Summary
Здесь мы предлагаем три различных метода повреждения сенсорных волокон, иннервирующих роговицу. Эти методы облегчают изучение регенерации аксонов у мышей. Эти три метода, которые могут быть адаптированы к другим животным моделям, идеально подходят для изучения физиологии и регенерации иннервации роговицы.
Abstract
Роговица представляет собой прозрачную ткань, которая покрывает глаз и имеет решающее значение для четкого зрения. Это самая иннервируемая ткань в организме. Эта иннервация обеспечивает чувствительность и трофическую функцию глаза и способствует сохранению целостности роговицы. Патологическое нарушение этой иннервации называется нейротрофическим кератитом. Это может быть вызвано травмой глаза, хирургическим вмешательством или заболеванием. В этом исследовании мы предлагаем три различных протокола для нанесения повреждений иннервации способами, которые повторяют три типа случаев, обычно встречающихся в клинике.
Первый способ заключается в том, чтобы сделать шлифовку эпителия глазным бором. Это включает в себя удаление эпителиального слоя, свободных нервных окончаний и суббазального сплетения способом, аналогичным операции фоторефракционной кератэктомии, выполняемой в клинике. Второй метод нацелен только на иннервацию, разделяя ее по периферии с помощью биопсийного пуансона, сохраняя целостность эпителия. Этот метод аналогичен первым этапам поклеточной кератопластики и приводит к дегенерации иннервации с последующим отрастанием аксонов в центральной части роговицы. Последний метод повреждает иннервацию трансгенной мышиной модели с помощью многофотонного микроскопа, который специфически локализует место прижигания флуоресцентных нервных волокон. Этот метод наносит тот же вред, что и фотокератит, чрезмерное воздействие ультрафиолета.
В данном исследовании описаны различные варианты изучения физиопатологии иннервации роговицы, в частности, дегенерации и регенерации аксонов. Стимуляция регенерации имеет решающее значение для предотвращения таких осложнений, как дефекты эпителия или даже перфорация роговицы. Предложенные модели могут помочь в тестировании новых фармакологических молекул или генной терапии, которые усиливают регенерацию нервов и ограничивают прогрессирование заболевания.
Introduction
Роговица, которая представляет собой прозрачную поверхность глаза, состоит из трех отдельных слоев: эпителия, стромы и эндотелия. Этот орган имеет самую высокую плотность иннервации в организме и состоит в основном из сенсорных волокон (типов Аδ и С), берущих начало от глазной ветви тройничного ганглия. Сенсорные волокна проникают на периферию роговицы в середине стромы в виде больших пучков, которые разветвляются, покрывая поверхность. Затем они раздваиваются, чтобы пронзить мембрану Боумана и сформировать суббазальное сплетение, которое легко распознать по образованию вихря в центре роговицы. Эти волокна оканчиваются свободными нервными окончаниями на наружной поверхности эпителия. Они способны преобразовывать тепловые, механические и химические раздражители и высвобождать трофические факторы, необходимые для гомеостаза эпителия 1,2. Нейротрофический кератит (НК) – это дегенеративное заболевание, поражающее сенсорную иннервацию роговицы. Это редкое заболевание возникает из-за снижения или потери чувствительности роговицы, что приводит к снижению слезообразования и плохим заживляющим свойствам роговицы3. НК прогрессирует через три хорошо описанные стадии: от стадии 1, когда пациенты страдают от дефектов эпителия, до стадии 3, когда происходит расплавление стромы и/или перфорация роговицы4.
Клинически происхождение этого заболевания может быть разнообразным. Пациенты могут потерять иннервацию роговицы после физической травмы глаза, хирургического вмешательства или из-за хронических заболеваний, таких как диабет 5,6. На сегодняшний день процесс патогенеза НК остается малоизученным, а терапевтические возможности для этого угрожающего зрению состояния очень ограничены. Таким образом, необходимо лучшее понимание характеристик дефектов эпителия, чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе регенерации этих волокон и потенциально способствовать их развитию. В данной работе мы предлагаем несколько моделей повреждения роговицы, которые индуцируют НК у мышей.
Первая модель – истирание эпителиального слоя роговицы глазным бором. Эта модель в основном изучалась в контексте регенерации эпителия у различных животных, таких как грызуны и рыбы 7,8,9, а также для тестирования молекул, способствующих заживлению роговицы10,11. Физиологически эпителиальным клеткам требуется 2-3 дня, чтобы закрыть рану. Физиологическая картина иннервации, однако, требует более четырех недель, чтобы восстановиться после истирания12,13. Во время операции глазной бор удаляет эпителиальный слой роговицы, который содержит суббазальное сплетение и свободные нервные окончания волокон. Эту процедуру клинически можно сравнить с процедурой пациентов с фоторефракционной кератэктомией (ФРК) для коррекции дефектов рефракции глаза. Процедура заключается в удалении эпителия роговицы с последующим изменением формы стромы с помощью лазера14. Пациенты могут испытывать несколько побочных эффектов после такой операции, таких как снижение плотности роговичных нервов в течение 2 лет и снижение чувствительности в течение периода от 3 месяцев до одного годапосле операции. Учитывая, что операция вызывает хрупкость микроокружения роговицы, эта модель может помочь исследовать эти побочные эффекты и разработать терапевтические подходы, которые будут способствовать более быстрой реиннервации, тем самым уменьшая рассматриваемые побочные эффекты.
Вторая модель состоит в секционировании аксонов на периферии роговицы с помощью биопсийного пуансона, индуцируя валлерову дегенерацию центральной иннервации 16. Клинически этот метод можно сравнить с передней послойной кератопластикой, при которой хирург осуществляет частичную трепанацию роговицы для удаления части передней толщины роговицы и замены ее донорским трансплантатом 17. После послойной кератопластики пациенты могут страдать от ряда симптомов, включая сухость глаз, потерю иннервации роговицы и отторжение трансплантата18. Эта модель аксотомии, выполненная на нервах роговицы, может дать представление о механизмах дегенерации волокон, которая происходит после трансплантата с последующей регенерацией аксонов.
Третий метод повреждает нервы роговицы лазером. При использовании многофотонного микроскопа на роговице животных, находящихся под наркозом, индуцируется дегенерация нервов, локализованных в оптическом поле, в результате образования активных форм кислорода (АФК), что приводит к повреждению ДНК и клеточной кавитации19. Этот метод повторяет фотоповреждение роговицы, вызванное чрезмерным воздействием естественного ультрафиолета (солнечный ожог), которое также вызывает образование АФК, что приводит к повреждению ДНК20. Пациенты, страдающие солнечными ожогами роговицы, испытывают сильную боль, так как разрушение эпителиальных клеток лишает конечности роговичных волокон.
Три метода, описанные здесь, предназначены для исследования процесса патогенеза НК и регенерации аксонов. Они легко воспроизводимы и точны. Кроме того, они позволяют быстро восстанавливаться и легко следить за животными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были одобрены Национальным советом по экспериментам на животных.
1. Подготовка
- Приготовьте обезболивающий раствор кетамина-ксилазина для анестезии. Вводят кетамин в дозе 80 мг/кг и ксилазин в дозе 10 мг/кг, разбавляя 200 мкл кетамина (100 мг/мл) и 125 мкл ксилазина (20 мг/мл) в 2,175 мл стерильного 0,9% NaCl.
- Приготовьте 0,02 мг/мл раствора бупренорфина в качестве обезболивающего раствора, добавив 100 мкл 0,3 мг/мл бупренорфина к 1400 мл стерильного 0,9% NaCl.
- Приготовьте флуоресцентный раствор для окрашивания.
- С помощью тонких весов взвесьте 10 мг флуоресцеиновой соли и разведите ее в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) для получения 0,1% раствора флуоресцеина.
- Берегите раствор от света и встряхивайте его в течение 5 мин. Для фильтрации раствора используйте шприц объемом 10 мл и шприцевой фильтр 0,2 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный раствор должен быть защищен от света и может храниться при температуре +4 °C в течение 5 дней.
- Подготовка мышки
- Взвесьте мышь и индуцируйте анестезию, выполнив внутрибрюшинную инъекцию 10 мкл/г мышиного веса (MW) раствора анестетика. Когда мышь перестанет двигаться, положите ее на нагретую пластину (37 °C) и убедитесь, что она полностью обезболина, зажав пальцы ног.
- Нанесите каплю искусственной слезы на прооперируемый глаз и каплю глазного геля на контралатеральный глаз.
- Как только мышь перестанет реагировать на пощипывание, введите обезболивающий препарат (0,02 мг/мл бупренорфина) в дозе 5 мкл/г MW, чтобы обеспечить 0,1 мг/кг бупренорфина подкожно в область шеи.
2. Истирание роговицы
- Выполните шаг 1.3, чтобы приготовить раствор для флуоресцентного окрашивания.
- Выполните шаг 1.4, чтобы подготовить мышь.
- Перед шлифовкой окуните глазной заусенец в 70% EtOH, а затем в PBS, чтобы очистить его.
- Поместите мышь на нагретую пластину (37 °C) сбоку, чтобы легко получить доступ к глазу, подвергающемуся операции.
- Используйте ватный тампон, чтобы впитать искусственную слезу, и смахните ресницы, не касаясь глаза.
- Включите глазной бор, откройте веко мыши двумя пальцами и одновременно заблокируйте вибриссы, чтобы они не застряли в заусенце.
- Локализовать зрачок или центр глаза и наложить глазной заусенец на поверхность глаза, а также делать круговые движения. Присмотревшись, можно наблюдать поверхность удаленного эпителия. В противном случае сделайте примерно 20 круговых движений по роговице.
- Положите мышь обратно на живот и проверьте, присутствует ли глазной гель в контралатеральном глазу.
- Нанесите каплю флуоресцентного красящего раствора на стертый глаз и подождите 20 с. Впитайте каплю салфеткой, не касаясь глаза, и промойте ее каплей искусственной слезы. Впитайте каплю искусственной слезы салфеткой и осветите глаз синей кобальтовой лампой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Истирание должно иметь круглую форму. Для его получения требуется определенная подготовка. - Нанесите каплю окулярного геля на стертый глаз и дайте мышке проснуться на грелке. Когда мышь начнет двигаться самостоятельно, поместите ее обратно в клетку.
- Проверяйте самочувствие животного в течение следующих 2 дней.
- После использования глазного бора используйте мягкую ткань для удаления эпителиальных клеток, застрявших в головке бора, и окуните его в 70% EtOH, а затем PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления эпителиальных клеток вместе с мягкими тканями убедитесь, что в головке заусенца не застряли кусочки ткани.
3. Аксотомия нервов роговицы
- Выполните шаг 1.4, чтобы подготовить мышь.
- Поместите мышь под бинокулярную лупу сбоку, чтобы получить доступ к глазу, подвергающемуся операции. Подложите дно чашки Петри под голову мыши, чтобы глаз был горизонтальным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги будут выполнены, глядя в бинокулярную лупу. - Удалите искусственную слезу ватным тампоном и удалите ресницы, не касаясь глаза.
- Поместите гладкие изогнутые плоскогубцы под глаз животного, чтобы вытащить его из орбиты. Убедитесь, что плоскогубцы закрыты настолько, чтобы глаз не смог вернуться в орбиту после оказания давления, но не чрезмерно, чтобы предотвратить повреждение зрительного нерва.
- Приложите биопсийный пуансон диаметром 2,5 мм вертикально к глазу без давления, чтобы обеспечить полный контакт пуанса с поверхностью роговицы.
Примечание: После того, как удар прикладывается к роговице, рука экспериментатора может мешать полю зрения. - Затем начните надавливать и несколько раз покрутите пуансон.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от давления количество скручиваний может варьироваться, но обычно оно составляет около 5. Это требует тренировки, чтобы чувствовать правильное давление и движение. При слишком сильном давлении глаз разрывается. В этом случае можно наблюдать, как жидкость выходит из очага поражения, и глаз размягчается. Животное должно быть принесено в жертву. - Извлеките биопсийный пуансон. На роговице, куда был наложен биопсийный пуансон, должен быть виден круг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги не требуют бинокулярной лупы. - Проверьте, есть ли в контралатеральном глазу глазной гель, и нанесите его на аксотомизированный глаз.
- Дайте мыши проснуться на грелке (37 °C) и положите ее обратно в клетку, когда она начнет двигаться самостоятельно.
- Проверяйте самочувствие животного в течение следующих 2 дней.
4. Обработка роговицы целиком
- Отбор и фиксация проб.
- Взвесьте мышь и индуцируйте анестезию, выполнив внутрибрюшинную инъекцию 10 мкл/г мышиного веса (MW) раствора анестетика.
- Когда мышь перестает двигаться и у нее отсутствуют рефлексы при защемлении пальцев ног, выполняют вывих шейного отдела.
- Вытолкните глаз из орбиты двумя пальцами и сделайте энуклеацию глаза, перерезав зрительный нерв изогнутыми ножницами.
- Поместите глаз в пластиковую пробирку объемом 2 мл, содержащую PBS.
- Зафиксируйте глаз, заменив PBS 4% параформальдегидом и поместив его на шейкер (30 об/мин) при комнатной температуре (RT) на 20 минут.
- Промыть 3 раза в течение 10 мин PBS при RT на шейкере (30 об/мин).
- Рассечение роговицы
- Поместите каплю PBS на кусочек парапленки внутри чашки Петри.
- Поместите глаз в эту каплю PBS.
- Поместите чашку Петри под бинокулярную лупу.
- Рассеките роговицу с помощью ножниц для микродиссекции и щипцов. Надрезают над цилиарным телом, чтобы сохранить лимб.
- Удалите хрусталик, цилиарное тело и радужную оболочку тонкими щипцами.
- Поместите роговицу обратно в пластиковую пробирку объемом 2 мл.
- Протокол иммунофлюоресценции
- Инкубируют роговицу в 2 мл 2,5% желатина рыбьей кожи, 5% козьей сыворотки и 0,5% моющего средства в ПБС в течение 1 ч при РТ на шейкере (30 об/мин).
- Инкубируют роговицу в 150 мкл раствора 2,5% желатина рыбьей кожи, 5% козьей сыворотки и 0,1% детергента в PBS, содержащем первичное антитело, разведенное в дозе 1/1000 (антитела к тубулину βIII) в течение ночи при 4 °C на шейкере (30 об/мин).
- Промыть 3 раза в течение 1 ч 0,1% моющим средством в ПБС при РТ на шейкере (30 об/мин).
- Инкубируют роговицу в том же растворе, что и для этапа 4.3.2, содержащем вторичные антитела, разведенные в дозе 1/500 в течение ночи при 4 °C на шейкере (30 об/мин).
- Промыть 3 раза в течение 1 ч ПБС при РТ на шейкере (30 об/мин).
- Инкубируют роговицу в течение 10 мин со 150 мкл ДНК-интеркалятора, разведенного в дозе 1/5000 при RT на шейкере (30 об/мин).
- Промыть 2 раза в течение 5 минут PBS.
- Монтаж роговицы
- Поместите роговицу на предметное стекло эпителием к предметному стеклу и с помощью скальпеля создайте четыре секции, не доходя до центра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте секции напротив друг друга, чтобы сформировать форму цветка. - Поместите эндотелий роговицы лицом к предметному стеклу и удалите PBS вокруг роговицы с помощью салфетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не удаляйте PBS под роговицу; В противном случае могут появиться пузырьки воздуха. Если это так, добавьте PBS в роговицу и удалите пузырь воздуха. Затем перезапустите с шага 4.3.2. - Добавьте модельную пасту по четырем углам прямоугольного обложки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модельная паста приподнимает покровное стекло, так как роговица представляет собой толстую ткань. - Капните 50 мкл монтажной среды на роговицу и аккуратно положите покровный слой сверху, чтобы избежать образования пузырьков.
- Запечатайте покровное стекло лаком для ногтей.
- Поместите роговицу на предметное стекло эпителием к предметному стеклу и с помощью скальпеля создайте четыре секции, не доходя до центра.
- Отображение
- Поместите предметное стекло под эпифлуоресцентный микроскоп.
- Определите размер мозаики и глубину изображения и начните съемку.
- Примените программу удаления размытия и деконволюции к полученному изображению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 4.6.3 - это опция, выбранная в программном обеспечении для сбора данных (Large Volume Computational Clearing [LVCC])
5. Локализованная лазерная абляция нервов роговицы
- Включите вертикальный многофотонный микроскоп и лазер в сочетании с оптическим параметрическим генератором. Активируйте нагретый столик микроскопа (37 °C) и установите лазеры на 850 нм и 1100 нм, что соответствует требуемым длинам волн для модели мыши.
- Используйте измеритель мощности, чтобы установить мощность лазеров одновременно на уровне около 20 мВт.
- Выполните шаг 1.4, чтобы подготовить мышь и нанести глазной гель на оба глаза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животное, используемое для этого протокола, должно быть из трансгенной мышиной линии (трансгенная мышь MAGIC-Marker21), которая экспрессирует эндогенный флуорофор в нервных волокнах роговицы. - Установите животное в держатель для головы. Поверните животное на 90°, чтобы интересующий глаз был обращен к потолку.
- Наложите вибриссы животного, чтобы очистить область вокруг глаз. Пристегните тело животного ремнями, чтобы уменьшить движение головы, вызванное дыханием.
- Наложите круговой покровный пластырь на глаз поверх окулярного геля. Покровное покрытие должно быть горизонтальным. Не стесняйтесь двигать головой животного, чтобы покровное стекло было правильно расположено.
- Добавьте каплю PBS поверх обложки. Осторожно поместите животное на столик микроскопа и установите револьверную головку объектива на нужном расстоянии.
- Используйте 20-кратный водный объектив и эпифлуоресценцию для локализации глаза и иннервации через окуляр.
- Активируйте лазеры и определите глубину, которую необходимо осветить.
- Получение изображения с разрешением 1024 x 1024 (пикселей) со скоростью получения 70–85% от максимальной скорости сканирования.
- Как только изображение будет получено, снимите животное с микроскопа и снимите покровное стекло и ремни. Извлеките животное из держателя для головы, при необходимости добавьте еще глазного геля и дайте ему проснуться в клетке на нагретой тарелке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрушение иннервации можно наблюдать через 1 неделю после визуализации. Этот протокол можно повторять один раз в неделю в течение нескольких недель, чтобы увеличить ущерб, наносимый лазерами. - Когда животное переедет самостоятельно, поставьте клетку обратно в конюшню и проверяйте ее самочувствие в течение следующих 2 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании предлагается несколько протоколов для нанесения повреждений иннервации роговицы у мышей. Несмотря на то, что подобные протоколы использовались для изучения физиопатологии заживления эпителия, мы решили адаптировать и разработать новые методы исследования регенерации иннервации роговицы. Для наблюдения за иннервацией мы использовали две методики. Во-первых, мы использовали иммунофлюоресцентную технику для окрашивания нервных волокон с помощью паннейронального антитела (BIII tubulin) и ядер с помощью интеркалятора. Во-вторых, мы воспользовались трансгенным штаммом мышей, экспрессирующим флуоресцентные белки в нервных волокнах. Роговицы визуализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
В первом методе для удаления эпителиального слоя роговицы использовали офтальмологический бор с ремувером для удаления ржавчинного кольца 0,5 мм (рис. 1А). Это исследование фокусируется на повреждении, наносимом иннервации, расположенной внутри эпителия, как средстве понимания клеточных и молекулярных компонентов, участвующих в его регенерации. До операции базальный эпителий был интактным. Нервные волокна в суббазальном сплетении образуют типичный паттерн, называемый вихрем (рис. 1Б). Кончик бора, используемый в этой технике, удалял только первый слой роговицы, но сохранял как строму, где расположены большие пучки волокон, так и эндотелий. Часть эпителия, удаленная заусенцем, была хорошо видна, так как был явный разрыв базального эпителия и суббазального сплетения (рис. 1Б). Ядра кератоцитов могут быть легко идентифицированы, так как они разбросаны по всей строме. Что касается иннервации, граница также была четкой, с разрывом суббазального сплетения, что позволило увидеть большие пучки волокон внутри стромы. В то время как для заживления эпителия требуется около 3 дней, регенерация иннервации занимает более 4 недель после ссадины. На рисунке 1 показана регенерация эпителия через 1 неделю после операции, при которой базальный эпителий гладкий. Однако вихрь отсутствует в центре роговицы, учитывая, что иннервация еще не вернулась в эту точку.
Второй метод заключается в разрезании нервов на периферии роговицы с помощью биопсийного пуансона диаметром 2,5 мм вместо того, чтобы смахивать их с помощью заусенца (рис. 2А). Этот метод не нарушает эпителий так сильно, как истирание. После операции в месте наложения биопсийного пуансона можно наблюдать тонкое периферическое кольцо, повреждающее базальный эпителий (рис. 2B). Тем не менее, нервы на периферии были разделены, что вызвало валлеровскую дегенерацию аксонов. Этот тип дегенерации заключается в распаде нервов от терминального окончания нейронов к телу клетки и, в данном случае, к участку, индуцированному биопсийным пуансоном. В зависимости от глубины аксотомии повреждение может быть серьезным. Здесь мы видим, что произошла сильная дегенерация, приводящая к полной потере иннервации в центре роговицы в эпителии (рис. 2Б). Поскольку иннервация необходима для поддержания гомеостаза эпителия, начинается распад эпителиального слоя, в результате чего образуется язва (рис. 2B). Образование язв происходило только в сильно поврежденных роговицах.
Последний метод заключается в локальном прижигании in vivo нервов роговицы трансгенных мышей, находящихся под наркозом, с помощью многофотонного микроскопа (рис. 3А). Первое изображение получено в том месте, где будет производиться запись. В этом исследовании использовалась трансгенная мышь, иннервация которой экспрессирует флуоресцентные белки. Изображение было получено в центре роговицы, где расположен вихрь (рис. 3Б), от верхушки эпителия до середины стромы. Вихрь перестает быть видимым через 1 неделю после получения первого изображения. Вместо этого группа иммунных клеток мигрировала в место освещения, где мы можем идентифицировать пучок волокон в строме, которые истончились после первого захвата (рис. 3B).
Рисунок 1: Глазной заусенец и пример иннервации роговицы после истирания. (A) Для абразивного удаления кольца ржавчины использовали офтальмологическую жернову с удалением кольца ржавчины 0,5 мм. (B) Примеры рассеченных и иммуноокрашенных роговиц. На изображениях, полученных до истирания, виден гладкий базальный эпителий и вихрь (белый наконечник стрелы) в центре. На постабразивных снимках видно четкое разграничение суббазального сплетения, которое было удалено (красные стрелки). Изображения, полученные через 1 неделю после абразивки (1WPAbr), показывают, где волокна регенерируют (оранжевая стрелка). Иннервация окрашивается антителами к тубулину BIII (зеленого цвета). Ядра окрашены ДНК-интеркалятором (фиолетового цвета). Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Масштабные линейки = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Биопсийный пуансон и пример иннервации роговицы после аксотомии. (A) Стерильный биопсийный пуансон диаметром 2,5 мм прикладывают к глазу для индуцирования аксотомии. (B) Примеры рассеченных и иммуноокрашенных роговиц. Изображения, полученные до аксотомии, иллюстрируют наличие вихря в центре роговицы (белая стрелка). На снимках после аксотомии видно кольцо (красные наконечники стрел), образованное пуансоном в эпителии. Изображения, полученные через 2 недели после аксотомии (2WPAx), иллюстрируют образование язвы (оранжевый наконечник стрелы). Иннервацию окрашивают БИИИИ тубулином (зеленый). Ядра окрашены интеркалятором (фиолетового цвета). Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Масштабные линейки = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Установка для прижигания нервов роговицы лазерами и пример (A) Трансгенная мышь21 с анестезией MAGIC-Marker поддерживается держателем головы, а ее глаз обращен к 20-кратной цели бифотона. Корпус мыши привязан ремнями, чтобы избежать дыхательных движений во время съемки. (B) Трехмерное (3D) изображение первого захвата вихря с использованием длин волн 850 нм и 1100 нм одновременно до фотоповреждения и через 1 неделю после фотоповреждения (1WPPhDa) в одном и том же месте вихря. Лазеры индуцировали миграцию иммунных клеток (наконечник стрелы) там, где раньше находился вихрь. Масштабные линейки = 80 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Техника | Подверженная ударам конструкция | Степень воздействия (+/-) | Тип обучения | Период заживления |
| Ссадина | Эпителий | ++ | Регенерация эпителия и иннервации | Эпителий <1 неделя Иннервация >2 месяца |
| Иннервация | ++ | |||
| Аксотомия | Эпителий | +/- | Иннервационная регенерация Нейротрофический кератит | Иннервация >2 месяца NK >2 недели |
| Основа | +/- | |||
| Иннервация | ++ | |||
| Прижигание нервов | Эпителий | + (местный) | Локальная иннервационная регенерация Нейротрофический кератит | В зависимости от частоты прижигания |
| Основа | ||||
| Иннервация |
Таблица 1: Сравнение трех предложенных стратегий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нейротрофический кератит считается редким заболеванием, поражающим 5 из 10 000 человек. Однако люди, страдающие от НК из-за физических травм, таких как химические ожоги, или синдромов, таких как диабет или рассеянный склероз, не включены вэти статистические данные. Кроме того, это состояние остается в значительной степени недодиагностированным22, а распространенность заболевания недооценивается. Существует острая потребность в новых методах лечения и терапии, которые способствовали бы регенерации аксонов как средству сохранения зрения пациентов. В настоящее время единственным доступным лечением, предлагаемым пациентам, страдающим ранними стадиями NK, является применение фармакологических глазных капель 23,24,25, которые поддерживают регенерацию роговичного нерва. Они, однако, эффективны только до определенного момента. В случаях более серьезных изменений роговицы, таких как язвы, трансплантация амниотической мембраны или кератопластика 3,4 предлагают временное решение, чтобы закрыть рану и избежать инфекции. Однако эти трансплантаты должны быть заменены через ограниченное время, при этом риск отторжения увеличивается при каждой дополнительной процедуре.
В настоящем отчете представлено несколько моделей, повторяющих различные формы НК, часто встречающиеся в клинике (табл. 1). Они могут быть использованы для углубления наших знаний об иннервации роговицы и для изучения альтернатив существующим методам лечения. Модель абразии может быть связана с операцией ФРК, учитывая, что она повторяет медленный рост иннервации, который происходит после заживления стертого эпителия. Преимущество этой техники заключается в том, что ее можно относительно легко обучить и воспроизвести при правильном надавливании офтальмологическим бором и создании регулярной стертой области. Кроме того, этот метод может быть адаптирован к конкретным потребностям каждого пациента или в соответствии с интересами пользователя, выбирая размер абразивной области.
Аксотомия похожа на послойную кератопластику, которую проводят пациенты, страдающие поздней стадией NK26. Он позволяет исследовать дегенерацию волокон (валлерову дегенерацию) и повторную колонизацию аксонов в центральной части роговицы. Несмотря на то, что материал, необходимый для проведения операции, относительно прост, практикующий врач должен быть обучен правильной технике, в частности, правильному приложению давления и правильному количеству оборотов биопсийного пуансона. В контексте кератопластики глубина разреза точно определяется с помощью трепанного устройства и интраоперационной оптической когерентной томографии, методы которой не адаптированы к мышиным моделям17. Еще одним отличием от кератопластики является отсутствие донорской трансплантации в описанной здесь методике, так как мы выполняли только разрез роговицы. Эта модель представляет интерес из-за наличия здорового эпителия, в котором иннервация должна расти вновь. Это отличает ее от модели абразии, где эпителий удаляется вместе с иннервацией.
Техника прижигания нервов с использованием многофотонного микроскопа имитирует повреждения, вызванные солнечным ожогом, но делает это на локализованном участке роговицы, тем самым вызывая повреждение ДНК и образование АФК19,20. С помощью этого метода можно изучать регенерацию волокон из разных мест на роговице и даже повторять прижигание в одной и той же области несколько раз, что позволяет оценить влияние на рост аксонов и миграцию иммунных клеток.
Эти три протокола дают возможность изучить фундаментальные аспекты роста аксонов путем изучения регенеративных механизмов, а также взаимодействия между различными типами клеток, присутствующих в роговице и иннервации. Эти методы также предлагают средства стимулирования регенерации аксонов путем применения новых фармакологических молекул24 или генной терапии27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Карин Лулье за доступ к трансгенной мышиной линии MAGIC-Markers. Авторы также выражают признательность центру RAM-Neuro и центру визуализации MRI, входящему в национальную инфраструктуру France-BioImaging при поддержке Французского национального исследовательского агентства (ANR-10-INBS-04, «Инвестиции в будущее»). Это исследование было поддержано программой ATIP-Avenir, Inserm, Région Occitanie, Университетом Монпелье, Французским национальным исследовательским агентством (ANR-21-CE17-0061), Фондом регенеративной медицины (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) и Фондом Groupama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
- Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L.
- Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
- Dua, H. S., et al.
- Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A.
- Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
- Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
- Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
- Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
- Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
- Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
- He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
- Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
- Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
- Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
- Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
- Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
- Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
- Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S.
- Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).
