Summary
Hier schlagen wir drei verschiedene Methoden vor, um die sensorischen Fasern, die die Hornhaut innervieren, zu schädigen. Diese Methoden erleichtern die Untersuchung der Axonregeneration bei Mäusen. Diese drei Methoden, die auf andere Tiermodelle adaptierbar sind, sind ideal für die Untersuchung der Physiologie und Regeneration der Hornhautinnervation.
Abstract
Die Hornhaut ist ein transparentes Gewebe, das das Auge bedeckt und für eine klare Sicht entscheidend ist. Es ist das am stärksten innervierte Gewebe im Körper. Diese Innervation sorgt für Empfindung und trophische Funktion des Auges und trägt zur Erhaltung der Hornhautintegrität bei. Die krankhafte Störung dieser Innervation wird als neurotrophe Keratitis bezeichnet. Dies kann durch eine Verletzung des Auges, eine Operation oder eine Krankheit ausgelöst werden. In dieser Studie schlagen wir drei verschiedene Protokolle vor, um die Innervation auf eine Weise zu schädigen, die die drei Arten von Fällen rekapituliert, die im Allgemeinen in der Klinik auftreten.
Die erste Methode besteht darin, das Epithel mit einem ophthalmologischen Bohrer abzureiben. Dabei werden die Epithelschicht, die freien Nervenenden und der subbasale Plexus ähnlich wie bei der in der Klinik durchgeführten photorefraktiven Keratektomie entfernt. Die zweite Methode zielt nur auf die Innervation ab, indem sie an der Peripherie mit einer Biopsienstanze durchtrennt wird, um die Integrität des Epithels zu erhalten. Diese Methode ähnelt den ersten Schritten der lamellären Keratoplastik und führt zu einer Degeneration der Innervation mit anschließendem Nachwachsen der Axone in der zentralen Hornhaut. Die letzte Methode schädigt die Innervation eines transgenen Mausmodells mit Hilfe eines Multiphotonenmikroskops, das spezifisch den Ort der Kauterisierung der fluoreszierenden Nervenfasern lokalisiert. Diese Methode verursacht den gleichen Schaden wie eine Photokeratitis, eine übermäßige Bestrahlung mit UV-Licht.
Diese Studie beschreibt verschiedene Möglichkeiten zur Untersuchung der Physiopathologie der Hornhautinnervation, insbesondere der Degeneration und Regeneration der Axone. Die Förderung der Regeneration ist entscheidend, um Komplikationen wie Epitheldefekte oder sogar Perforationen der Hornhaut zu vermeiden. Die vorgeschlagenen Modelle können dabei helfen, neue pharmakologische Moleküle oder Gentherapien zu testen, die die Nervenregeneration verbessern und das Fortschreiten der Krankheit begrenzen.
Introduction
Die Hornhaut, die transparente Oberfläche des Auges, besteht aus drei verschiedenen Schichten: dem Epithel, dem Stroma und dem Endothel. Dieses Organ hat die höchste Innervationsdichte im Körper und besteht hauptsächlich aus sensorischen Fasern (Typen Aδ und C), die aus dem ophthalmologischen Ast des Trigeminusganglions stammen. Sensorische Fasern dringen in Form von großen Bündeln in die Peripherie der Hornhaut im mittleren Stroma ein, die sich verzweigen, um die Oberfläche zu bedecken. Sie verzweigen sich dann, um die Bowmann-Membran zu durchstoßen und den subbasalen Plexus zu bilden, der leicht an der Bildung eines Wirbels in der Mitte der Hornhaut zu erkennen ist. Diese Fasern enden als freie Nervenenden an der äußeren Oberfläche des Epithels. Sie sind in der Lage, thermische, mechanische und chemische Reize zu transduzieren und trophische Faktoren freizusetzen, die für die Epithelhomöostase essentiell sind 1,2. Die neurotrophe Keratitis (NK) ist eine degenerative Erkrankung, die die sensorische Innervation der Hornhaut betrifft. Diese seltene Krankheit beruht auf einer Abnahme oder einem Verlust der Hornhautempfindlichkeit, die zu einer geringeren Tränenproduktion und schlechten Heilungseigenschaften der Hornhaut führt3. NK durchläuft drei gut beschriebene Stadien, von Stadium 1, in dem die Patienten Epitheldefekte erleiden, bis Stadium 3, in dem stromales Schmelzen und/oder Hornhautperforation auftreten4.
Klinisch können die Ursprünge dieser Erkrankung vielfältig sein. Patienten können die Hornhautinnervation nach körperlichen Verletzungen des Auges, Operationen oder durch chronische Erkrankungen wie Diabetes verlieren 5,6. Bis heute ist der Prozess der NK-Pathogenese nur unzureichend verstanden, und die therapeutischen Möglichkeiten für diese Sehkraft bedrohende Erkrankung sind sehr begrenzt. Daher ist ein besseres Verständnis der Eigenschaften von Epitheldefekten erforderlich, um die Mechanismen hinter der Regeneration dieser Fasern besser zu verstehen und sie möglicherweise zu fördern. Hier schlagen wir verschiedene Modelle von Hornhautverletzungen vor, die NK bei Mäusen induzieren.
Das erste Modell ist der Abrieb der Epithelschicht der Hornhaut mit einem Augenbohrer. Dieses Modell wurde hauptsächlich im Zusammenhang mit der Regeneration des Epithels bei verschiedenen Tieren, wie Nagetieren und Fischen untersucht 7,8,9 und um Moleküle zu testen, die die Hornhautheilung fördern10,11. Physiologisch dauert es 2-3 Tage, bis die Epithelzellen die Wunde verschlossen haben. Das physiologische Muster der Innervation benötigt jedoch mehr als vier Wochen, um sich von der Abrasion zu erholen 12,13. Während der Operation entfernt der Augenbohrer die Epithelschicht der Hornhaut, die den subbasalen Plexus und die freien Nervenenden der Fasern enthält. Dieses Verfahren kann klinisch mit Patienten mit photorefraktiver Keratektomie (PRK) zur Korrektur von Augenrefraktionsdefekten verglichen werden. Das Verfahren besteht darin, das Epithel der Hornhaut zu entfernen und dann das Stroma mit einem Laser14 umzuformen. Nach einer solchen Operation können verschiedene Nebenwirkungen auftreten, wie z. B. eine Abnahme der Hornhautnervendichte für 2 Jahre und eine Verringerung der Empfindlichkeit für einen Zeitraum von 3 Monaten bis zu einem Jahr nach der Operation15. Angesichts der Tatsache, dass die Operation eine Fragilität der Hornhautmikroumgebung induziert, könnte dieses Modell dazu beitragen, diese Nebenwirkungen zu untersuchen und therapeutische Ansätze zu entwickeln, die eine schnellere Reinnervation fördern und so die betreffenden Nebenwirkungen reduzieren.
Das zweite Modell besteht darin, die Axone an der Peripherie der Hornhaut mit einer Biopstanze zu durchtrennen, wodurch eine Wallersche Degeneration der zentralen Innervation induziert wird 16. Klinisch könnte diese Methode mit der vorderen lamellären Keratoplastik verglichen werden, bei der der Chirurg eine partielle Trepanation der Hornhaut durchführt, um einen Teil der vorderen Dicke der Hornhaut zu entfernen und durch ein Spendertransplantat zu ersetzen 17. Nach einer lamellären Keratoplastik können die Patienten unter einer Reihe von Symptomen leiden, darunter trockene Augen, Verlust der Hornhautinnervation und Transplantatabstoßung18. Dieses Axotomiemodell, das an Hornhautnerven durchgeführt wird, könnte einen Einblick in die Mechanismen der Faserdegeneration geben, die nach einer Transplantation und anschließender Regeneration der Axone auftritt.
Bei der dritten Methode werden die Hornhautnerven mit einem Laser geschädigt. Durch die Verwendung eines Multiphotonenmikroskops auf der Hornhaut von anästhesierten Tieren wird eine Degeneration der im optischen Feld lokalisierten Nerven als Folge der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) induziert, was zu DNA-Schäden und zellulärer Kavitation führt19. Diese Methode rekapituliert die Lichtschädigung der Hornhaut, die durch übermäßige Exposition gegenüber natürlichem UV-Licht (Sonnenbrand) verursacht wird, was auch die Bildung von ROS auslöst, was zu DNA-Schäden führt20. Patienten, die an einem Hornhautsonnenbrand leiden, leiden unter großen Schmerzen, da durch den Abbau der Epithelzellen die Extremitäten der Hornhautfasern vollständig entzogen werden.
Die drei hier beschriebenen Methoden sollen die Untersuchung des NK-Pathogeneseprozesses und der Axonregeneration ermöglichen. Sie sind leicht reproduzierbar und präzise. Darüber hinaus ermöglichen sie eine schnelle Genesung und eine einfache Überwachung der Tiere.
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Protocol
Alle Versuche wurden von der Nationalen Tierversuchsbehörde genehmigt.
1. Vorbereitungen
- Bereiten Sie eine Anästhesielösung aus Ketamin-Xylazin für die Anästhesie vor. Injizieren Sie Ketamin mit 80 mg/kg und Xylazin mit 10 mg/kg, indem Sie 200 μl Ketamin (100 mg/ml) und 125 μl Xylazin (20 mg/ml) in 2.175 ml sterilem 0,9%igem NaCl verdünnen.
- Bereiten Sie 0,02 mg/ml Buprenorphinlösung als analgetische Lösung vor, indem Sie 100 μl 0,3 mg/ml Buprenorphin zu 1.400 ml sterilem 0,9%igem NaCl hinzufügen.
- Bereiten Sie die fluoreszierende Färbelösung vor.
- Mit einer feinen Waage werden 10 mg Fluoresceinsalz abgewogen und in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, um eine 0,1%ige Fluoresceinlösung zu erhalten.
- Schützen Sie die Lösung vor Licht und schütteln Sie sie 5 Minuten lang. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen Spritzenfilter von 0,2 μm, um die Lösung zu filtrieren.
HINWEIS: Die fluoreszierende Lösung muss vor Licht geschützt werden und kann 5 Tage lang bei +4 °C gelagert werden.
- Vorbereitung der Maus
- Wiegen Sie die Maus und leiten Sie eine Anästhesie ein, indem Sie eine intraperitoneale Injektion von 10 μl/g Mausgewicht (MW) der Anästhesielösung durchführen. Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt, legen Sie sie auf eine beheizte Platte (37 °C) und überprüfen Sie, ob sie vollständig betäubt ist, indem Sie die Zehen zusammenkneifen.
- Tragen Sie einen Tropfen künstliche Träne auf das operierte Auge und einen Tropfen Augengel auf das kontralaterale Auge auf.
- Sobald die Maus nicht mehr auf das Kneifen reagiert, injizieren Sie die Analgesie (0,02 mg/ml Buprenorphin) mit 5 μl/g MW, um 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan in den Hals zu verabreichen.
2. Abrieb der Hornhaut
- Befolgen Sie Schritt 1.3, um die fluoreszierende Färbelösung herzustellen.
- Führen Sie Schritt 1.4 aus, um die Maus vorzubereiten.
- Bevor Sie den Abrieb durchführen, tauchen Sie den Augenbohrer in 70% EtOH und dann in PBS, um ihn zu reinigen.
- Legen Sie die Maus auf eine erhitzte Platte (37 °C) an der Seite, um das zu operierende Auge leicht zu erreichen.
- Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um die künstliche Träne aufzusaugen, und bürsten Sie die Wimpern weg, ohne das Auge zu berühren.
- Schalten Sie den Augenbohrer ein, öffnen Sie das Augenlid der Maus mit zwei Fingern und blockieren Sie gleichzeitig die Vibrissen, um zu verhindern, dass sie im Grat stecken bleiben.
- Lokalisieren Sie die Pupille oder die Mitte des Auges und legen Sie den Augenbohrer auf die Oberfläche des Auges und machen Sie kreisende Bewegungen. Bei genauem Hinsehen kann die Oberfläche des entfernten Epithels beobachtet werden. Ansonsten machen Sie ca. 20 kreisende Bewegungen auf der Hornhaut.
- Legen Sie die Maus wieder auf den Bauch und prüfen Sie, ob das Augengel noch im kontralateralen Auge vorhanden ist.
- Tragen Sie einen Tropfen Fluoreszenz-Färbelösung auf das abgeriebene Auge auf und warten Sie 20 Sekunden. Nehmen Sie den Tropfen mit einem Taschentuch auf, ohne das Auge zu berühren, und spülen Sie ihn mit einem Tropfen künstlicher Träne aus. Nehmen Sie den Tropfen der künstlichen Träne mit einem Taschentuch auf und beleuchten Sie das Auge mit der blauen Kobaltlampe.
HINWEIS: Der Abrieb muss eine kreisförmige Form haben. Es erfordert eine gewisse Schulung, um es zu erhalten. - Tragen Sie einen Tropfen Augengel auf das abgeriebene Auge auf und lassen Sie die Maus auf dem beheizten Pad aufwachen. Wenn sich die Maus von selbst bewegt, setzen Sie sie wieder in ihren Käfig.
- Kontrollieren Sie das Wohlbefinden des Tieres in den folgenden 2 Tagen.
- Verwenden Sie nach der Verwendung des Augenbohrers ein weiches Gewebe, um Epithelzellen zu entfernen, die im Kopf des Bohrers stecken, und tauchen Sie ihn in 70% EtOH und dann in PBS.
HINWEIS: Sobald die Epithelzellen mit dem Weichgewebe entfernt wurden, stellen Sie sicher, dass keine Gewebestücke im Kopf des Fräsers stecken bleiben.
3. Axotomie der Hornhautnerven
- Führen Sie Schritt 1.4 aus, um die Maus vorzubereiten.
- Legen Sie die Maus unter eine Binokularlupe an der Seite, um an das Auge zu gelangen, das sich der Operation unterzieht. Lege den Boden einer Petrischale unter den Kopf der Maus, so dass das Auge waagerecht ist.
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden durchgeführt, indem Sie durch die Fernlupe schauen. - Entfernen Sie die künstliche Träne mit einem Wattestäbchen und entfernen Sie die Wimpern, ohne das Auge zu berühren.
- Lege eine glatte, gebogene Zange unter das Auge des Tieres, um es aus der Augenhöhle herauszuholen. Achten Sie darauf, die Zange so weit zu schließen, dass das Auge nicht mehr in die Augenhöhle zurückkehren kann, sobald Druck ausgeübt wird, aber nicht übermäßig, um eine Schädigung des Sehnervs zu vermeiden.
- Wenden Sie die Biopsienstanze von 2,5 mm senkrecht ohne Druck auf das Auge an, um einen vollständigen Kontakt der Stanze mit der Oberfläche der Hornhaut zu gewährleisten.
HINWEIS: Sobald der Schlag auf die Hornhaut angewendet wird, kann die Hand des Versuchsleiters das Sichtfeld stören. - Beginnen Sie dann, Druck auszuüben und drehen Sie den Stempel mehrmals.
HINWEIS: Je nach Druck kann die Anzahl der Drehungen variieren, aber im Allgemeinen liegt sie bei etwa 5. Es erfordert Training, um den richtigen Druck und die richtige Bewegung zu spüren. Wird zu viel Druck ausgeübt, reißt das Auge. In diesem Fall kann beobachtet werden, dass Flüssigkeit aus der Läsion austritt und das Auge weich wird. Das Tier muss geopfert werden. - Entfernen Sie die Biopsiestanze. Auf der Hornhaut muss ein Kreis sichtbar sein, an dem der Biopsiestanzer angelegt wurde.
HINWEIS: Für die nächsten Schritte ist die Binokularlupe nicht erforderlich. - Prüfen Sie, ob das kontralaterale Auge noch Augengel hat, und tragen Sie etwas davon auf das axotomisierte Auge auf.
- Lassen Sie die Maus auf einem beheizten Pad (37 °C) aufwachen und setzen Sie sie wieder in ihren Käfig, wenn sie sich selbstständig bewegt.
- Kontrollieren Sie das Wohlbefinden des Tieres in den folgenden 2 Tagen.
4. Hornhaut-Whole-Mount-Verarbeitung
- Probenentnahme und -fixierung.
- Wiegen Sie die Maus und leiten Sie eine Anästhesie ein, indem Sie eine intraperitoneale Injektion von 10 μl/g Mausgewicht (MW) der Anästhesielösung durchführen.
- Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt und keine Reflexe durch Einklemmen der Zehen hat, führen Sie eine zervikale Luxation durch.
- Heben Sie das Auge mit zwei Fingern aus der Augenhöhle und enukleieren Sie das Auge, indem Sie den Sehnerv mit einer gebogenen Schere durchtrennen.
- Legen Sie das Auge in ein 2-ml-Plastikröhrchen, das PBS enthält.
- Fixieren Sie das Auge, indem Sie das PBS durch 4% Paraformaldehyd ersetzen und es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf einen Shaker (30 U/min) legen.
- 3 Mal 10 min mit PBS bei RT auf einem Shaker (30 U/min) spülen.
- Präparation der Hornhaut
- Geben Sie einen Tropfen PBS auf ein Stück Parafilm in einer Petrischale.
- Legen Sie das Auge in diesen Tropfen PBS.
- Platzieren Sie die Petrischale unter der Binokularlupe.
- Präparieren Sie die Hornhaut mit einer Mikropräparierschere und einer Pinzette. Oberhalb des Ziliarkörpers schneiden, um den Limbus zu halten.
- Entfernen Sie die Linse, den Ziliarkörper und die Iris mit einer feinen Pinzette.
- Legen Sie die Hornhaut wieder in ein 2-ml-Kunststoffröhrchen.
- Immunfluoreszenz-Protokoll
- Inkubieren Sie die Hornhaut in 2 ml 2,5 % Fischhautgelatine, 5 % Ziegenserum und 0,5 % Detergens in PBS für 1 h bei RT auf einem Schüttler (30 U/min).
- Die Hornhaut wird in 150 μl einer Lösung aus 2,5 % Fischhautgelatine, 5 % Ziegenserum und 0,1 % Detergens in PBS mit dem auf 1/1000 verdünnten Primärantikörper (Anti-βIII-Tubulin-Antikörper) über Nacht bei 4 °C auf einem Schüttler (30 U/min) inkubiert.
- 3 Mal 1 h lang mit 0,1 % Reinigungsmittel in PBS bei RT auf einem Shaker (30 U/min) spülen.
- Die Hornhaut wird in derselben Lösung wie in Schritt 4.3.2 inkubiert, wobei der Sekundärantikörper über Nacht bei 4 °C auf einem Schüttler (30 U/min) mit 1/500 verdünnt wurde.
- 3 Mal 1 h lang mit PBS bei RT auf einem Shaker (30 U/min) spülen.
- Die Hornhaut wird 10 Minuten lang mit 150 μl DNA-Interkalator, verdünnt bei 1/5000 bei RT auf einem Schüttler (30 U/min) inkubiert.
- 2 mal 5 min mit PBS ausspülen.
- Befestigung der Hornhaut
- Legen Sie die Hornhaut auf einen Objektträger, das Epithel zeigt zum Objektträger, und erstellen Sie mit einem Skalpell vier Abschnitte, ohne die Mitte zu erreichen.
HINWEIS: Führen Sie die Abschnitte gegenüberliegend aus, um eine Blumenform zu bilden. - Legen Sie das Hornhautendothel in Richtung des Objektträgers und entfernen Sie das PBS um die Hornhaut herum mit einem Taschentuch.
HINWEIS: Entfernen Sie das PBS nicht unter der Hornhaut; Andernfalls kann es zu Luftblasen kommen. Wenn ja, geben Sie PBS auf die Hornhaut und entfernen Sie die Luftblase. Starten Sie dann mit Schritt 4.3.2 neu. - Tragen Sie Modellpaste auf die vier Ecken eines rechteckigen Deckglases auf.
HINWEIS: Die Modellpaste hebt das Deckglas an, da die Hornhaut ein dickes Gewebe ist. - Tropfen Sie 50 μl eines Eindeckmediums auf die Hornhaut und legen Sie das Deckglas vorsichtig darüber, um Blasenbildung zu vermeiden.
- Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack.
- Legen Sie die Hornhaut auf einen Objektträger, das Epithel zeigt zum Objektträger, und erstellen Sie mit einem Skalpell vier Abschnitte, ohne die Mitte zu erreichen.
- Bildgebung
- Legen Sie den Objektträger unter ein Epifluoreszenzmikroskop.
- Definieren Sie die Größe des Mosaiks und die Tiefe des Bildes und starten Sie die Aufnahme.
- Wenden Sie ein Entschärfungs- und Entfaltungsprogramm auf das aufgenommene Bild an.
HINWEIS: Schritt 4.6.3 ist eine Option, die in der Erfassungssoftware ausgewählt wurde (Large Volume Computational Clearing [LVCC])
5. Lokalisierte Laserablation von Hornhautnerven
- Schalten Sie das aufrechte Multiphotonenmikroskop und den Laser in Kombination mit einem optisch-parametrischen Oszillator ein. Aktivieren Sie den beheizten Tisch des Mikroskops (37 °C) und stellen Sie die Laser auf 850 nm und 1100 nm ein, entsprechend den für das Mausmodell erforderlichen Wellenlängen.
- Stellen Sie mit einem Leistungsmesser die Leistung der Laser gleichzeitig auf etwa 20 mW ein.
- Befolgen Sie Schritt 1.4, um die Maus vorzubereiten und tragen Sie Augengel auf beide Augen auf.
HINWEIS: Das für dieses Protokoll verwendete Tier muss aus einer transgenen Mauslinie (MAGIC-Marker transgene Maus21) stammen, die ein endogenes Fluorophor in den Hornhautnervenfasern exprimiert. - Setzen Sie das Tier in eine Kopfhalterung ein. Drehen Sie das Tier um 90°, damit das Auge des Interesses zur Decke zeigt.
- Schnallen Sie die Vibrissen des Tieres um, um die Augenpartie zu reinigen. Schnallen Sie den Körper des Tieres an, um die durch die Atmung verursachte Kopfbewegung zu verringern.
- Legen Sie ein kreisförmiges Deckglas auf das Auge über dem Augengel. Das Deckglas muss waagerecht sein. Zögern Sie nicht, den Kopf des Tieres zu bewegen, damit das Deckglas richtig positioniert wird.
- Geben Sie einen Tropfen PBS über das Deckglas. Legen Sie das Tier vorsichtig auf den Mikroskoptisch und stellen Sie den Objektivrevolver im richtigen Abstand ein.
- Verwenden Sie das wässrige 20x-Objektiv und die Epifluoreszenz, um das Auge und die Innervation durch das Okular zu lokalisieren.
- Aktivieren Sie die Laser und definieren Sie die Tiefe, die beleuchtet werden soll.
- Erfassen Sie ein Bild mit einer Auflösung von 1024 x 1024 (Pixeln) bei einer Aufnahmegeschwindigkeit von 70 % bis 85 % der maximalen Scangeschwindigkeit.
- Sobald das Bild aufgenommen ist, nehmen Sie das Tier vom Mikroskop und entfernen Sie das Deckglas und die Gurte. Nehmen Sie das Tier aus der Kopfhalterung, fügen Sie bei Bedarf mehr Augengel hinzu und lassen Sie es in einem Käfig auf einer beheizten Platte aufwachen.
HINWEIS: Die Zerstörung der Innervation kann 1 Woche nach der Bildgebung beobachtet werden. Dieses Protokoll kann über mehrere Wochen einmal pro Woche wiederholt werden, um den durch die Laser verursachten Schaden zu erhöhen. - Wenn sich das Tier von alleine bewegt, stellen Sie den Käfig zurück in den Stall und überprüfen Sie sein Wohlbefinden für die folgenden 2 Tage.
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Representative Results
Diese Studie schlägt mehrere Protokolle vor, um die Hornhautinnervation bei Mäusen zu schädigen. Während ähnliche Protokolle verwendet wurden, um die Physiopathologie der Heilung des Epithels zu untersuchen, haben wir uns entschieden, neue Methoden zur Untersuchung der Regeneration der Hornhautinnervation anzupassen und zu entwickeln. Um die Innervation zu beobachten, haben wir zwei Techniken verwendet. Zunächst verwendeten wir eine Immunfluoreszenztechnik, um die Nervenfasern mit einem panneuronalen Antikörper (BIII-Tubulin) und die Zellkerne mit einem Interkalator zu färben. Zweitens nutzten wir einen transgenen Mausstamm, der fluoreszierende Proteine in den Nervenfasern exprimiert. Die Hornhäute wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop abgebildet.
Bei der ersten Methode wurde ein ophthalmologischer Bohrer mit einem 0,5 mm dicken Rostringentferner verwendet, um die Hornhautepithelschicht zu entfernen (Abbildung 1A). Diese Studie konzentriert sich auf die Schädigung der Innervation im Inneren des Epithels, um die zellulären und molekularen Komponenten zu verstehen, die an seiner Regeneration beteiligt sind. Vor der Operation war das Basalepithel intakt. Die Nervenfasern im subbasalen Plexus bildeten ein typisches Muster, das als Wirbel bezeichnet wird (Abbildung 1B). Die Spitze des Grats, der bei dieser Technik verwendet wurde, entfernte nur die erste Schicht der Hornhaut, bewahrte aber sowohl das Stroma, in dem sich große Faserbündel befinden, als auch das Endothel. Der Teil des Epithels, der durch den Grat entfernt wurde, war gut sichtbar, da eine deutliche Ruptur des Basalepithels und des subbasalen Plexus vorlag (Abbildung 1B). Die Kerne der Keratozyten sind leicht zu identifizieren, da sie im gesamten Stroma spärlich angeordnet sind. In Bezug auf die Innervation war die Grenze ebenfalls klar, mit einer Ruptur des subbasalen Plexus, die es ermöglichte, die großen Faserbündel im Inneren des Stromas zu sehen. Während es etwa 3 Tage dauert, bis das Epithel verheilt ist, dauert die Regeneration der Innervation nach einer Schürfwunde mehr als 4 Wochen. Abbildung 1 zeigt die Regeneration des Epithels 1 Woche nach der Operation, bei der das Basalepithel glatt ist. Der Wirbel fehlt jedoch im Zentrum der Hornhaut, da die Innervation noch nicht zu diesem Punkt zurückgekehrt ist.
Die zweite Methode besteht darin, die Nerven an der Peripherie der Hornhaut mit einer Biopsienstanze von 2,5 mm Durchmesser zu durchtrennen, anstatt sie mit dem Bohrer wegzubürsten (Abbildung 2A). Bei dieser Methode wird das Epithel nicht so stark gestört wie der Abrieb. Nach der Operation ist an der Stelle, an der die Biopsiestanze angelegt wurde, ein dünner peripherer Ring zu sehen, der das Basalepithel schädigt (Abbildung 2B). Allerdings wurden die Nerven an der Peripherie durchtrennt, was die Wallersche Degeneration der Axone auslöste. Diese Art der Degeneration besteht aus dem Zerfall von Nerven vom terminalen Ende der Neuronen in Richtung Zellkörper und in diesem Fall in Richtung des durch die Biopsiestanze induzierten Abschnitts. Je nach Tiefe der Axotomie kann die Schädigung schwerwiegend sein. Hier sehen wir, dass eine starke Degeneration stattgefunden hat, die zu einem vollständigen Verlust der Innervation im Zentrum der Hornhaut im Epithel führt (Abbildung 2B). Da die Innervation für die Aufrechterhaltung der Epithelhomöostase unerlässlich ist, wird ein Zerfall der Epithelschicht eingeleitet, wodurch ein Ulkus entsteht (Abbildung 2B). Geschwürbildung trat nur in stark geschädigten Hornhäuten auf.
Die letzte Technik besteht darin, die Hornhautnerven von anästhesierten transgenen Mäusen mit einem Multiphotonenmikroskop in vivo lokal zu verbrennen (Abbildung 3A). Das erste Bild wird an der Stelle aufgenommen, an der das Brennen durchgeführt wird. In dieser Studie wurde eine transgene Maus verwendet, deren Innervation fluoreszierende Proteine exprimiert. Das Bild wurde in der Mitte der Hornhaut aufgenommen, wo sich der Wirbel befindet (Abbildung 3B), von der Spitze des Epithels bis zum mittleren Stroma. Der Wirbel ist 1 Woche nach der ersten Bildaufnahme nicht mehr sichtbar. Stattdessen ist eine Gruppe von Immunzellen an die Beleuchtungsstelle gewandert, wo wir das Faserbündel im Stroma identifizieren können, das nach der ersten Aufnahme dünner geworden ist (Abbildung 3B).
Abbildung 1: Okulärer Bohrer und Beispiel einer Hornhautinnervation nach Abrasion. (A) Für den Abrieb wurde ein ophthalmologischer Fräser mit einem Rostringentferner von 0,5 mm verwendet. (B) Beispiele für präparierte und immungefärbte Hornhäute. Die Bilder vor der Abrasion zeigen das glatte Basalepithel und den Wirbel (weiße Pfeilspitze) in der Mitte. Postabrasionsbilder zeigen eine deutliche Abgrenzung des subbasalen Plexus, der entfernt wurde (rote Pfeilspitzen). Bilder, die 1 Woche nach dem Abrieb (1WPAbr) aufgenommen wurden, zeigen, wo sich die Fasern regenerieren (orangefarbene Pfeilspitze). Die Innervation wird mit Anti-BIII-Tubulin-Antikörpern (grün) gefärbt. Die Zellkerne werden mit einem DNA-Interkalator (violett) angefärbt. Die Bilder wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Biopsiestanze und Beispiel für eine Hornhautinnervation nach Axotomie. (A) Eine sterile Biopsiestanze mit einem Durchmesser von 2,5 mm wird auf das Auge aufgebracht, um eine Axotomie einzuleiten. (B) Beispiele für präparierte und immungefärbte Hornhäute. Bilder aus der Zeit vor der Axotomie veranschaulichen das Vorhandensein des Wirbels in der Mitte der Hornhaut (weiße Pfeilspitze). Bilder nach der Axotomie zeigen den Ring (rote Pfeilspitzen), der durch den Stempel im Epithel entstanden ist. Bilder, die 2 Wochen nach der Axotomie (2WPAx) aufgenommen wurden, veranschaulichen die Bildung des Ulkus (orangefarbene Pfeilspitze). Die Innervation wird mit BIII-Tubulin (grün) gefärbt. Die Zellkerne werden mit einem Interkalator (violett) gefärbt. Die Bilder wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Aufbau für die Kauterisierung des Hornhautnervs durch Laser und ein Beispiel (A) Die anästhesierte transgene MAGIC-Marker-Maus21 wird durch den Kopfhalter gehalten, und ihr Auge ist auf das 20-fache Objektiv des Biphotons gerichtet. Der Körper der Maus ist festgeschnallt, um Atembewegungen während der Aufnahme zu vermeiden. (B) Dreidimensionale (3D) Ansicht der ersten Aufnahme des Wirbels unter Verwendung der Wellenlängen 850 nm und 1100 nm gleichzeitig vor dem Lichtschaden und 1 Woche nach dem Lichtschaden (1WPPhDa) an der gleichen Stelle des Wirbels. Die Laser induzierten die Migration von Immunzellen (Pfeilspitzen), wo sich der Wirbel befand. Maßstabsbalken = 80 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Technik | Betroffene Struktur | Grad der Wirkung (+/-) | Art des Studiums | Heilungsphase |
| Abrieb | Epithel | ++ | Regeneration von Epithel und Innervation | Epithel <1 Woche Innervation >2 Monate |
| Innervation | ++ | |||
| Axotomie | Epithel | +/- | Innervationsregeneration Neurotrophe Keratitis | Innervation >2 Monate NK >2 Wochen |
| Stroma | +/- | |||
| Innervation | ++ | |||
| Nervenverätzung | Epithel | + (lokal) | Lokale Innervationsregeneration Neurotrophe Keratitis | Abhängig von der Häufigkeit der Kauterisierung |
| Stroma | ||||
| Innervation |
Tabelle 1: Vergleich der drei vorgeschlagenen Strategien.
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Discussion
Neurotrophe Keratitis gilt als seltene Erkrankung, von der 5 von 10.000 Personen betroffen sind. Menschen, die aufgrund einer körperlichen Verletzung wie Verätzungen oder Syndromen wie Diabetes oder Multipler Sklerose an NK leiden, sind jedoch nicht in dieser Statistik enthalten3. Darüber hinaus wird diese Erkrankung nach wie vor deutlich unterdiagnostiziert22 und die Prävalenz der Krankheit unterschätzt. Es besteht ein großer Bedarf an neuen Behandlungen und Therapien, die die Axonregeneration fördern, um das Sehvermögen der Patienten zu erhalten. Derzeit ist die einzige verfügbare Behandlung für Patienten, die an den frühen Stadien der NK leiden, die Anwendung von pharmakologischen Augentropfen 23,24,25, die die Regeneration der Hornhautnerven unterstützen. Diese sind jedoch nur bis zu einem gewissen Punkt wirksam. Bei schwereren Veränderungen der Hornhaut, wie z. B. Geschwüren, bietet eine Amnionmembrantransplantation oder eine Keratoplastik 3,4 eine vorübergehende Lösung, um die Wunde zu schließen und Infektionen zu vermeiden. Diese Transplantate müssen jedoch nach einer begrenzten Zeit ersetzt werden, wobei das Risiko einer Abstoßung mit jedem weiteren Eingriff steigt.
In diesem Bericht werden mehrere Modelle vorgestellt, die verschiedene Formen von NK zusammenfassen, die häufig in der Klinik auftreten (Tabelle 1). Diese können genutzt werden, um unser Wissen über die Hornhautinnervation zu vertiefen und Alternativen zu aktuellen Behandlungen zu untersuchen. Das Abrasionsmodell kann mit der PRK-Chirurgie in Verbindung gebracht werden, da es das langsame Nachwachsen der Innervation rekapituliert, das nach der Heilung des abgeschliffenen Epithels auftritt. Vorteilhaft ist, dass diese Technik relativ einfach erlernt und reproduziert werden kann, wenn der richtige Druck mit dem ophthalmologischen Fräser ausgeübt wird und ein regelmäßiger Abrieb entsteht. Darüber hinaus kann diese Technik an die spezifischen Bedürfnisse jedes Patienten oder an die Interessen des Benutzers angepasst werden, indem die Größe des abgeschliffenen Bereichs gewählt wird.
Die Axotomie ähnelt der lamellären Keratoplastik bei Patienten mit NK26 im Spätstadium. Sie ermöglicht die Untersuchung der Degeneration der Fasern (Wallersche Degeneration) und der Wiederbesiedlung der Axone in der zentralen Hornhaut. Während das für die Durchführung der Operation erforderliche Material relativ einfach ist, muss der Behandler in der richtigen Technik geschult werden, insbesondere in der korrekten Anwendung von Druck und der richtigen Anzahl von Umdrehungen mit der Biopsiestanze. Im Rahmen einer Keratoplastik wird die Tiefe der Inzision durch den Einsatz eines Trepangeräts und einer intraoperativen optischen Kohärenztomographie genau bestimmt, wobei diese Techniken nicht auf Mausmodelle adaptierbar sind17. Ein weiterer Unterschied zur Keratoplastik ist das Fehlen einer Spendertransplantation bei der hier beschriebenen Technik, da wir nur den Schnitt der Hornhaut durchgeführt haben. Dieses Modell ist von Interesse, da ein gesundes Epithel vorhanden ist, in dem die Innervation nachwachsen muss. Dies unterscheidet es vom Abrasionsmodell, bei dem das Epithel mit der Innervation entfernt wird.
Die Technik der Nervenkauterisierung, bei der ein Multiphotonenmikroskop verwendet wird, ahmt die durch einen Sonnenbrand verursachten Schäden nach, tut dies jedoch in einem lokalisierten Bereich der Hornhaut und löst so DNA-Schäden und ROS-Bildung aus19,20. Mit dieser Methode ist es möglich, die Regeneration der Fasern von verschiedenen Stellen auf der Hornhaut zu untersuchen und sogar die Kauterisierung im gleichen Bereich mehrmals zu wiederholen, wodurch die Auswirkungen auf das Axonwachstum und die Migration von Immunzellen bewertet werden können.
Diese drei Protokolle bieten die Möglichkeit, die grundlegenden Aspekte des axonalen Nachwachsens zu untersuchen, indem die Regenerationsmechanismen sowie die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen in der Hornhaut und der Innervation untersucht werden. Diese Methoden bieten auch ein Mittel zur Förderung der Axonregeneration durch Anwendung neuer pharmakologischer Moleküle24 oder Gentherapie27.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Karine Loulier für den Zugang zur transgenen Mauslinie MAGIC-Marker. Die Autoren danken auch der RAM-Neuro Animal Core Facility und der Imaging Facility MRI, einem Mitglied der nationalen Infrastruktur France-BioImaging, die von der französischen Nationalen Forschungsagentur unterstützt wird (ANR-10-INBS-04, "Investitionen für die Zukunft"). Diese Forschung wurde vom ATIP-Avenir-Programm, Inserm, der Region Okzitanien, der Universität Montpellier, der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-21-CE17-0061), der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) und der Groupama-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
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