Summary
Her foreslår vi tre forskellige metoder til at beskadige de sensoriske fibre, der inderverer hornhinden. Disse metoder letter undersøgelsen af axonregenerering hos mus. Disse tre metoder, som kan tilpasses andre dyremodeller, er ideelle til undersøgelse af hornhindeinnerveringsfysiologi og regenerering.
Abstract
Hornhinden er et gennemsigtigt væv, der dækker øjet og er afgørende for klart syn. Det er det mest innerverede væv i kroppen. Denne innervering giver fornemmelse og trofisk funktion til øjet og bidrager til at bevare hornhindens integritet. Den patologiske forstyrrelse af denne innervering kaldes neurotrofisk keratitis. Dette kan udløses af øjenskader, kirurgi eller sygdom. I denne undersøgelse foreslår vi tre forskellige protokoller til at påføre innerveringen skade på måder, der rekapitulerer de tre typer tilfælde, der generelt opstår i klinikken.
Den første metode består i at lave en slid af epitelet med en oftalmisk burr. Dette indebærer fjernelse af epitellaget, de frie nerveender og subbasal plexus på en måde, der ligner den fotorefraktive keratektomikirurgi, der udføres i klinikken. Den anden metode retter sig kun mod innerveringen ved at sektionere den i periferien med en biopsistans, der opretholder epithelets integritet. Denne metode ligner de første trin i lamellær keratoplastik og fører til en degeneration af innerveringen efterfulgt af genvækst af axonerne i den centrale hornhinde. Den sidste metode beskadiger innerveringen af en transgen musemodel ved hjælp af et multifotonmikroskop, som specifikt lokaliserer stedet for cauterization af de fluorescerende nervefibre. Denne metode påfører den samme skade som fotokeratitis, en overeksponering for UV-lys.
Denne undersøgelse beskriver forskellige muligheder for at undersøge fysiopatologien af hornhindeinnervering, især degeneration og regenerering af axonerne. Fremme af regenerering er afgørende for at undgå sådanne komplikationer som epiteldefekter eller endda perforering af hornhinden. De foreslåede modeller kan hjælpe med at teste nye farmakologiske molekyler eller genterapi, der forbedrer nerveregenerering og begrænser sygdomsprogression.
Introduction
Hornhinden, som er øjets gennemsigtige overflade, består af tre forskellige lag: epitelet, stromaen og endotelet. Dette organ har den højeste tæthed af innervering i kroppen og består hovedsageligt af sensoriske fibre (type Aδ og C), der stammer fra den oftalmiske gren af trigeminusganglionen. Sensoriske fibre trænger ind i hornhindens periferi i midten af stroma i form af store bundter, der forgrener sig for at dække overfladen. De forgrener sig derefter for at gennembore Bowmanns membran og danner den subbasale plexus, som let genkendes ved dannelsen af en hvirvel i midten af hornhinden. Disse fibre slutter som frie nerveender på epitelets ydre overflade. De er i stand til at transducere termiske, mekaniske og kemiske stimuli og frigive trofiske faktorer, der er afgørende for epitelhomeostase 1,2. Neurotrofisk keratitis (NK) er en degenerativ sygdom, der påvirker hornhinden sensorisk innervering. Denne sjældne sygdom stammer fra et fald eller et tab af hornhindefølsomhed, der resulterer i lavere tåreproduktion og dårlige helingsegenskaber hos hornhinden3. NK udvikler sig gennem tre velbeskrevne stadier, fra stadie 1, hvor patienter lider af epiteldefekter, til trin 3, hvor stromalsmeltning og/eller hornhindeperforering forekommer4.
Klinisk kan oprindelsen af denne sygdom være forskelligartet. Patienter kan miste hornhindeinnervering efter fysisk skade på øjet, kirurgi eller gennem kroniske sygdomme, såsom diabetes 5,6. Hidtil er NK-patogeneseprocessen dårligt forstået, og terapeutiske muligheder for denne synstruende tilstand er meget begrænsede. Derfor er der behov for en bedre forståelse af egenskaberne ved epiteldefekter for bedre at forstå mekanismerne bag regenerering af disse fibre og potentielt fremme dem. Her foreslår vi flere modeller af hornhindeskade, der fremkalder NK hos mus.
Den første model er slid af hornhindens epitellag med en okulær burr. Denne model er hovedsageligt blevet undersøgt i forbindelse med regenerering af epitelet hos forskellige dyr, såsom gnavere og fisk 7,8,9, og for at teste molekyler, der fremmer hornhindeheling10,11. Fysiologisk tager det 2-3 dage for epitelcellerne at lukke såret. Det fysiologiske mønster af innerveringen tager imidlertid mere end fire uger at komme sig efter slid12,13. Under operationen fjerner den okulære burr hornhindens epitellag, der indeholder subbasal plexus og fibrenes frie nerveender. Denne procedure kan klinisk sammenlignes med patienter med fotorefraktiv keratektomi (PRK) for at korrigere øjenbrydningsdefekter. Fremgangsmåden består i at fjerne hornhindens epitel og derefter omforme stroma med en laser14. Patienter kan opleve flere bivirkninger efter en sådan operation, såsom et fald i hornhindenervetætheden i 2 år og en reduktion i følsomheden i en varighed på 3 måneder til et år efter operationen15. I betragtning af at operationen inducerer en skrøbelighed i hornhindemikromiljøet, kan denne model hjælpe med at undersøge disse bivirkninger og udvikle terapeutiske tilgange, der vil fremme hurtigere reinnervering og dermed reducere de pågældende bivirkninger.
Den anden model består i at sektionere axonerne i hornhindens periferi med en biopsistans, hvilket inducerer en wallersk degeneration af den centrale innervering 16. Klinisk kan denne metode sammenlignes med anterior lamellær keratoplastik, hvor kirurgen realiserer en delvis trephination af hornhinden for at fjerne en del af hornhindens forreste tykkelse og erstatte den med en donortransplantation 17. Efter lamellær keratoplastik kan patienterne lide af en række symptomer, herunder tørre øjne, tab af hornhindeinnervering og transplantatafstødning18. Denne axotomimodel udført på hornhindenerver kunne give indsigt i mekanismerne for fiberdegeneration, som opstår efter et transplantat efterfulgt af axonernes regenerering.
Den tredje metode beskadiger hornhindenerverne med en laser. Ved at anvende et multifotonmikroskop på hornhinden hos bedøvede dyr induceres degeneration af nerverne lokaliseret i det optiske felt som et resultat af dannelse af reaktive iltarter (ROS), hvilket fører til DNA-skade og cellulær kavitation19. Denne metode rekapitulerer hornhindefotoskader induceret af overeksponering for naturlig UV (solskoldning), som også udløser ROS-dannelse, hvilket fører til DNA-skade20. Patienter, der lider af hornhinde solskoldning, oplever stor smerte, da forringelsen af epitelceller fratager hornhindefibrenes ekstremiteter af alle.
De tre metoder, der er beskrevet her, er designet til at muliggøre undersøgelse af NK-patogeneseprocessen og axonregenerering. De er let reproducerbare og præcise. Desuden giver de mulighed for hurtig genopretning og nem overvågning af dyrene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev godkendt af National Animal Experiment Board.
1. Forberedelser
- Forbered en bedøvelsesopløsning af ketamin-xylazin til anæstesi. Ketamin injiceres ved 80 mg/kg og xylazin ved 10 mg/kg ved at fortynde 200 μL ketamin (100 mg/ml) og 125 μL xylazin (20 mg/ml) i 2.175 ml steril 0,9% NaCl.
- Forbered 0,02 mg/ml buprenorphinopløsning som en smertestillende opløsning ved at tilsætte 100 μL 0,3 mg/ml buprenorphin til 1.400 ml steril 0,9% NaCl.
- Forbered den fluorescerende farvningsopløsning.
- Brug en fin skala til at veje 10 mg fluoresceinsalt og fortynd det i 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS) for at opnå en 0,1% fluoresceinopløsning.
- Beskyt opløsningen mod lyset og ryst den i 5 min. Brug en 10 ml sprøjte og et sprøjtefilter på 0,2 μm til at filtrere opløsningen.
BEMÆRK: Den fluorescerende opløsning skal beskyttes mod lyset og kan opbevares ved +4 °C i 5 dage.
- Forberedelse af musen
- Vægt musen og inducer anæstesi ved at udføre en intraperitoneal injektion af 10 μL / g musevægt (MW) af anæstesiopløsningen. Når musen holder op med at bevæge sig, skal du placere den på en opvarmet plade (37 °C) og kontrollere, at den er fuldstændig bedøvet ved at klemme tæerne.
- Påfør en dråbe kunstig tåre på øjet, der gennemgår operationen, og en dråbe okulær gel på det kontralaterale øje.
- Når musen ikke reagerer på klemning, injiceres analgesiet (0,02 mg/ml buprenorphin) ved 5 μL/g MW for at give 0,1 mg/kg buprenorphin subkutant i nakken.
2. Slid af hornhinden
- Følg trin 1.3 for at forberede den fluorescerende farvningsopløsning.
- Følg trin 1.4 for at forberede musen.
- Før du udfører slid, dypp den okulære burr i 70% EtOH og derefter i PBS for at rengøre den.
- Placer musen på en opvarmet plade (37 °C) på siden for let at få adgang til øjet, der gennemgår operationen.
- Brug en vatpind til at absorbere den kunstige tåre og børst øjenvipperne væk uden at røre øjet.
- Tænd den okulære burr, åbn musens øjenlåg med to fingre, og bloker samtidig vibrissae for at undgå, at de sidder fast i burren.
- Lokaliser pupillen eller midten af øjet og påfør den okulære burr på øjets overflade, og lav cirkulære bevægelser. Ved at se tæt på kan overfladen af det fjernede epitel observeres. Ellers skal du udføre ca. 20 cirkulære bevægelser på hornhinden.
- Sæt musen tilbage på maven og kontroller, om den okulære gel stadig er til stede i det kontralaterale øje.
- Påfør en dråbe fluorescerende farvningsopløsning på det slidte øje og vent i 20 s. Absorber dråben med et væv uden at røre øjet og skyl det med en dråbe kunstig tåre. Absorber dråben af den kunstige tåre med et væv og belys øjet med den blå koboltlampe.
BEMÆRK: Slid skal have en cirkulær form. Det kræver en vis træning at opnå det. - Påfør en dråbe okulær gel på det slidte øje og lad musen vågne op på den opvarmede pude. Når musen bevæger sig alene, skal du sætte den tilbage i buret.
- Kontroller dyrets trivsel i løbet af de følgende 2 dage.
- Efter brug af den okulære burr skal du bruge et blødt væv til at fjerne epitelceller, der sidder fast i burrens hoved og dyppe det i 70% EtOH og derefter PBS.
BEMÆRK: Når epitelcellerne er fjernet med blødt væv, skal du sørge for, at ingen stykker væv sidder fast i burrens hoved.
3. Axotomi af hornhindenerverne
- Følg trin 1.4 for at forberede musen.
- Placer musen under en kikkertlup på siden for at få adgang til øjet, der gennemgår operationen. Sæt bunden af en petriskål under musens hoved, så øjet kan være vandret.
BEMÆRK: Følgende trin udføres ved at kigge gennem kikkertlappen. - Fjern den kunstige tåre med en vatpind og fjern øjenvipper uden at røre øjet.
- Placer glatte buede tænger under dyrets øje for at springe det ud fra kredsløbet. Sørg for at lukke tangen nok til, at øjet ikke kan gå tilbage i kredsløbet, når trykket er påført, men ikke overdrevent for at forhindre synsnerveskader.
- Påfør biopsistansen på 2,5 mm lodret på øjet uden tryk for at sikre total kontakt mellem stansen og hornhindens overflade.
BEMÆRK: Når slaget er påført hornhinden, kan eksperimentatorens hånd forstyrre synsfeltet. - Begynd derefter at lægge pres og drej stansen flere gange.
BEMÆRK: Afhængigt af trykket kan antallet af drejninger variere, men generelt er det omkring 5. Det kræver træning at mærke det rigtige tryk og bevægelse. Hvis der påføres for meget tryk, brister øjet. I dette tilfælde kan væske observeres ud af læsionen, og øjet bliver blødgøret. Dyret skal ofres. - Fjern biopsistansen. En cirkel skal være synlig på hornhinden, hvor biopsistansen blev påført.
BEMÆRK: De næste trin kræver ikke kikkertlup. - Kontroller, om det kontralaterale øje stadig har okulær gel, og påfør noget på det aksotomiserede øje.
- Lad musen vågne op på en opvarmet pude (37 °C) og sæt den tilbage i buret, når den bevæger sig selv.
- Kontroller dyrets trivsel i løbet af de følgende 2 dage.
4. Cornea helmonteret behandling
- Prøveindsamling og fiksering.
- Vej musen og inducer anæstesi ved at udføre en intraperitoneal injektion af 10 μL / g musevægt (MW) af anæstesiopløsningen.
- Når musen holder op med at bevæge sig og ikke har reflekser ved tåklemning, skal du udføre en cervikal dislokation.
- Pop øjet ud af kredsløbet ved hjælp af to fingre og enukleere øjet ved at skære synsnerven ved hjælp af buet saks.
- Placer øjet i et 2 ml plastrør indeholdende PBS.
- Fastgør øjet ved at erstatte PBS med 4% paraformaldehyd og placere det på en ryster (30 o / min) ved stuetemperatur (RT) i 20 minutter.
- Skyl 3 gange i 10 minutter med PBS ved RT på en ryster (30 omdr./min.).
- Dissektion af hornhinden
- Placer en dråbe PBS på et stykke parafilm inde i en petriskål.
- Placer øjet i denne dråbe PBS.
- Læg petriskålen under kikkerten.
- Disseker hornhinden ved hjælp af mikrodissektionssaks og tang. Skær over ciliarylegemet for at holde limbus.
- Fjern linsen, ciliarylegemet og iris med fine tang.
- Placer hornhinden tilbage i et 2 ml plastrør.
- Immunofluorescens protokol
- Inkuber hornhinden i 2 ml 2,5% fiskeskindsgelatine, 5% gedeseserum og 0,5% vaskemiddel i PBS i 1 time ved RT på en ryster (30 omdr./min.).
- Inkuber hornhinden i 150 μl af en opløsning af 2,5 % fiskeskindsgelatine, 5 % gedeseserum og 0,1 % vaskemiddel i PBS indeholdende det primære antistof fortyndet ved 1:1000 (anti βIII tubulinantistof) natten over ved 4 °C på en ryster (30 omdr./min.).
- Skyl 3 gange i 1 time med 0,1% vaskemiddel i PBS ved RT på en ryster (30 o / min).
- Unkuber hornhinden i samme opløsning som i trin 4.3.2, indeholdende det sekundære antistof fortyndet ved 1:500 natten over ved 4 °C på en ryster (30 omdr./min.).
- Skyl 3 gange i 1 time med PBS ved RT på en ryster (30 o / min).
- Inkuber hornhinden i 10 minutter med 150 μL DNA-interkalator fortyndet ved 1:5000 ved RT på en ryster (30 omdr./min.).
- Skyl 2 gange i 5 minutter med PBS.
- Montering af hornhinden
- Placer hornhinden på et dias, epitel mod diaset, og brug en skalpel til at oprette fire sektioner uden at nå midten.
BEMÆRK: Gør sektionerne modsat hinanden for at danne en blomsterform. - Placer hornhindeendotelet mod objektglasset og fjern PBS omkring hornhinden ved hjælp af et væv.
BEMÆRK: Fjern ikke PBS under hornhinden; Ellers kan der forekomme luftbobler. Hvis ja, tilføj PBS til hornhinden og fjern luftboblen. Genstart derefter fra trin 4.3.2. - Tilføj modelpasta på de fire hjørner af en rektangulær dæksel.
BEMÆRK: Modelpastaen hæver dæksedlen, da hornhinden er et tykt væv. - Slip 50 μL af et monteringsmedium på hornhinden, og læg forsigtigt dækslet ovenover for at undgå bobledannelse.
- Forsegl dækslet med neglelak.
- Placer hornhinden på et dias, epitel mod diaset, og brug en skalpel til at oprette fire sektioner uden at nå midten.
- Imaging
- Placer diaset under et epifluorescerende mikroskop.
- Definer mosaikkens størrelse og billedets dybde, og start erhvervelsen.
- Anvend et deblurring og deconvolution program på det erhvervede billede.
BEMÆRK: Trin 4.6.3 er en indstilling, der er valgt i anskaffelsessoftwaren (Large Volume Computational Clearing [LVCC])
5. Lokaliseret laserablation af hornhindenerver
- Tænd det opretstående multifotonmikroskop og laseren kombineret med en optisk parametrisk oscillator. Aktiver mikroskopets opvarmede trin (37 °C), og indstil laserne til 850 nm og 1100 nm, svarende til de krævede bølgelængder for musemodellen.
- Brug en effektmåler til at indstille lasernes effekt samtidigt til omkring 20 mW.
- Følg trin 1.4 for at forberede musen og anvende okulær gel på begge øjne.
BEMÆRK: Dyret, der anvendes til denne protokol, skal være fra en transgen muselinje (MAGIC-Marker transgen mus21), der udtrykker en endogen fluorofor i hornhindenervefibrene. - Installer dyret i en hovedholder. Drej dyret 90° for at øjet af interesse vender mod loftet.
- Rem dyrets vibrissae for at rydde øjenområdet. Spænd dyrets krop for at mindske hovedbevægelsen induceret af vejrtrækning.
- Placer et cirkulært dæksel på øjet over den okulære gel. Dæksedlen skal være vandret. Tøv ikke med at flytte dyrets hoved for at dæksedlen skal placeres korrekt.
- Tilføj en dråbe PBS over dæksedlen. Placer dyret forsigtigt på mikroskoptrinnet og sæt måltårnet i den rigtige afstand.
- Brug det vandige 20x objektiv og epifluorescens til at lokalisere øjet og innerveringen gennem okularet.
- Aktivér laserne og definer den dybde, der skal belyses.
- Hent et billede på 1024 x 1024 (pixel) med en anskaffelseshastighed på 70-85 % af den maksimale scanningshastighed.
- Når billedet er erhvervet, skal du tage dyret af mikroskopet og fjerne dækslen og stropperne. Fjern dyret fra hovedholderen, tilsæt mere okulær gel, hvis det er nødvendigt, og lad det vågne op i et bur på en opvarmet plade.
BEMÆRK: Ødelæggelse af innerveringen kan observeres 1 uge efter billeddannelsen. Denne protokol kan gentages en gang om ugen i flere uger for at øge skaden forårsaget af laserne. - Når dyret bevæger sig alene, skal du sætte buret tilbage i stalden og kontrollere dets trivsel i de følgende 2 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse foreslår flere protokoller til at påføre skade på hornhindeinnervering hos mus. Mens lignende protokoller er blevet brugt til at undersøge fysiopatologien for helingen af epitelet, valgte vi at tilpasse og udvikle nye metoder til at undersøge hornhindeinnerveringsregenerering. For at observere innerveringen brugte vi to teknikker. Først anvendte vi en immunfluorescensteknik til at plette nervefibrene ved hjælp af et panneuronalt antistof (BIII tubulin) og kernerne med en interkalator. For det andet udnyttede vi en transgen musestamme, der udtrykte fluorescerende proteiner i nervefibrene. Hornhinderne blev afbildet ved hjælp af et epifluorescerende mikroskop.
Den første metode anvendte en oftalmisk grater med en rustringfjerner på 0,5 mm for at fjerne hornhindeepitellaget (figur 1A). Denne undersøgelse fokuserer på skaderne på innerveringen placeret inde i epitelet som et middel til at forstå de cellulære og molekylære komponenter, der er involveret i dets regenerering. Før operationen var basalepitelet intakt. Nervefibrene i subbasal plexus dannede et typisk mønster kaldet hvirvelstrømmen (figur 1B). Spidsen af burren, der blev brugt i denne teknik, fjernede kun det første lag af hornhinden, men bevarede både stroma, hvor store bundter af fibre er placeret, og endotelet. Den del af epitelet, der blev fjernet af burren, var let synlig, da der var et klart brud på basalepitelet og det subbasale plexus (figur 1B). Keratocytternes kerner kan let identificeres, da de er tyndt arrangeret i hele stroma. Med hensyn til innerveringen var grænsen også klar, med et brud på den subbasale plexus, der gjorde det muligt at se de store bundter af fibre inde i stromaet. Mens det tager omkring 3 dage for epitelet at helbrede, tager regenerering af innerveringen mere end 4 uger efter en slid. Figur 1 illustrerer regenerering af epitelet 1 uge efter operationen, hvor basalepitelet er glat. Imidlertid er hvirvelstrømmen fraværende fra hornhindens centrum, da innerveringen endnu ikke er vendt tilbage til det punkt.
Den anden metode består i at skære nerverne i periferien af hornhinden med en biopsistans på 2,5 mm diameter i stedet for at børste dem væk med burren (figur 2A). Denne metode forstyrrer ikke epitelet så meget som slid. Efter operationen kan en tynd perifer ring observeres på det punkt, hvor biopsistansen blev påført, hvilket beskadiger basalepitelet (figur 2B). Imidlertid er nerverne i periferien blevet sektioneret, hvilket udløser den walleriske degeneration af axonerne. Denne type degeneration består af forfald af nerver fra neuronernes terminale ende mod cellekroppen og i dette tilfælde mod sektionen induceret af biopsistansen. Afhængigt af aksotomiens dybde kan skader være alvorlige. Her ser vi, at der er sket kraftig degeneration, hvilket fører til et totalt tab af innervering i midten af hornhinden i epitelet (figur 2B). Da innervering er afgørende for vedligeholdelsen af epitelhomeostase, initieres en opløsning af epitellaget, hvilket skaber et sår (figur 2B). Sårdannelse skete kun i stærkt beskadigede hornhinder.
Den sidste teknik består i lokalt at brænde in vivo hornhindenerverne hos bedøvede transgene mus med et multifotonmikroskop (figur 3A). Det første billede erhverves på det sted, hvor brændingen vil blive foretaget. Denne undersøgelse brugte en transgen mus, hvis innervering udtrykker fluorescerende proteiner. Billedet blev erhvervet i midten af hornhinden, hvor hvirvelstrømmen er placeret (figur 3B), fra toppen af epitelet til midten af stroma. Hvirvelstrømmen er ikke længere synlig 1 uge efter den første billedoptagelse. I stedet er en gruppe immunceller migreret til belysningsstedet, hvor vi kan identificere bundtet af fibre i stroma, som er tyndet efter den første erhvervelse (figur 3B).
Figur 1: Okulær burr og eksempel på hornhindeinnervering efter slid. (A) En oftalmologisk grater med en rustringfjerner på 0,5 mm blev brugt til at fremstille slid. (B) Eksempler på dissekerede og immunfarvede hornhinder. Pre-slid billeder illustrerer det glatte basale epitel og hvirvelstrømmen (hvid pilespids) i midten. Billeder efter slid viser en klar afgrænsning af den subbasale plexus, som blev fjernet (røde pilespidser). Billeder erhvervet 1 uge efter slid (1WPAbr) viser, hvor fibrene regenererer (orange pilespids). Innerveringen er farvet med anti-BIII tubulin antistof (grøn). Kernerne farves med en DNA-interkalator (lilla). Billederne blev erhvervet med et epifluorescerende mikroskop. Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Biopsistans og eksempel på hornhindeinnervering efter aksotomi. (A) En steril biopsistans med en diameter på 2,5 mm påføres øjet for at fremkalde en aksotomi. (B) Eksempler på dissekerede og immunfarvede hornhinder. Pre-axotomi billeder illustrerer tilstedeværelsen af hvirvelstrømmen i midten af hornhinden (hvid pilespids). Post-axotomi billeder viser ringen (røde pilespidser) skabt af stansen i epitelet. Billeder erhvervet ved 2 uger post-axotomi (2WPAx) illustrerer dannelsen af såret (orange pilespids). Innerveringen er farvet med BIII tubulin (grøn). Kernerne farves med en intercalator (lilla). Billederne blev erhvervet med et epifluorescerende mikroskop. Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opsætning til hornhindenervekauterisering med lasere og et eksempel (A) Den bedøvede MAGIC-Marker transgene mus21 vedligeholdes af hovedholderen, og dens øje vender mod bifotonens 20x mål. Musens krop er fastspændt for at undgå vejrtrækningsbevægelse under erhvervelse. (B) Tredimensionel (3D) visning af den første erhvervelse af hvirvelstrømmen ved hjælp af bølgelængderne 850 nm og 1100 nm samtidigt før fotoskaden og 1 uge efter fotoskaden (1WPPhDa) på samme hvirvelsted. Laserne inducerede migration af immunceller (pilespids), hvor hvirvelstrømmen plejede at være placeret. Skalabjælker = 80 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Teknik | Påvirket struktur | Grad af påvirkning (+/-) | Type undersøgelse | Helingsperiode |
| Slid | Epitel | ++ | Epitel og innervering regenerering | Epitel <1 uge Innervation >2 måneder |
| Innervation | ++ | |||
| Axotomi | Epitel | +/- | Innervation regenerering Neurotrofisk keratitis | Innervation >2 måneder NK >2 uger |
| Stroma | +/- | |||
| Innervation | ++ | |||
| Nerve cauterization | Epitel | + (lokalt) | Lokal innervering regenerering Neurotrofisk keratitis | Afhængig af hyppigheden af cauterization |
| Stroma | ||||
| Innervation |
Tabel 1: Sammenligning af de tre foreslåede strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurotrofisk keratitis betragtes som en sjælden sygdom, der påvirker 5 ud af 10.000 individer. Personer, der lider af NK på grund af en fysisk skade såsom kemiske forbrændinger eller syndromer som diabetes eller multipel sklerose, er imidlertid ikke medtaget i disse statistikker3. Desuden forbliver denne tilstand signifikant underdiagnosticeret22, og forekomsten af sygdommen undervurderes. Der er et stærkt behov for nye behandlinger og terapi, der vil fremme axonregenerering som et middel til at bevare patienternes syn. I øjeblikket er den eneste tilgængelige behandling, der tilbydes patienter, der lider af de tidlige stadier af NK, anvendelsen af farmakologiske øjendråber 23,24,25, der understøtter hornhindenerveregenerering. Disse er dog kun effektive til et vist punkt. I tilfælde af mere alvorlig ændring af hornhinden, såsom sår, fosterhindetransplantation eller keratoplastik 3,4 tilbyde en midlertidig løsning for at lukke såret og undgå infektion. Disse transplantater skal dog udskiftes efter en begrænset periode, idet risikoen for afstødning øges ved hver yderligere procedure.
Denne rapport præsenterer flere modeller, der rekapitulerer forskellige former for NK, der almindeligvis forekommer i klinikken (tabel 1). Disse kan bruges til at uddybe vores viden om hornhindeinnervering og til at undersøge alternativer til nuværende behandlinger. Slidmodellen kan være forbundet med PRK-kirurgi, da den rekapitulerer den langsomme genvækst af innerveringen, som opstår efter helingen af det slidte epitel. Til sin fordel kan denne teknik undervises og gengives relativt let, når det korrekte tryk med den oftalmiske burr påføres, og der skabes et regelmæssigt slibet område. Desuden kan denne teknik tilpasses hver patients specifikke behov eller tilpasses brugerens interesse ved at vælge størrelsen på det slibede område.
Axotomien ligner den lamellære keratoplastik, der gennemgås af patienter, der lider af NK26 i sen fase. Det muliggør undersøgelse af degenerationen af fibrene (Wallerian degeneration) og rekolonisering af axonerne i den centrale hornhinde. Mens det materiale, der kræves for at udføre operationen, er relativt simpelt, skal udøveren trænes i den korrekte teknik, især den korrekte anvendelse af tryk og det korrekte antal drejninger med biopsistansen. I forbindelse med en keratoplastik bestemmes dybden af snittet præcist ved anvendelse af en trephin-enhed og intraoperativ optisk kohærenstomografi, hvilke teknikker ikke kan tilpasses murine modeller17. En anden ulighed med keratoplastik er fraværet af donortransplantation i teknikken beskrevet her, da vi kun udførte snittet i hornhinden. Denne model er af interesse på grund af tilstedeværelsen af et sundt epitel, hvor innerveringen skal vokse tilbage. Dette adskiller det fra slidmodellen, hvor epitelet fjernes med innerveringen.
Nervekauteriseringsteknikken ved hjælp af et multifotonmikroskop efterligner skaden forårsaget af solskoldning, men gør det på et lokaliseret område af hornhinden, hvilket udløser DNA-skader og ROS-dannelse19,20. Med denne metode er det muligt at studere regenerering af fibrene fra forskellige steder på hornhinden og endda gentage cauterization i samme område flere gange, hvilket gør det muligt at evaluere virkningen på axonvækst og immuncellemigration.
Disse tre protokoller giver mulighed for at studere de grundlæggende aspekter af aksonal genvækst ved at undersøge de regenerative mekanismer såvel som interaktionerne mellem de forskellige celletyper, der er til stede i hornhinden og innerveringen. Disse metoder giver også et middel til at fremme axonregenerering ved at anvende nye farmakologiske molekyler24 eller genterapi27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Karine Loulier for adgangen til den transgene muselinje MAGIC-Markers. Forfatterne takker også RAM-Neuro dyrekernefaciliteten og billeddannelsesfaciliteten MRI, et medlem af Frankrig-BioImagings nationale infrastruktur støttet af det franske nationale forskningsagentur (ANR-10-INBS-04, "Investeringer for fremtiden"). Denne forskning blev støttet af ATIP-Avenir-programmet, Inserm, Région Occitanie, University of Montpellier, det franske nationale forskningsagentur (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) og Groupama Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
- Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L.
- Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
- Dua, H. S., et al.
- Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A.
- Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
- Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
- Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
- Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
- Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
- Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
- He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
- Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
- Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
- Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
- Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
- Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
- Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
- Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S.
- Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).
