לשולי הקרנית באמצע הסטרומה בצורה של צרורות גדולים המסתעפים החוצה כדי לכסות את פני השטח. לאחר מכן הם מתפצלים כדי לחדור את קרום באומן וליצור את המקלעת התת-בסיסית, אשר ניתנת לזיהוי בקלות על ידי היווצרות מערבולת במרכז הקרנית. סיבים אלה מסתיימים כקצות עצבים חופשיים על פני השטח החיצוניים של האפיתל. הם מסוגלים להמיר גירויים תרמיים, מכניים וכימיים ולשחרר גורמים טרופיים החיוניים להומאוסטזיסאפיתל 1,2. Neurotrophic keratitis (NK) היא מחלה ניוונית המשפיעה על עצבוב חושי הקרנית. מחלה נדירה זו נובעת מירידה או אובדן רגישות בקרנית הגורמת לייצור דמעות נמוך יותר ולתכונות ריפוי לקויות של הקרנית3. NK מתקדם דרך שלושה שלבים המתוארים היטב, משלב 1 שבו חולים סובלים ממומים אפיתליאליים, לשלב 3 שבו סטרומה נמסה ו / או ניקוב הקרנית להתרחש4.

מבחינה קלינית, מקורותיה של מחלה זו יכולים להיות מגוונים. חולים יכולים לאבד עצבוב הקרנית לאחר פגיעה פיזית בעין, ניתוח, או באמצעות מחלות כרוניות, כגון סוכרת 5,6. עד כה, תהליך הפתוגנזה של NK נותר מובן היטב, והאפשרויות הטיפוליות למצב מסכן ראייה זה מוגבלות מאוד. לכן, יש צורך בהבנה טובה יותר של המאפיינים של פגמים אפיתליאליים כדי להבין טוב יותר את המנגנונים העומדים מאחורי התחדשות סיבים אלה ולקדם אותם. כאן, אנו מציעים מספר מודלים של פגיעה בקרנית הגורמת NK בעכברים.

המודל הראשון הוא שחיקה של שכבת האפיתל של הקרנית עם בור העין. מודל זה נחקר בעיקר בהקשר של התחדשות האפיתל בבעלי חיים שונים, כגון מכרסמים ודגים 7,8,9, וכדי לבדוק מולקולות המקדמות ריפוי קרנית10,11. מבחינה פיזיולוגית, לוקח 2-3 ימים לתאי האפיתל לסגור את הפצע. הדפוס הפיזיולוגי של העצבוב, לעומת זאת, לוקח יותר מארבעה שבועות להתאושש מהשחיקה12,13. במהלך הניתוח, בור העין מסיר את שכבת האפיתל של הקרנית המכילה את המקלעת התת-בזאלית ואת קצות העצבים החופשיים של הסיבים. הליך זה ניתן להשוות קלינית לחולים עם keratectomy photorefractive (PRK) כדי לתקן פגמים שבירה בעין. ההליך מורכב מהסרת האפיתל של הקרנית ולאחר מכן עיצוב מחדש של הסטרומה עם לייזר14. חולים יכולים לחוות מספר תופעות לוואי לאחר ניתוח כזה, כגון ירידה בצפיפות עצב הקרנית למשך שנתיים וירידה ברגישות למשך 3 חודשים עד שנה לאחר הניתוח15. בהתחשב בכך שהניתוח גורם לשבריריות של מיקרו-סביבה בקרנית, מודל זה יכול לסייע לחקור תופעות לוואי אלה ולפתח גישות טיפוליות שיקדמו עצבוב מחדש מהיר יותר, ובכך להפחית את תופעות הלוואי המדוברות.

המודל השני מורכב מחיתוך האקסונים בשולי הקרנית באמצעות ניקוב ביופסיה, הגורם לניוון וולרי של העצבוב המרכזי 16. מבחינה קלינית, ניתן להשוות שיטה זו לקרטופלסטיקה למלרית קדמית, שבה המנתח מבין טרפינציה חלקית של הקרנית כדי להסיר חלק מהעובי הקדמי של הקרנית ולהחליפו בהשתלת תורם 17. לאחר קרטופלסטיקה למלרית, חולים עלולים לסבול ממספר תסמינים, כולל עין יבשה, אובדן עצבוב הקרנית ודחיית השתל18. מודל אקסוטומיה זה המבוצע על עצבי הקרנית יכול לספק תובנה לגבי מנגנוני ניוון הסיבים, המתרחש לאחר השתלה, ואחריה התחדשות האקסונים.

השיטה השלישית פוגעת בעצבי הקרנית באמצעות לייזר. על ידי שימוש במיקרוסקופ מולטיפוטון על הקרנית של בעלי חיים מורדמים, ניוון העצבים הממוקמים בשדה האופטי מושרה כתוצאה מהיווצרות מיני חמצן תגובתי (ROS), מה שמוביל לנזק לדנ"א ולקוויטציה תאית19. שיטה זו משחזרת את נזקי האור של הקרנית הנגרמים על ידי חשיפת יתר לקרינת UV טבעית (כוויות שמש), אשר גם מפעילה היווצרות ROS, מה שמוביל לנזק לדנ"א20. חולים הסובלים מכוויות שמש בקרנית חווים כאב רב, שכן הידרדרות תאי האפיתל שוללת את הגפיים של סיבי הקרנית מכל.

שלוש השיטות המתוארות כאן נועדו לאפשר חקירה של תהליך הפתוגנזה NK והתחדשות אקסונים. הם ניתנים לשחזור ומדויקים בקלות. יתר על כן, הם מאפשרים התאוששות מהירה וניטור קל של בעלי החיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים.

1. הכנות

  1. הכינו תמיסת הרדמה של קטמין-קסילזין להרדמה. הזריקו קטמין ב-80 מ"ג/ק"ג וקסילזין ב-10 מ"ג/ק"ג על ידי דילול 200 מיקרוליטר קטמין (100 מ"ג/מ"ל) ו-125 מיקרוליטר קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) ב-2,175 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.
  2. הכינו תמיסת בופרנורפין 0.02 מ"ג/מ"ל כתמיסה משככת כאבים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין ל-1,400 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.
  3. הכינו את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית.
    1. השתמש במשקל עדין כדי לשקול 10 מ"ג של מלח פלואורסצאין ולדלל אותו ב -10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי לקבל תמיסת פלואורסצאין 0.1%.
    2. הגן על התמיסה מפני האור ונער אותה במשך 5 דקות. השתמש מזרק 10 מ"ל מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר כדי לסנן את הפתרון.
      הערה: התמיסה הפלואורסצנטית צריכה להיות מוגנת מפני האור וניתן לאחסן אותה ב +4 ° C למשך 5 ימים.
  4. הכנת העכבר
    1. משקל העכבר והשראת הרדמה על ידי ביצוע הזרקה תוך צפקית של 10 μL/g של משקל עכבר (MW) של תמיסת ההרדמה. כאשר העכבר מפסיק לנוע, הניחו אותו על צלחת מחוממת (37°C) וודאו שהוא מורדם לחלוטין על ידי צביטת אצבעות רגליו.
    2. יש למרוח טיפת דמעה מלאכותית על העין העוברת את הניתוח וטיפת ג'ל עיני על העין הנגדית.
    3. ברגע שהעכבר אינו מגיב לצביטה, הזריקו את משככי הכאבים (0.02 מ"ג / מ"ל בופרנורפין) ב 5 מיקרוליטר / גרם של MW כדי לספק 0.1 מ"ג / ק"ג buprenorphine תת עורית בצוואר.

2. שחיקה של הקרנית

  1. בצע את שלב 1.3 כדי להכין את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית.
  2. בצע את שלב 1.4 כדי להכין את העכבר.
  3. לפני ביצוע השחיקה, טבלו את בור העין ב-70% EtOH ולאחר מכן ב-PBS כדי לנקות אותו.
  4. הניחו את העכבר על צלחת מחוממת (37°C) בצד כדי לגשת בקלות לעין העוברת את הניתוח.
    1. השתמשו בצמר גפן כדי לספוג את הדמעה המלאכותית ולהבריש את הריסים מבלי לגעת בעין.
    2. הפעל את בור העין, פתח את עפעף העכבר בשתי אצבעות, ובו זמנית לחסום את הוויבריסה כדי למנוע מהם להיתקע לתוך הבור.
  5. למקם את האישון או את מרכז העין ולהחיל את בור העין על פני העין, ולעשות תנועות מעגליות. על ידי התבוננות מקרוב, פני השטח של אפיתל שהוסר ניתן לראות. אחרת, לעשות בערך 20 תנועות מעגליות על הקרנית.
  6. החזירו את העכבר לבטנו ובדקו אם ג'ל העין עדיין קיים בעין הנגדית.
  7. יש למרוח טיפה של תמיסת כתמים פלואורסצנטית על העין הנטועה ולהמתין 20 שניות. יש לספוג את הטיפה עם טישו מבלי לגעת בעין ולשטוף אותה בטיפת דמעה מלאכותית. לספוג את טיפת הדמעה המלאכותית עם רקמה ולהאיר את העין עם מנורת קובלט כחולה.
    הערה: השחיקה חייבת להיות בעלת צורה מעגלית. זה דורש קצת הכשרה כדי להשיג את זה.
  8. החל טיפה של ג'ל העין abraded ולתת העכבר להתעורר על כרית מחוממת. כאשר העכבר נע בכוחות עצמו, החזירו אותו לכלוב שלו.
  9. בדוק את רווחתו של בעל החיים במהלך היומיים הבאים.
  10. לאחר השימוש בבור העין, השתמש ברקמה רכה כדי להסיר תאי אפיתל תקועים בראש הבור וטבול אותו ב 70% EtOH ולאחר מכן PBS.
    הערה: לאחר הסרת תאי האפיתל עם הרקמה הרכה, ודא כי לא נתקעו פיסות רקמה בראש הבור.

3. אקסוטומיה של עצבי הקרנית

  1. בצע את שלב 1.4 כדי להכין את העכבר.
  2. הניחו את העכבר מתחת לזכוכית מגדלת דו-עינית בצד כדי לגשת לעין העוברת את הניתוח. שים את החלק התחתון של צלחת פטרי מתחת לראש העכבר כדי שהעין תהיה אופקית.
    הערה: השלבים הבאים יבוצעו על ידי התבוננות דרך זכוכית מגדלת דו-עינית.
  3. הסירו את הדמעה המלאכותית בעזרת צמר גפן והסירו את הריסים מבלי לגעת בעין.
  4. מניחים צבת חלקה ומעוקלת מתחת לעין החיה כדי להוציא אותה מהמסלול. הקפד לסגור את הצבת מספיק כדי שהעין לא תוכל לחזור למסלול ברגע שיופעל לחץ, אך לא יתר על המידה כדי למנוע נזק לעצב הראייה.
  5. החל את ניקוב הביופסיה של 2.5 מ"מ אנכית על העין ללא לחץ כדי להבטיח מגע מוחלט של האגרוף עם פני השטח של הקרנית.
    הערה: ברגע שהאגרוף מופעל על הקרנית, ידו של הנסיין עלולה להפריע לשדה הראייה.
  6. לאחר מכן, התחל להפעיל לחץ ולסובב את האגרוף מספר פעמים.
    הערה: בהתאם ללחץ, מספר הפיתולים עשוי להשתנות, אך בדרך כלל הוא סביב 5. זה דורש אימון כדי להרגיש את הלחץ והתנועה הנכונים. אם מופעל לחץ רב מדי, העין נקרעת. במקרה זה, ניתן לראות נוזלים יוצאים מהנגע והעין מתרככת. צריך להקריב את החיה.
  7. הסר את אגרוף הביופסיה. עיגול חייב להיות גלוי על הקרנית שבה הוחל אגרוף הביופסיה.
    הערה: השלבים הבאים אינם דורשים זכוכית מגדלת דו-עינית.
  8. בדוק אם לעין הנגדית עדיין יש ג'ל עיני ולמרוח קצת על העין האקסונמית.
  9. תן לעכבר להתעורר על כרית מחוממת (37 מעלות צלזיוס) והחזיר אותו לכלוב שלו כשהוא נע בכוחות עצמו.
  10. בדוק את רווחתו של בעל החיים במהלך היומיים הבאים.

4. עיבוד הקרנית בהרכבה מלאה

  1. איסוף דוגמאות וקיבוע.
    1. לשקול את העכבר ולגרום להרדמה על ידי ביצוע הזרקה intraperitoneal של 10 μL / g של משקל העכבר (MW) של פתרון ההרדמה.
    2. כאשר העכבר מפסיק לזוז ואין לו רפלקסים על ידי צביטת בוהן, בצע נקע צוואר הרחם.
    3. להוציא את העין מהמסלול באמצעות שתי אצבעות ולחנך את העין על ידי חיתוך עצב הראייה באמצעות מספריים מעוקלים.
    4. הניחו את העין בצינור פלסטיק בנפח 2 מ"ל המכיל PBS.
    5. תקן את העין על ידי החלפת PBS עם 4% paraformaldehyde והניח אותו על שייקר (30 סל"ד) בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות.
    6. יש לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות עם PBS ב-RT על שייקר (30 סל"ד).
  2. דיסקציה של הקרנית
    1. מניחים טיפה של PBS על חתיכת פרפילם בתוך צלחת פטרי.
    2. הניחו את העין בטיפה זו של PBS.
    3. מניחים את צלחת הפטרי מתחת לזכוכית מגדלת דו-עינית.
    4. לנתח את הקרנית באמצעות מספריים microdissection ומלקחיים. חותכים מעל הגוף הרירי כדי לשמור על הלימבוס.
    5. הסר את העדשה, את הגוף הרירי, ואת הקשתית עם מלקחיים עדינים.
    6. מחזירים את הקרנית לצינור פלסטיק בנפח 2 מ"ל.
  3. פרוטוקול Immunofluorescence
    1. יש לדגור על הקרנית ב-2 מ"ל של 2.5% ג'לטין מעור דגים, 5% סרום עיזים ו-0.5% חומר ניקוי ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT על שייקר (30 סל"ד).
    2. יש לדגור על הקרנית ב-150 מיקרוליטר של תמיסה של 2.5% ג'לטין מעור דגים, 5% סרום עיזים ו-0.1% חומר ניקוי ב-PBS המכיל את הנוגדן הראשוני המדולל ב-1/1000 (נוגדן אנטי βIII טובולין) למשך הלילה ב-4°C על שייקר (30 סל"ד).
    3. יש לשטוף 3 פעמים במשך שעה אחת עם חומר ניקוי 0.1% ב-PBS ב-RT על שייקר (30 סל"ד).
    4. לדגור על הקרנית באותה תמיסה כמו בשלב 4.3.2, המכיל את הנוגדן המשני מדולל ב 1/500 לילה ב 4 ° C על שייקר (30 סל"ד).
    5. יש לשטוף 3 פעמים במשך שעה עם PBS ב-RT על שייקר (30 סל"ד).
    6. לדגור על הקרנית במשך 10 דקות עם 150 μL של אינטרקלטור DNA מדולל ב 1/5000 ב RT על שייקר (30 סל"ד).
    7. יש לשטוף פעמיים במשך 5 דקות עם PBS.
  4. הרכבה של הקרנית
    1. הניחו את הקרנית על מגלשה, אפיתל פונה למגלשה, והשתמשו באזמל כדי ליצור ארבעה חלקים מבלי להגיע למרכז.
      הערה: בצע את המקטעים המנוגדים זה לזה כדי ליצור צורת פרח.
    2. הניחו את אנדותל הקרנית מול המגלשה והוציאו את PBS סביב הקרנית באמצעות רקמה.
      הערה: אין להסיר את PBS מתחת לקרנית; אחרת, בועות אוויר עשויות להופיע. אם כן, הוסיפו PBS לקרנית והסירו את בועת האוויר. לאחר מכן הפעל מחדש משלב 4.3.2.
    3. הוסיפו משחת דגם על ארבע פינות של מכסה מלבני.
      הערה: משחת הדגם מרימה את הכיסוי מכיוון שהקרנית היא רקמה עבה.
    4. יש לזרוק 50 μL של מדיום הרכבה על הקרנית ולהניח בזהירות את הכיסוי מעל כדי למנוע היווצרות בועות.
    5. יש לאטום את הכיסוי בלק.
  5. דימות
    1. הניחו את המגלשה מתחת למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.
    2. הגדר את גודל הפסיפס ואת עומק התמונה והתחל את הרכישה.
    3. החל תוכנית טשטוש ו deconvolution על התמונה שנרכשה.
      הערה: שלב 4.6.3 הוא אפשרות שנבחרה בתוכנת הרכישה (סליקה חישובית בנפח גדול [LVCC])

5. אבלציה לייזר מקומית של עצבי הקרנית

  1. הפעל את מיקרוסקופ המולטיפוטון הזקוף ואת הלייזר בשילוב מתנד פרמטרי אופטי. הפעל את השלב המחומם של המיקרוסקופ (37 ° C) והגדר את הלייזרים על 850 ננומטר ו 1100 ננומטר, המתאים לאורכי הגל הנדרשים עבור מודל העכבר.
  2. השתמש במד כוח כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים בו זמנית בסביבות 20 mW.
  3. בצע את שלב 1.4 כדי להכין את העכבר ולהחיל ג'ל עיניים על שתי העיניים.
    הערה: בעל החיים המשמש לפרוטוקול זה חייב להיות מקו עכבר מהונדס (עכבר מהונדסMAGIC-Marker 21) המבטא פלואורופור אנדוגני בסיבי עצב הקרנית.
  4. התקן את בעל החיים במחזיק ראש. סובב את החיה ב -90 מעלות לעין המעניינת לפנות לתקרה.
  5. חגור את הוויבריסה של החיה כדי לנקות את אזור העיניים. חגור את גוף החיה כדי להפחית את תנועת הראש הנגרמת על ידי נשימה.
  6. הניחו כיסוי עגול על העין מעל ג'ל העין. תלוש הכיסוי צריך להיות אופקי. אל תהססו להזיז את ראש החיה כדי שהכיסוי ימוקם כראוי.
  7. הוסף טיפה של PBS מעל תלוש הכיסוי. הניחו את בעל החיים על במת המיקרוסקופ בזהירות וקבעו את צריח המטרה במרחק הנכון.
  8. השתמש במטרה מימית 20x ו epifluorescence כדי למקם את העין ואת העצבוב דרך העינית.
  9. הפעל את הלייזרים והגדר את העומק שיש להאיר.
  10. קבל תמונה של 1024 x 1024 (פיקסלים) במהירות רכישה של 70%-85% ממהירות הסריקה המרבית.
  11. לאחר רכישת התמונה, הסירו את בעל החיים מהמיקרוסקופ והסירו את הכיסוי ואת הרצועות. הסר את בעל החיים ממחזיק הראש, הוסף עוד ג'ל עיניים במידת הצורך, ותן לו להתעורר בכלוב על צלחת מחוממת.
    הערה: הרס של העצבוב ניתן לראות 1 שבוע לאחר ההדמיה. ניתן לחזור על פרוטוקול זה פעם בשבוע למשך מספר שבועות כדי להגדיל את הנזק שנגרם על ידי הלייזרים.
  12. כאשר החיה נעה בכוחות עצמה, להחזיר את הכלוב לאורווה ולבדוק את רווחתו במשך היומיים הבאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר זה מציע מספר פרוטוקולים לגרימת נזק לעצבוב הקרנית בעכברים. בעוד פרוטוקולים דומים שימשו לחקר הפיזיופתולוגיה של ריפוי האפיתל, בחרנו להתאים ולפתח שיטות חדשות לחקר התחדשות עצבוב הקרנית. כדי להתבונן בעצבוב, השתמשנו בשתי טכניקות. ראשית, השתמשנו בטכניקת אימונופלואורסנציה כדי להכתים את סיבי העצב באמצעות נוגדן פאן-עצבי (BIII tubulin) ואת הגרעינים באמצעות אינטרקלטור. שנית, ניצלנו זן עכבר מהונדס המבטא חלבונים פלואורסצנטיים בסיבי העצב. הקרניות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

השיטה הראשונה השתמשה בבור עיניים עם מסיר טבעת חלודה של 0.5 מ"מ כדי להסיר את שכבת האפיתל של הקרנית (איור 1A). מחקר זה מתמקד בנזק שנגרם לעצבוב הממוקם בתוך האפיתל כאמצעי להבנת המרכיבים התאיים והמולקולריים המעורבים בהתחדשותו. לפני הניתוח, אפיתל הבסיס היה שלם. סיבי העצב במקלעת התת-בסיסית יצרו תבנית טיפוסית שנקראת מערבולת (איור 1B). קצה הבור המשמש בטכניקה זו הסיר רק את השכבה הראשונה של הקרנית, אך שמר הן על הסטרומה, שבה נמצאים צרורות גדולים של סיבים, והן על האנדותל. החלק של האפיתל שהוסר על-ידי הבור נראה בקלות, מאחר שהיה קרע ברור של האפיתל הבסיסי והמקלעת התת-בסיסית (איור 1B). ניתן לזהות בקלות את גרעיני הקרטוציטים מכיוון שהם מסודרים בדלילות ברחבי הסטרומה. לגבי העצבוב, גם הגבול היה ברור, עם קרע של המקלעת התת-בסיסית שאפשר לראות את צרורות הסיבים הגדולים בתוך הסטרומה. אמנם לוקח בערך 3 ימים עבור אפיתל להחלים, התחדשות של עצבוב לוקח יותר מ 4 שבועות לאחר שחיקה. איור 1 מדגים את התחדשות האפיתל שבוע לאחר הניתוח, כאשר האפיתל הבסיסי חלק. עם זאת, המערבולת נעדרת ממרכז הקרנית, בהתחשב בכך שהעצבוב עדיין לא חזר לנקודה זו.

השיטה השנייה כוללת חתך העצבים בשולי הקרנית באמצעות ניקוב ביופסיה בקוטר 2.5 מ"מ במקום להבריש אותם עם הבור (איור 2A). שיטה זו אינה משבשת את האפיתל כמו השחיקה. לאחר הניתוח ניתן להבחין בטבעת היקפית דקה בנקודה שבה הוחל ניקוב הביופסיה, מה שפגע באפיתל הבסיסי (איור 2B). עם זאת, העצבים בפריפריה נחתכו, מה שגרם לניוון וולרי של האקסונים. סוג זה של ניוון מורכב ריקבון של עצבים מן הקצה הסופי של הנוירונים לכיוון גוף התא, ובמקרה זה, כלפי החלק המושרה על ידי אגרוף ביופסיה. בהתאם לעומק האקסוטומיה, הנזק יכול להיות חמור. כאן אנו רואים שהתרחשה התנוונות כבדה, שהובילה לאובדן מוחלט של עצבוב במרכז הקרנית באפיתל (איור 2B). מאחר שהעצבוב חיוני לתחזוקת הומאוסטזיס אפיתל, מתחילה התפוררות של שכבת האפיתל ויוצרת כיב (איור 2B). היווצרות כיב התרחשה רק בקרניות פגועות מאוד.

הטכניקה האחרונה כוללת צריבה מקומית in vivo של עצבי הקרנית של עכברים טרנסגניים מורדמים באמצעות מיקרוסקופ רב-פוטוני (איור 3A). התמונה הראשונה נרכשת במיקום שבו תתבצע הצריבה. במחקר זה נעשה שימוש בעכבר מהונדס שהעצבוב שלו מבטא חלבונים פלואורסצנטיים. התמונה נרכשה במרכז הקרנית, היכן שהמערבולת ממוקמת (איור 3B), מראש האפיתל ועד אמצע הסטרומה. המערבולת אינה נראית עוד שבוע לאחר רכישת התמונה הראשונה. במקום זאת, קבוצה של תאי מערכת החיסון נדדה לאתר התאורה, שם אנו יכולים לזהות את צרור הסיבים בסטרומה, שהתדלדל לאחר הרכישה הראשונה (איור 3B).

Figure 1
איור 1: בור עיני ודוגמה לעצבוב הקרנית לאחר שחיקה. (A) בור אופתלמולוגי עם מסיר טבעת חלודה של 0.5 מ"מ שימש לביצוע השחיקה. (B) דוגמאות לקרניות מנותחות ומוכתמות חיסון. תמונות טרום שחיקה ממחישות את אפיתל הבסיס החלק ואת המערבולת (ראש חץ לבן) במרכז. תמונות לאחר שחיקה מראות תיחום ברור של המקלעת התת-בסיסית, שהוסרה (ראשי חץ אדומים). תמונות שנרכשו שבוע לאחר השחיקה (1WPAbr) מראות היכן הסיבים מתחדשים (ראש חץ כתום). העצבוב מוכתם בנוגדן אנטי-BIII טובולין (ירוק). הגרעינים מוכתמים באינטרקלטור DNA (סגול). התמונות נרכשו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניקוב ביופסיה ודוגמה לעצבוב הקרנית בעקבות אקסוטומיה. (A) ניקוב ביופסיה סטרילי בקוטר 2.5 מ"מ מוחל על העין כדי לגרום לאקסוטומיה. (B) דוגמאות לקרניות מנותחות ומוכתמות חיסון. תמונות קדם-אקסוטומיות ממחישות את נוכחות המערבולת במרכז הקרנית (ראש חץ לבן). תמונות פוסט-אקסוטומיות מראות את הטבעת (ראשי חץ אדומים) שנוצרה על ידי האגרוף באפיתל. תמונות שנרכשו לאחר שבועיים לאחר אקסוטומיה (2WPAx) ממחישות את היווצרות הכיב (ראש חץ כתום). העצבוב מוכתם בטובולין BIII (ירוק). הגרעינים מוכתמים באינטרקלטור (סגול). התמונות נרכשו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ערוך לצריבת עצב הקרנית באמצעות לייזרים ודוגמה (A) העכבר המהונדס MAGIC-Marker21 המורדם מתוחזק על-ידי מחזיק הראש, ועינו פונה למטרה פי 20 של הביפוטון. גוף העכבר קשור כדי למנוע תנועת נשימה במהלך הרכישה. (B) תצוגה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של הרכישה הראשונה של המערבולת באמצעות אורכי הגל 850 ננומטר ו-1100 ננומטר בו זמנית לפני הנזק לאור ושבוע לאחר הפוטונזק (1WPPhDa) באותו מיקום של המערבולת. הלייזרים גרמו לנדידה של תאי מערכת החיסון (ראש החץ) היכן שהמערבולת נמצאת. פסי קנה מידה = 80 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טכניקה מבנה מושפע מידת ההשפעה (+/-) סוג המחקר תקופת ההחלמה
שחיקה אפיתל ++ אפיתל והתחדשות עצבוב אפיתל <1 שבוע אינרבציה >2 חודשים
אינרבציה ++
אקסוטומיה אפיתל +/- התחדשות אינרבציה קרטיטיס נוירוטרופית אינרבציה >2 חודשים NK >2 שבועות
סטרומה +/-
אינרבציה ++
צריבה עצבית אפיתל + (מקומי) התחדשות עצבוב מקומית קרטיטיס נוירוטרופית בהתאם לתדירות הצריבה;
סטרומה
אינרבציה

טבלה 1: השוואה בין שלוש האסטרטגיות המוצעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קרטיטיס נוירוטרופית נחשבת למחלה נדירה, המשפיעה על 5 מתוך 10,000 אנשים. עם זאת, אנשים הסובלים NK עקב פגיעה פיזית כגון כוויות כימיות, או תסמונות כגון סוכרת או טרשת נפוצה אינם נכללים בסטטיסטיקה זו3. יתר על כן, מצב זה עדיין מאובחן באופן משמעותי22, ושכיחות המחלה מוערכת בחסר. יש צורך עז בטיפולים וטיפולים חדשים שיקדמו התחדשות אקסונים כאמצעי לשימור הראייה של המטופלים. נכון לעכשיו, הטיפול הזמין היחיד המוצע לחולים הסובלים מהשלבים המוקדמים של NK הוא יישום של טיפות עיניים פרמקולוגיות 23,24,25 התומכות בהתחדשות עצב הקרנית. אלה, עם זאת, יעילים רק עד נקודה מסוימת. במקרים של שינוי חמור יותר של הקרנית, כגון כיבים, השתלת קרום מי שפיר או keratoplasty 3,4 מציעים פתרון זמני כדי לסגור את הפצע ולמנוע זיהום. עם זאת, יש להחליף שתלים אלה לאחר זמן מוגבל, כאשר הסיכון לדחייה גדל בכל הליך נוסף.

דוח זה מציג מספר מודלים המשחזרים צורות שונות של NK הנפוצות במרפאה (טבלה 1). אלה יכולים לשמש כדי להעמיק את הידע שלנו על עצבוב הקרנית ולחקור חלופות לטיפולים הנוכחיים. מודל השחיקה יכול להיות קשור לניתוח PRK, בהתחשב בכך שהוא משחזר את הצמיחה מחדש האיטית של העצבוב, המתרחשת לאחר ריפוי האפיתל האבוד. לטובתה, טכניקה זו ניתן ללמד ולשכפל בקלות יחסית כאשר הלחץ הנכון עם בור העיניים מוחל, ונוצר אזור abraded רגיל. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לצרכים הספציפיים של כל מטופל או כדי להתאים לאינטרס של המשתמש על ידי בחירת גודל האזור abraded.

האקסוטומיה דומה לקרטופלסטיקה למלרית שעוברים חולים הסובלים מ- NK26 בשלב מאוחר. הוא מאפשר לחקור את ניוון הסיבים (ניוון וולריאני) ואת התיישבותם מחדש של האקסונים במרכז הקרנית. בעוד החומר הדרוש לביצוע הניתוח הוא פשוט יחסית, יש להכשיר את המטפל בטכניקה הנכונה, בעיקר הפעלה נכונה של לחץ ומספר סיבובים נכון עם ניקוב הביופסיה. בהקשר של קרטופלסטיקה, עומק החתך נקבע במדויק באמצעות שימוש במכשיר טרפין וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית תוך ניתוחית, אשר טכניקות אינן ניתנות להתאמה למודלים מורין17. הבדל נוסף בקרטופלסטיקה הוא היעדר השתלת תורם בטכניקה המתוארת כאן, שכן ביצענו רק את החתך של הקרנית. מודל זה מעניין בגלל נוכחותו של אפיתל בריא שבו העצבוב חייב לגדול בחזרה. זה מבדיל אותו מודל שחיקה, שבו אפיתל מוסר עם innervation.

טכניקת הצריבה העצבית, באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון, מחקה את הנזק שנגרם מכוויות שמש אך עושה זאת על אזור מקומי בקרנית, ובכך גורמת לנזק לדנ"א וליצירת ROS19,20. בשיטה זו ניתן לחקור את התחדשות הסיבים ממקומות שונים בקרנית ואף לחזור על הצריבה באותו אזור מספר פעמים, מה שמאפשר להעריך את ההשפעה על גדילת האקסון ונדידת תאי החיסון.

שלושת הפרוטוקולים הללו מציעים את האפשרות ללמוד את ההיבטים הבסיסיים של צמיחה מחודשת אקסונלית על ידי חקירת מנגנוני הרגנרציה, כמו גם את האינטראקציות בין סוגי התאים השונים הקיימים בקרנית ובעצבוב. שיטות אלה מציעות גם אמצעי לקידום התחדשות האקסון על ידי יישום מולקולות פרמקולוגיות חדשות24 או ריפוי גנטי27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר קארין לולייה על הגישה לקו העכבר המהונדס MAGIC-Markers. המחברים מודים גם למתקן הליבה של בעלי החיים RAM-Neuro ולמתקן ההדמיה MRI, חבר בתשתית הלאומית צרפת-BioImaging הנתמכת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-10-INBS-04, "השקעות לעתיד"). מחקר זה נתמך על ידי תוכנית ATIP-Avenir, Inserm, Région Occitanie, אוניברסיטת מונפלייה, סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140), וקרן Groupama.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm seringe filter CLEARLINE 51733
0.5 mm rust ring remover Alger Equipment Company BU-5S
2 mL plastic tubes Eppendrof  30120094
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody Abcam ab18207
Antigenfix Diapath P0016
Artificial tear Larmes artificielles Martinet N/A
Buprecare Animalcare N/A
Cotton swab Any provider N/A
Dissecting tools Fine Science Tools N/A
Fluorescein Merck 103887
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7765
Goat serum Merck S26
Head Holder Narishige SGM 4
Heated plate BIOSEB LAB instruments BIO-HE002
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Imalgene 1000 BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France N/A French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software Leica N/A Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II Coherent N/A
Laser power meter Coherent N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope Leica N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope Zeiss N/A
Ocry-gel TVM lab N/A
Parametric oscillator Coherent N/A
Penlights with blue cobalt filtercap Bernell ALPEN
Petri dish Thermo Scientific 150318 Axotomy protocol
Petridish Thermo Scientific 150288 Cornea whole-mount processing
Rompun 2% Elanco N/A French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm LCH medical LCH-PUK-25
Triton X-100 VWR 0694
Vectashield EuroBioSciences H-1000 Mounting medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).
  2. Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
  3. Dua, H. S., et al. Neurotrophic keratopathy. Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).
  4. Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. Neurotrophic keratitis. Eye. 17 (8), 989-995 (2003).
  5. Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
  6. Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
  7. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  8. Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
  9. Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
  10. Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
  11. Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
  12. Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
  13. He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
  14. Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
  15. Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
  16. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  17. Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M. Lamellar corneal transplantation. Surv Ophthalmol. 57 (6), 510-529 (2012).
  18. Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
  19. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  20. Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
  21. Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  22. Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
  23. Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
  24. Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
  25. Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
  26. Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S. Lamellar keratoplasty techniques. Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).
  27. Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 202 קרנית עצבוב קרטיטיס נוירוטרופית שחיקה בור עיניים ניוון אקסון פוטוקרטיטיס
שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meneux, L., Caballero, A.,… More

Meneux, L., Caballero, A., Boukhaddaoui, H., Michon, F. Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea. J. Vis. Exp. (202), e66182, doi:10.3791/66182 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter