Summary
Her foreslår vi tre forskjellige metoder for å skade de sensoriske fibrene som innerverer hornhinnen. Disse metodene letter studiet av aksonregenerering hos mus. Disse tre metodene, som kan tilpasses andre dyremodeller, er ideelle for studier av hornhindeinnervasjonsfysiologi og regenerering.
Abstract
Hornhinnen er et gjennomsiktig vev som dekker øyet og er avgjørende for klart syn. Det er det mest innerverte vevet i kroppen. Denne innerveringen gir sensasjon og trofisk funksjon til øyet og bidrar til å bevare hornhinnenes integritet. Den patologiske forstyrrelsen av denne innerveringen kalles nevrotrofisk keratitt. Dette kan utløses av skade på øyet, kirurgi eller sykdom. I denne studien foreslår vi tre forskjellige protokoller for å påføre skade på innerveringen på måter som rekapitulerer de tre typer tilfeller som vanligvis oppstår i klinikken.
Den første metoden består i å lage en slitasje av epitelet med en oftalmisk burr. Dette innebærer fjerning av epitellaget, de frie nerveender og subbasal plexus på en måte som ligner på fotorefraktiv keratektomi kirurgi utført i klinikken. Den andre metoden retter seg bare mot innerveringen ved å seksjonere den i periferien med en biopsistans, og opprettholder epitelets integritet. Denne metoden ligner de første trinnene av lamellar keratoplastikk og fører til en degenerasjon av innerveringen etterfulgt av gjenvekst av axonene i den sentrale hornhinnen. Den siste metoden skader innerveringen av en transgen musemodell ved hjelp av et multifotonmikroskop, som spesifikt lokaliserer stedet for cauterization av fluorescerende nervefibre. Denne metoden forårsaker samme skade som fotokeratitt, en overeksponering for UV-lys.
Denne studien beskriver ulike alternativer for å undersøke fysiopatologien til hornhinneinnervering, spesielt degenerasjon og regenerering av aksonene. Fremme regenerering er avgjørende for å unngå slike komplikasjoner som epiteldefekter eller til og med perforering av hornhinnen. De foreslåtte modellene kan bidra til å teste nye farmakologiske molekyler eller genterapi som forbedrer nerveregenerering og begrenser sykdomsprogresjon.
Introduction
Hornhinnen, som er den gjennomsiktige overflaten av øyet, består av tre forskjellige lag: epitelet, stroma og endotelet. Dette organet har den høyeste tettheten av innervering i kroppen og består hovedsakelig av sensoriske fibre (type Aδ og C) som stammer fra den oftalmiske grenen av trigeminal ganglion. Sensoriske fibre trenger inn i periferien av hornhinnen i midten av stroma i form av store bunter som grener ut for å dekke overflaten. De forgrener seg deretter for å gjennombore Bowmanns membran og danne subbasal plexus, som er lett gjenkjennelig ved dannelsen av en virvel i midten av hornhinnen. Disse fibrene avsluttes som frie nerveender på epitelets ytre overflate. De er i stand til å transdusere termiske, mekaniske og kjemiske stimuli og frigjøre trofiske faktorer som er essensielle for epitelhomeostase 1,2. Neurotrofisk keratitt (NK) er en degenerativ sykdom som påvirker hornhinnen sensorisk innervering. Denne sjeldne sykdommen stammer fra en reduksjon eller tap av hornhinnefølsomhet som resulterer i lavere tåreproduksjon og dårlige helbredende egenskaper av hornhinnen3. NK utvikler seg gjennom tre godt beskrevne stadier, fra stadium 1 hvor pasientene lider av epiteldefekter, til stadium 3 hvor stromal smelting og/eller hornhinneperforasjon forekommer4.
Klinisk kan opprinnelsen til denne sykdommen være mangfoldig. Pasienter kan miste hornhinneinnervering etter fysisk skade på øyet, kirurgi eller gjennom kroniske sykdommer, som diabetes 5,6. Hittil er NK-patogeneseprosessen fortsatt dårlig forstått, og terapeutiske muligheter for denne synstruende tilstanden er svært begrenset. Derfor er det nødvendig med en bedre forståelse av egenskapene til epiteldefekter for bedre å forstå mekanismene bak regenerering av disse fibrene og potensielt fremme dem. Her foreslår vi flere modeller av hornhinneskade som induserer NK hos mus.
Den første modellen er slitasje av epitellaget av hornhinnen med en okulær burr. Denne modellen har hovedsakelig blitt studert i sammenheng med regenerering av epitelet i forskjellige dyr, som gnagere og fisk 7,8,9, og for å teste molekyler som fremmer hornhinneheling10,11. Fysiologisk tar det 2-3 dager for epitelcellene å lukke såret. Det fysiologiske mønsteret av innerveringen tar imidlertid mer enn fire uker å komme seg fra slitasje12,13. Under operasjonen fjerner den okulære burren epitellaget av hornhinnen som inneholder subbasal plexus og fibrenes frie nerveender. Denne prosedyren kan klinisk sammenlignes med pasienter med fotorefraktiv keratektomi (PRK) for å korrigere øyebrytningsdefekter. Prosedyren består i å fjerne epitelet i hornhinnen og deretter omforme stroma med en laser14. Pasienter kan oppleve flere bivirkninger etter en slik operasjon, for eksempel en reduksjon av hornhinnenes nervetetthet i 2 år og en reduksjon i følsomhet i en varighet på 3 måneder til ett år etter operasjonen15. Gitt at operasjonen induserer en skjøthet i hornhinnenes mikromiljø, kan denne modellen bidra til å undersøke disse bivirkningene og utvikle terapeutiske tilnærminger som vil fremme raskere reinnervasjon, og dermed redusere de aktuelle bivirkningene.
Den andre modellen består av å seksjonere aksonene i periferien av hornhinnen med et biopsislag, indusere en walleriansk degenerasjon av den sentrale innerveringen 16. Klinisk kan denne metoden sammenlignes med fremre lamellar keratoplastikk, hvor kirurgen innser en delvis trefinering av hornhinnen for å fjerne en del av hornhinnenes fremre tykkelse og erstatte den med en donortransplantasjon 17. Etter lamellar keratoplastikk kan pasienter lide av en rekke symptomer, inkludert tørre øyne, tap av hornhinneinnervering og avstøtning av transplantat18. Denne aksotomimodellen utført på hornhinnendere kan gi innsikt i mekanismene for fiberdegenerasjon, som oppstår etter et transplantat, etterfulgt av axons regenerering.
Den tredje metoden skader hornhinnen med en laser. Ved å bruke et multifotonmikroskop på hornhinnen av bedøvede dyr, induseres degenerasjon av nerver lokalisert i det optiske feltet som et resultat av dannelse av reaktive oksygenarter (ROS), noe som fører til DNA-skade og cellulær kavitasjon19. Denne metoden rekapitulerer hornhinnen fotodamage indusert av overeksponering for naturlig UV (solbrenthet), som også utløser ROS-dannelse, noe som fører til DNA-skade20. Pasienter som lider av solbrenthet i hornhinnen opplever stor smerte, da forverringen av epitelceller frarøver hornhinnenes fibre ekstremiteter av alle.
De tre metodene beskrevet her er utformet for å muliggjøre undersøkelse av NK-patogeneseprosessen og aksonregenerering. De er lett reproduserbare og presise. Videre tillater de rask gjenoppretting og enkel overvåking av dyrene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble godkjent av National Animal Experiment Board.
1. Forberedelser
- Forbered en bedøvelsesløsning av ketamin-xylazin til anestesi. Injiser ketamin ved 80 mg/kg og xylazin med 10 mg/kg ved å fortynne 200 μl ketamin (100 mg/ml) og 125 mikrol xylazin (20 mg/ml) i 2 175 ml steril 0,9 % NaCl.
- Tilbered 0,02 mg/ml buprenorfinoppløsning som smertestillende oppløsning ved å tilsette 100 μL 0,3 mg/ml buprenorfin til 1 400 ml steril 0,9 % NaCl.
- Forbered fluorescerende fargeløsning.
- Bruk en fin skala for å veie 10 mg fluoresceinsalt og fortynn det i 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) for å oppnå en 0,1% fluoresceinløsning.
- Beskytt løsningen mot lyset og rist den i 5 minutter. Bruk en 10 ml sprøyte og et sprøytefilter på 0,2 μm for å filtrere oppløsningen.
MERK: Den fluoriserende oppløsningen må beskyttes mot lys og kan oppbevares ved +4 °C i 5 dager.
- Forberedelse av musen
- Vekt musen og indusere anestesi ved å utføre en intraperitoneal injeksjon av 10 μL/g musevekt (MW) av bedøvelsesmiddeloppløsningen. Når musen slutter å bevege seg, plasser den på en oppvarmet tallerken (37 °C) og kontroller at den er fullstendig bedøvet ved å knipe tærne.
- Påfør en dråpe kunstig tåre på øyet som gjennomgår operasjonen og en dråpe okulær gel på det kontralaterale øyet.
- Når musen ikke reagerer på klemming, injiser analgesien (0,02 mg/ml buprenorfin) med 5 μl/g MW for å gi 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant i nakken.
2. Slitasje av hornhinnen
- Følg trinn 1.3 for å klargjøre den fluorescerende fargeløsningen.
- Følg trinn 1.4 for å klargjøre musen.
- Før du gjør slitasjen, dypp den okulære burren i 70% EtOH og deretter i PBS for å rengjøre den.
- Plasser musen på en oppvarmet tallerken (37 °C) på siden for enkel tilgang til øyet under operasjonen.
- Bruk en bomullspinne for å absorbere den kunstige tåren og børst øyenvippene bort uten å berøre øyet.
- Slå på den okulære burren, åpne musens øyelokk med to fingre, og blokker samtidig vibrasjonene for å unngå at de sitter fast i burren.
- Lokaliser eleven eller midten av øyet og bruk den okulære burren på overflaten av øyet, og gjør sirkulære bevegelser. Ved å se nøye ut, kan overflaten av det fjernede epitelet observeres. Ellers gjør omtrent 20 sirkulære bevegelser på hornhinnen.
- Sett musen tilbake på magen og sjekk om okulargelen fortsatt er tilstede i det kontralaterale øyet.
- Påfør en dråpe fluorescerende fargeløsning på det slipte øyet og vent i 20 s. Absorber dråpen med et vev uten å berøre øyet og skyll det med en dråpe kunstig tåre. Absorber dråpen av kunstig tåre med et vev og belys øyet med den blå koboltlampen.
MERK: Slitasjen må ha en sirkulær form. Det krever litt trening for å få det. - Påfør en dråpe okulær gel på det slipte øyet og la musen våkne opp på den oppvarmede puten. Når musen beveger seg på egen hånd, legg den tilbake i buret.
- Kontroller dyrets velvære i løpet av de følgende 2 dagene.
- Etter bruk av okulær burr, bruk et mykt vev for å fjerne epitelceller som sitter fast i burrens hode og dypp det i 70% EtOH og deretter PBS.
MERK: Når epitelcellene er fjernet med bløtvevet, må du sørge for at ingen biter av vev sitter fast i burrens hode.
3. Aksotomi av hornhinnen nerver
- Følg trinn 1.4 for å klargjøre musen.
- Plasser musen under en kikkertlupe på siden for å få tilgang til øyet som gjennomgår operasjonen. Sett bunnen av en petriskål under musens hode for at øyet skal være horisontalt.
MERK: Følgende trinn vil bli utført ved å se gjennom kikkertlupen. - Fjern den kunstige tåre med en bomullspinne og fjern øyevippene uten å berøre øyet.
- Plasser glatte buede tanger under dyrets øye for å poppe det ut fra bane. Sørg for å lukke tangen nok til at øyet ikke kan gå tilbake i banen når trykket er påført, men ikke for mye for å forhindre optisk nerveskade.
- Påfør biopsistansen på 2,5 mm vertikalt på øyet uten trykk for å sikre total kontakt av stansen med overflaten av hornhinnen.
MERK: Når slaget er påført hornhinnen, kan eksperimentørens hånd forstyrre synsfeltet. - Begynn deretter å bruke trykk og vri slaget flere ganger.
MERK: Avhengig av trykket kan antall vendinger variere, men generelt er det rundt 5. Det krever trening for å føle riktig trykk og bevegelse. Hvis for mye trykk påføres, brister øyet. I dette tilfellet kan væske observeres som går ut av lesjonen og øyet blir mykt. Dyret må ofres. - Fjern biopsistansen. En sirkel må være synlig på hornhinnen der biopsistansen ble påført.
MERK: De neste trinnene krever ikke kikkertlupe. - Sjekk om det kontralaterale øyet fortsatt har okulær gel og påfør noe på det aksotomiserte øyet.
- La musen våkne opp på en oppvarmet pute (37 °C) og sett den tilbake i buret når den beveger seg på egen hånd.
- Kontroller dyrets velvære i løpet av de følgende 2 dagene.
4. Hornhinnen helmontert behandling
- Prøveinnsamling og fiksering.
- Vei musen og indusere anestesi ved å utføre en intraperitoneal injeksjon av 10 μL/g musevekt (MW) av bedøvelsesoppløsningen.
- Når musen slutter å bevege seg og ikke har reflekser ved å klemme, utfør en cervikal dislokasjon.
- Stikk øyet ut av banen med to fingre og enucleate øyet ved å kutte optisk nerve ved hjelp av buet saks.
- Plasser øyet i et 2 ml plastrør som inneholder PBS.
- Fest øyet ved å erstatte PBS med 4% paraformaldehyd og plassere det på en shaker (30 rpm) ved romtemperatur (RT) i 20 minutter.
- Skyll 3 ganger i 10 min med PBS ved RT på en shaker (30 rpm).
- Disseksjon av hornhinnen
- Legg en dråpe PBS på et stykke parafilm inne i en petriskål.
- Plasser øyet i denne dråpen PBS.
- Legg petriskålen under kikkertlupen.
- Dissekere hornhinnen ved hjelp av mikrodisseksjon saks og tang. Skjær over ciliary kroppen for å holde limbus.
- Fjern linsen, ciliary kroppen og iris med fine tang.
- Plasser hornhinnen tilbake i et 2 ml plastrør.
- Protokoll for immunfluorescens
- Inkuber hornhinnen i 2 ml 2,5% fiskeskinngelatin, 5% geitserum og 0,5% vaskemiddel i PBS i 1 time ved RT på en shaker (30 rpm).
- Inkuber hornhinnen i 150 μL av en oppløsning av 2,5 % fiskeskinngelatin, 5 % geiteserum og 0,1 % vaskemiddel i PBS som inneholder det primære antistoffet fortynnet ved 1/1000 (anti βIII tubulinantistoff) over natten ved 4 °C på en shaker (30 rpm).
- Skyll 3 ganger i 1 time med 0,1% vaskemiddel i PBS ved RT på en shaker (30 o / min).
- Inkuber hornhinnen i samme oppløsning som for trinn 4.3.2, som inneholder det sekundære antistoffet fortynnet ved 1/500 over natten ved 4 °C på en shaker (30 rpm).
- Skyll 3 ganger i 1 time med PBS ved RT på en shaker (30 o / min).
- Inkuber hornhinnen i 10 minutter med 150 μL DNA-interkalator fortynnet ved 1/5000 ved RT på en shaker (30 rpm).
- Skyll 2 ganger i 5 min med PBS.
- Montering av hornhinnen
- Plasser hornhinnen på et lysbilde, epitel som vender mot lysbildet, og bruk en skalpell til å lage fire seksjoner uten å nå midten.
MERK: Gjør seksjonene motsatt av hverandre for å danne en blomsterform. - Plasser hornhinnenes endotel mot lysbildet og fjern PBS rundt hornhinnen ved hjelp av et vev.
MERK: Ikke fjern PBS under hornhinnen; Ellers kan det oppstå luftbobler. I så fall legger du PBS til hornhinnen og fjerner luftboblen. Start deretter på nytt fra trinn 4.3.2. - Legg til modelllim på de fire hjørnene av et rektangulært deksel.
MERK: Modellpastaen løfter dekselet da hornhinnen er et tykt vev. - Slipp 50 μL av et monteringsmedium på hornhinnen og legg forsiktig dekselet over for å unngå bobledannelse.
- Forsegl dekselet med neglelakk.
- Plasser hornhinnen på et lysbilde, epitel som vender mot lysbildet, og bruk en skalpell til å lage fire seksjoner uten å nå midten.
- Imaging
- Plasser lysbildet under et epifluorescerende mikroskop.
- Definer størrelsen på mosaikken og dybden på bildet og start oppkjøpet.
- Bruk et deblurring- og deconvolution-program på det oppkjøpte bildet.
MERK: Trinn 4.6.3 er et alternativ valgt på anskaffelsesprogramvaren (Large Volume Computational Clearing [LVCC])
5. Lokalisert laserablasjon av hornhinnenes nerver
- Slå på det stående multifotonmikroskopet og laseren kombinert med en optisk parametrisk oscillator. Aktiver mikroskopets oppvarmede stadium (37 °C) og sett laserne på 850 nm og 1100 nm, tilsvarende de nødvendige bølgelengdene for musemodellen.
- Bruk en strømmåler til å stille inn lasernes effekt samtidig på rundt 20 mW.
- Følg trinn 1.4 for å forberede musen og påfør okulær gel på begge øynene.
MERK: Dyret som brukes til denne protokollen må være fra en transgen muselinje (MAGIC-transgen mus21) som uttrykker en endogen fluorofor i hornhinnenes nervefibre. - Monter dyret i en hodeholder. Snu dyret 90° for at øyet av interesse skal vende mot taket.
- Stropp dyrets vibrasjoner for å fjerne øyet. Spenn fast dyrets kropp for å redusere hodebevegelsen indusert av pusten.
- Plasser et sirkulært deksel på øyet over den okulære gelen. Dekselet må være horisontalt. Ikke nøl med å flytte dyrets hode for at dekselet skal plasseres riktig.
- Legg en dråpe PBS over dekselet. Plasser dyret på mikroskoptrinnet nøye og sett objektivtårnet i riktig avstand.
- Bruk det vandige 20x objektivet og epifluorescensen for å lokalisere øyet og innerveringen gjennom okularet.
- Aktiver laserne og definer dybden som må belyses.
- Skaff deg et bilde på 1024 x 1024 (piksler) med en anskaffelseshastighet på 70%-85% av maksimal skannehastighet.
- Når bildet er anskaffet, ta dyret av mikroskopet og fjern dekselet og stroppene. Fjern dyret fra hodeholderen, tilsett mer okulær gel om nødvendig, og la det våkne opp i et bur på en oppvarmet plate.
MERK: Ødeleggelse av innerveringen kan observeres 1 uke etter avbildningen. Denne protokollen kan gjentas en gang i uken i flere uker for å øke skaden forårsaket av laserne. - Når dyret beveger seg på egen hånd, sett buret tilbake i stallen og kontroller trivsel i de følgende 2 dagene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien foreslår flere protokoller for å forårsake skade på hornhinneinnervasjon hos mus. Mens lignende protokoller har blitt brukt til å undersøke fysiopatologien til helbredelsen av epitelet, valgte vi å tilpasse og utvikle nye metoder for å undersøke hornhinneinnervasjonsregenerering. For å observere innerveringen brukte vi to teknikker. Først benyttet vi en immunfluorescensteknikk for å flekke nervefibrene ved hjelp av et pannevronalt antistoff (BIII tubulin) og kjernene med en interkalator. For det andre utnyttet vi en transgen musestamme som uttrykker fluorescerende proteiner i nervefibrene. Hornhinnene ble avbildet ved hjelp av et epifluorescerende mikroskop.
Den første metoden brukte en oftalmisk burr med en rustringfjerner på 0,5 mm for å fjerne hornhinneepitellaget (figur 1A). Denne studien fokuserer på skaden forårsaket av innerveringen som ligger inne i epitelet som et middel til å forstå de cellulære og molekylære komponentene som er involvert i regenereringen. Før operasjonen var basalepitelet intakt. Nervefibrene i subbasal plexus dannet et typisk mønster kalt virvelen (figur 1B). Spissen av burren som ble brukt i denne teknikken fjernet bare det første laget av hornhinnen, men bevarte både stroma, hvor store bunter av fibre er lokalisert, og endotelet. Den delen av epitelet som ble fjernet av burren, var lett synlig, da det var tydelig ruptur av basalepitelet og plexus subbasus (figur 1B). Kjernene til keratocyttene kan lett identifiseres da de er sparsomt arrangert gjennom hele stroma. Når det gjelder innerveringen, var grensen også klar, med et brudd på subbasal plexus slik at de store buntene av fibre inne i stroma kunne ses. Mens det tar rundt 3 dager for epitelet å helbrede, tar regenerering av innerveringen mer enn 4 uker etter en slitasje. Figur 1 illustrerer regenerering av epitelet 1 uke etter operasjonen, der basalepitelet er glatt. Imidlertid er virvelen fraværende fra midten av hornhinnen, gitt at innerveringen ennå ikke har kommet tilbake til det punktet.
Den andre metoden består i å snitte nervene i periferien av hornhinnen med en biopsistans på 2,5 mm diameter i stedet for å børste dem bort med burren (figur 2A). Denne metoden forstyrrer ikke epitelet så mye som slitasje. Etter operasjonen kan man observere en tynn perifer ring der biopsistansen ble påført, noe som skadet basalepitelet (figur 2B). Imidlertid har nervene i periferien blitt seksjonert, noe som utløser den walleriske degenerasjonen av aksonene. Denne typen degenerasjon består av forfall av nerver fra den terminale enden av nevronene mot cellekroppen og i dette tilfellet mot delen indusert av biopsistansen. Avhengig av dybden av axotomi, kan skaden være alvorlig. Her ser vi at det har skjedd en kraftig degenerasjon som har ført til totalt tap av innervering midt på hornhinnen i epitelet (figur 2B). Siden innervering er avgjørende for opprettholdelse av epitelhomeostase, initieres en oppløsning av epitellaget og skaper et sår (figur 2B). Sårdannelse skjedde bare i sterkt skadede hornhinner.
Den siste teknikken består i å brenne hornhinnen in vivo hos bedøvede transgene mus med et multifotonmikroskop (figur 3A). Det første bildet er anskaffet på stedet der brenningen vil bli gjort. Denne studien brukte en transgen mus hvis innervering uttrykker fluorescerende proteiner. Bildet ble tatt i midten av hornhinnen, hvor virvelen befinner seg (figur 3B), fra toppen av epitelet til midtstroma. Virvelen er ikke lenger synlig 1 uke etter første bildeopptak. I stedet har en gruppe immunceller migrert til belysningsstedet, hvor vi kan identifisere bunten av fibre i stroma, som har tynnet etter den første innsamlingen (figur 3B).
Figur 1: Okulær burr og eksempel på hornhinneinnervasjon etter slitasje. (A) En oftalmologisk burr med en rustringfjerner på 0,5 mm ble brukt til å lage slitasjen. (B) Eksempler på dissekerte og immunfargede hornhinner. Pre-slitasjebilder illustrerer det glatte basalepitelet og virvelen (hvit pilspiss) i midten. Bilder etter slitasje viser en klar avgrensning av plexus subbasus, som ble fjernet (røde pilspisser). Bilder tatt 1 uke etter slitasje (1WPAbr) viser hvor fibrene regenererer (oransje pilspiss). Innerveringen er farget med anti-BIII tubulin antistoff (grønn). Kjernene er farget med en DNA-interkalator (lilla). Bildene ble tatt med et epifluorescerende mikroskop. Skala barer = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Biopsistans og eksempel påhornhinneinnervasjon etter aksotomi. (A) En steril biopsi stans på 2,5 mm diameter påføres øyet for å indusere en aksotomi. (B) Eksempler på dissekerte og immunfargede hornhinner. Pre-aksotomi bilder illustrerer tilstedeværelsen av virvelen i midten av hornhinnen (hvit pilspiss). Post-aksotomi bilder viser ringen (røde pilspisser) skapt av slag i epitelet. Bilder tatt 2 uker etter aksotomi (2WPAx) illustrerer dannelsen av såret (oransje pilspiss). Innerveringen er farget med BIII tubulin (grønn). Kjernene er farget med en interkalator (lilla). Bildene ble tatt med et epifluorescerende mikroskop. Skala barer = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppsett for hornhinnenervekauterisering med lasere og et eksempel (A) Den bedøvede MAGIC-transgene musen21 vedlikeholdes av hodeholderen, og øyet vender mot 20x-målet til bifotonet. Musens kropp er festet for å unngå pustebevegelse under oppkjøpet. (B) Tredimensjonalt (3D) bilde av den første innsamlingen av virvelen ved bruk av bølgelengdene 850 nm og 1100 nm samtidig før fotoskaden og 1 uke etter fotoskade (1WPPhDa) på samme sted av virvelen. Laserne induserte migrasjon av immunceller (pilspiss) der virvelen bruker å være lokalisert. Skala barer = 80 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Teknikk | Påvirket struktur | Grad av påvirkning (+/-) | Type studie | Helbredende periode |
| Slitasje | Epitel | ++ | Epitel og innervering regenerering | Epitel <1 uke Innervasjon >2 måneder |
| Innervering | ++ | |||
| Aksotomi | Epitel | +/- | Innervasjon regenerering Neurotrofisk keratitt | Innervasjon >2 måneder NK >2 uker |
| Stroma | +/- | |||
| Innervering | ++ | |||
| Nerve cauterization | Epitel | + (lokalt) | Lokal innerveringsregenerering Nevrotrofisk keratitt | Avhengig av hyppigheten av cauterization |
| Stroma | ||||
| Innervering |
Tabell 1: Sammenligning av de tre foreslåtte strategiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurotrofisk keratitt regnes som en sjelden sykdom, som påvirker 5 av 10.000 individer. Imidlertid er personer som lider av NK på grunn av fysisk skade som kjemiske forbrenninger, eller syndromer som diabetes eller multippel sklerose ikke inkludert i denne statistikken3. Videre er denne tilstanden fortsatt betydelig underdiagnostisert22, og forekomsten av sykdommen er underestimert. Det er et sterkt behov for nye behandlinger og terapi som vil fremme aksonregenerering som et middel til å bevare pasientens syn. For tiden er den eneste tilgjengelige behandlingen som tilbys pasienter som lider av de tidlige stadiene av NK, anvendelsen av farmakologiske øyedråper 23,24,25 som støtter hornhinnenerveregenerering. Disse er imidlertid effektive bare til et visst punkt. I tilfeller av mer alvorlig endring av hornhinnen, som sår, fostermembrantransplantasjon eller keratoplastikk, tilbyr 3,4 en midlertidig løsning for å lukke såret og unngå infeksjon. Disse transplantatene må imidlertid skiftes ut etter en begrenset tid, og risikoen for avstøtning øker ved hver tilleggsprosedyre.
Denne rapporten presenterer flere modeller som rekapitulerer ulike former for NK som man ofte møter i klinikken (tab 1). Disse kan brukes til å utdype vår kunnskap om hornhinneinnervasjon og for å undersøke alternativer til dagens behandlinger. Slitasjemodellen kan være assosiert med PRK-kirurgi, gitt at den rekapitulerer den langsomme gjenveksten av innerveringen, som oppstår etter helbredelsen av det slipte epitelet. Til sin fordel kan denne teknikken læres og reproduseres relativt enkelt når riktig trykk med oftalmisk burr påføres, og et vanlig slipt område opprettes. Videre kan denne teknikken tilpasses hver pasients spesifikke behov eller for å passe brukerens interesse ved å velge størrelsen på det slipte området.
Aksotomien ligner den lamellære keratoplastikken som gjennomgås av pasienter som lider av sent stadium NK26. Det muliggjør undersøkelse av degenerasjonen av fibrene (Wallerian degenerasjon) og rekolonisering av aksonene i den sentrale hornhinnen. Mens materialet som kreves for å utføre operasjonen er relativt enkelt, må utøveren trenes i riktig teknikk, spesielt riktig påføring av trykk og riktig antall svinger med biopsistansen. I sammenheng med en keratoplastikk bestemmes dybden av snittet nøyaktig ved bruk av en trefinanordning og intraoperativ optisk koherenstomografi, hvilke teknikker som ikke kan tilpasses murine modeller17. En annen ulikhet med keratoplastikk er fraværet av donortransplantasjon i teknikken beskrevet her, da vi bare utførte snittet av hornhinnen. Denne modellen er av interesse på grunn av tilstedeværelsen av et sunt epitel der innerveringen må vokse tilbake. Dette skiller det fra slitasjemodellen, hvor epitelet fjernes med innerveringen.
Nervecauterization-teknikken, ved hjelp av et multifotonmikroskop, etterligner skaden forårsaket av solbrenthet, men gjør det på et lokalisert område av hornhinnen, og utløser dermed DNA-skade og ROS-dannelse19,20. Med denne metoden er det mulig å studere regenerering av fibrene fra forskjellige steder på hornhinnen og til og med å gjenta cauterization i samme område flere ganger, slik at virkningen på aksonvekst og immuncellemigrasjon kan evalueres.
Disse tre protokollene gir mulighet til å studere de grunnleggende aspektene ved aksonal gjenvekst ved å undersøke regenerative mekanismer, samt samspillet mellom de forskjellige celletyper som er tilstede i hornhinnen og innerveringen. Disse metodene tilbyr også et middel til å fremme aksonregenerering ved å anvende nye farmakologiske molekyler24 eller genterapi27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Karine Loulier for tilgangen til den transgene muselinjen MAGIC-. Forfatterne takker også RAM-Neuro dyrekjernefasiliteten og bildebehandlingsanlegget MR, medlem av Frankrike-BioImaging nasjonal infrastruktur støttet av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-10-INBS-04, "Investeringer for fremtiden"). Denne forskningen ble støttet av ATIP-Avenir-programmet, Inserm, Région Occitanie, Universitetet i Montpellier, det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) og Groupama Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
- Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L.
- Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
- Dua, H. S., et al.
- Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A.
- Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
- Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
- Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
- Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
- Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
- Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
- He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
- Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
- Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
- Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
- Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
- Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
- Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
- Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S.
- Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).
