Summary
Aquí, proponemos tres métodos diferentes para dañar las fibras sensoriales que inervan la córnea. Estos métodos facilitan el estudio de la regeneración axonal en ratones. Estos tres métodos, adaptables a otros modelos animales, son ideales para el estudio de la fisiología de la inervación corneal y la regeneración.
Abstract
La córnea es un tejido transparente que cubre el ojo y es crucial para una visión clara. Es el tejido más inervado del cuerpo. Esta inervación proporciona sensibilidad y función trófica al ojo y contribuye a preservar la integridad de la córnea. La alteración patológica de esta inervación se denomina queratitis neurotrófica. Esto puede desencadenarse por una lesión en el ojo, una cirugía o una enfermedad. En este estudio, proponemos tres protocolos diferentes para infligir daño a la inervación de manera que recapitulen los tres tipos de casos que generalmente se encuentran en la clínica.
El primer método consiste en realizar una abrasión del epitelio con una rebaba oftálmica. Esto implica la extirpación de la capa epitelial, las terminaciones nerviosas libres y el plexo subbasal de manera similar a la cirugía de queratectomía fotorrefractiva realizada en la clínica. El segundo método solo se dirige a la inervación seccionándola en la periferia con un punzón de biopsia, manteniendo la integridad del epitelio. Este método es similar a los primeros pasos de la queratoplastia lamelar y conduce a una degeneración de la inervación seguida de un nuevo crecimiento de los axones en la córnea central. El último método daña la inervación de un modelo de ratón transgénico utilizando un microscopio multifotónico, que localiza específicamente el sitio de cauterización de las fibras nerviosas fluorescentes. Este método inflige el mismo daño que la fotoqueratitis, una sobreexposición a la luz ultravioleta.
Este estudio describe diferentes opciones para investigar la fisiopatología de la inervación corneal, en particular la degeneración y regeneración de los axones. Promover la regeneración es crucial para evitar complicaciones como defectos epiteliales o incluso la perforación de la córnea. Los modelos propuestos pueden ayudar a probar nuevas moléculas farmacológicas o terapia génica que mejoren la regeneración nerviosa y limiten la progresión de la enfermedad.
Introduction
La córnea, que es la superficie transparente del ojo, está compuesta por tres capas distintas: el epitelio, el estroma y el endotelio. Este órgano tiene la mayor densidad de inervación del cuerpo y está compuesto principalmente por fibras sensoriales (tipos Aδ y C) que se originan en la rama oftálmica del ganglio del trigémino. Las fibras sensoriales penetran en la periferia de la córnea en el estroma medio en forma de grandes haces que se ramifican para cubrir la superficie. Luego se bifurcan para perforar la membrana de Bowmann y formar el plexo subbasal, que es fácilmente reconocible por la formación de un vórtice en el centro de la córnea. Esas fibras terminan como terminaciones nerviosas libres en la superficie externa del epitelio. Son capaces de transducir estímulos térmicos, mecánicos y químicos y de liberar factores tróficos que son esenciales para la homeostasis del epitelio 1,2. La queratitis neurotrófica (NK) es una enfermedad degenerativa que afecta a la inervación sensorial corneal. Esta enfermedad rara se deriva de una disminución o pérdida de la sensibilidad corneal que se traduce en una menor producción de lágrimas y malas propiedades curativas de la córnea3. La NK progresa a través de tres estadios bien descritos, desde el estadio 1, en el que los pacientes sufren defectos epiteliales, hasta el estadio 3, en el que se produce la fusión del estroma y/o la perforación de la córnea4.
Clínicamente, los orígenes de esta enfermedad pueden ser diversos. Los pacientes pueden perder la inervación corneal después de una lesión física en el ojo, una cirugía o a través de enfermedades crónicas, como la diabetes 5,6. Hasta la fecha, el proceso de patogénesis de NK sigue siendo poco conocido, y las opciones terapéuticas para esta afección que amenaza la vista son muy limitadas. Por lo tanto, se necesita una mejor comprensión de las características de los defectos epiteliales para comprender mejor los mecanismos detrás de la regeneración de esas fibras y potencialmente promoverlos. Aquí, proponemos varios modelos de lesión corneal que inducen NK en ratones.
El primer modelo es la abrasión de la capa epitelial de la córnea con una rebaba ocular. Este modelo ha sido estudiado principalmente en el contexto de la regeneración del epitelio en diferentes animales, como roedores y peces 7,8,9, y para probar moléculas que promueven la cicatrización corneal10,11. Fisiológicamente, las células epiteliales tardan entre 2 y 3 días en cerrar la herida. El patrón fisiológico de la inervación, sin embargo, tarda más de cuatro semanas en recuperarse de la abrasión12,13. Durante la cirugía, la rebaba ocular elimina la capa epitelial de la córnea que contiene el plexo subbasal y las terminaciones nerviosas libres de las fibras. Este procedimiento se puede comparar clínicamente con pacientes con queratectomía fotorrefractiva (PRK) para corregir defectos refractivos oculares. El procedimiento consiste en extirpar el epitelio de la córnea y luego remodelar el estroma con un láser14. Los pacientes pueden experimentar varios efectos secundarios después de dicha cirugía, como una disminución de la densidad del nervio corneal durante 2 años y una reducción de la sensibilidad durante un período de 3 meses a un año después de la cirugía15. Dado que la cirugía induce una fragilidad del microambiente corneal, este modelo podría ayudar a investigar estos efectos secundarios y desarrollar enfoques terapéuticos que promuevan una reinervación más rápida, reduciendo así los efectos secundarios en cuestión.
El segundo modelo consiste en seccionar los axones en la periferia de la córnea con un punzón de biopsia, induciendo una degeneración walleriana de la inervación central 16. Clínicamente, este método podría compararse con la queratoplastia lamelar anterior, en la que el cirujano realiza una trepanación parcial de la córnea para eliminar una parte del grosor anterior de la córnea y reemplazarla con un trasplante de donante 17. Después de la queratoplastia lamelar, los pacientes pueden sufrir una serie de síntomas que incluyen ojo seco, pérdida de inervación corneal y rechazo del injerto18. Este modelo de axotomía realizado en los nervios corneales podría proporcionar información sobre los mecanismos de degeneración de las fibras, que ocurre después de un injerto, seguido de la regeneración de los axones.
El tercer método daña los nervios corneales con un láser. Mediante el uso de un microscopio multifotónico en la córnea de animales anestesiados, se induce la degeneración de los nervios localizados en el campo óptico como resultado de la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que conduce al daño del ADN y a la cavitación celular19. Este método recapitula el fotodaño corneal inducido por la sobreexposición a los rayos UV naturales (quemaduras solares), que también desencadena la formación de ROS, lo que conduce a daños en el ADN20. Los pacientes que sufren quemaduras solares en la córnea experimentan un gran dolor, ya que el deterioro de las células epiteliales priva a las extremidades de las fibras corneales de todo.
Los tres métodos aquí descritos están diseñados para permitir la investigación del proceso de patogénesis NK y la regeneración de axones. Son fácilmente reproducibles y precisos. Además, permiten una rápida recuperación y un fácil seguimiento de los animales.
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Protocol
Todos los experimentos fueron aprobados por la Junta Nacional de Experimentos con Animales.
1. Preparativos
- Prepare una solución anestésica de ketamina-xilacina para la anestesia. Inyectar ketamina a 80 mg/kg y xilacina a 10 mg/kg diluyendo 200 μL de ketamina (100 mg/mL) y 125 μL de xilacina (20 mg/mL) en 2.175 mL de NaCl estéril al 0,9%.
- Preparar 0,02 mg/ml de solución de buprenorfina como solución analgésica añadiendo 100 μl de buprenorfina 0,3 mg/ml a 1.400 ml de NaCl estéril al 0,9%.
- Prepare la solución de tinción fluorescente.
- Utilice una báscula fina para pesar 10 mg de sal de fluoresceína y dilúyala en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una solución de fluoresceína al 0,1%.
- Proteja la solución de la luz y agítela durante 5 min. Utilice una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,2 μm para filtrar la solución.
NOTA: La solución fluorescente debe protegerse de la luz y puede almacenarse a +4 °C durante 5 días.
- Preparación del ratón
- Pesar al ratón e inducir la anestesia realizando una inyección intraperitoneal de 10 μL/g de peso del ratón (MW) de la solución anestésica. Cuando el ratón deje de moverse, colóquelo sobre una placa calefactada (37 °C) y verifique que esté completamente anestesiado pellizcando los dedos de los pies.
- Aplicar una gota de lágrima artificial en el ojo sometido a la cirugía y una gota de gel ocular en el ojo contralateral.
- Una vez que el ratón no responda al pellizco, inyecte la analgesia (0,02 mg/ml de buprenorfina) a 5 μl/g de MW para proporcionar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea en el cuello.
2. Abrasión de la córnea
- Siga el paso 1.3 para preparar la solución de tinción fluorescente.
- Siga el paso 1.4 para preparar el mouse.
- Antes de realizar la abrasión, sumerja la rebaba ocular en EtOH al 70% y luego en PBS para limpiarla.
- Coloque el ratón en una placa calefactada (37 °C) en el lateral para acceder fácilmente al ojo sometido a la cirugía.
- Use un hisopo de algodón para absorber la lágrima artificial y cepille las pestañas sin tocar el ojo.
- Encienda la fresa ocular, abra el párpado del ratón con dos dedos y, al mismo tiempo, bloquee las vibrisas para evitar que se atasquen en la fresa.
- Localiza la pupila o el centro del ojo y aplica la rebaba ocular en la superficie del ojo, y haz movimientos circulares. Al mirar de cerca, se puede observar la superficie del epitelio eliminado. De lo contrario, realice aproximadamente 20 movimientos circulares sobre la córnea.
- Vuelva a colocar al ratón boca abajo y compruebe si el gel ocular sigue presente en el ojo contralateral.
- Aplique una gota de solución de tinción fluorescente sobre el ojo desgastado y espere 20 s. Absorber la gota con un pañuelo de papel sin tocar el ojo y enjuagarla con una gota de lágrima artificial. Absorbe la gota de la lágrima artificial con un pañuelo de papel e ilumina el ojo con la lámpara azul cobalto.
NOTA: La abrasión tiene que tener una forma circular. Se requiere cierto entrenamiento para obtenerlo. - Aplique una gota de gel ocular en el ojo desgastado y deje que el ratón se despierte en la almohadilla térmica. Cuando el ratón se mueva por sí solo, vuelve a colocarlo en su jaula.
- Comprobar el bienestar del animal durante los 2 días siguientes.
- Después del uso de la fresa ocular, use un tejido blando para eliminar las células epiteliales adheridas en la cabeza de la fresa y sumérjala en EtOH al 70% y luego PBS.
NOTA: Una vez que se hayan eliminado las células epiteliales con el tejido blando, asegúrese de que no queden trozos de tejido atascados en la cabeza de la fresa.
3. Axotomía de los nervios corneales
- Siga el paso 1.4 para preparar el mouse.
- Coloque el ratón debajo de una lupa binocular en el costado para acceder al ojo que se va a someter a la cirugía. Coloque la parte inferior de una placa de Petri debajo de la cabeza del ratón para que el ojo quede horizontal.
NOTA: Los siguientes pasos se realizarán mirando a través de la lupa binocular. - Retire la lágrima artificial con un bastoncillo de algodón y retire las pestañas sin tocar el ojo.
- Coloque alicates curvos suaves debajo del ojo del animal para sacarlo de la órbita. Asegúrese de cerrar los alicates lo suficiente para que el ojo no pueda volver a la órbita una vez que se aplica presión, pero no excesivamente para evitar daños en el nervio óptico.
- Aplicar el punzón de biopsia de 2,5 mm verticalmente sobre el ojo sin presión para asegurar el contacto total del punzón con la superficie de la córnea.
NOTA: Una vez que se aplica el punzón contra la córnea, la mano del experimentador puede interferir con el campo de visión. - Luego, comience a aplicar presión y gire el punzón varias veces.
NOTA: Dependiendo de la presión, el número de giros puede variar, pero generalmente es de alrededor de 5. Requiere entrenamiento para sentir la presión y el movimiento adecuados. Si se aplica demasiada presión, el ojo se rompe. En este caso, se puede observar que el líquido sale de la lesión y el ojo se ablanda. El animal tiene que ser sacrificado. - Retire el punzón de biopsia. Debe haber un círculo visible en la córnea donde se aplicó la punción de biopsia.
NOTA: Los siguientes pasos no requieren la lupa binocular. - Compruebe si el ojo contralateral todavía tiene gel ocular y aplique un poco sobre el ojo axotomizado.
- Deje que el ratón se despierte en una almohadilla térmica (37 °C) y vuelva a colocarlo en su jaula cuando se mueva por sí solo.
- Comprobar el bienestar del animal durante los 2 días siguientes.
4. Procesamiento de montaje completo de la córnea
- Recogida y fijación de muestras.
- Pesar al ratón e inducir la anestesia realizando una inyección intraperitoneal de 10 μL/g de peso del ratón (MW) de la solución anestésica.
- Cuando el ratón deje de moverse y no tenga reflejos al pellizcarse los dedos de los pies, realice una luxación cervical.
- Saca el ojo de la órbita con dos dedos y enuclea el ojo cortando el nervio óptico con unas tijeras curvas.
- Coloque el ojo en un tubo de plástico de 2 ml que contenga PBS.
- Fije el ojo reemplazando el PBS con paraformaldehído al 4% y colocándolo en un agitador (30 rpm) a temperatura ambiente (RT) durante 20 min.
- Enjuague 3 veces durante 10 minutos con PBS a RT en una coctelera (30 rpm).
- Disección de la córnea
- Coloque una gota de PBS en un trozo de parafilm dentro de una placa de Petri.
- Coloque el ojo en esta gota de PBS.
- Coloque la placa de Petri debajo de la lupa binocular.
- Disecciona la córnea con tijeras de microdisección y fórceps. Cortar por encima del cuerpo ciliar para mantener el limbo.
- Retire el cristalino, el cuerpo ciliar y el iris con pinzas finas.
- Vuelva a colocar la córnea en un tubo de plástico de 2 ml.
- Protocolo de inmunofluorescencia
- Incubar la córnea en 2 ml de gelatina de piel de pescado al 2,5%, suero de cabra al 5% y detergente al 0,5% en PBS durante 1 h a RT en un agitador (30 rpm).
- Incubar la córnea en 150 μL de una solución de gelatina de piel de pescado al 2,5%, suero de cabra al 5% y detergente al 0,1% en PBS que contenga el anticuerpo primario diluido a 1/1000 (anticuerpo anti βIII tubulina) durante la noche a 4 °C en un agitador (30 rpm).
- Enjuague 3 veces durante 1 h con detergente al 0,1% en PBS a RT en un agitador (30 rpm).
- Incubar la córnea en la misma solución que en el paso 4.3.2, que contiene el anticuerpo secundario diluido a 1/500 durante la noche a 4 °C en un agitador (30 rpm).
- Enjuague 3 veces durante 1 h con PBS a RT en una coctelera (30 rpm).
- Incubar la córnea durante 10 min con 150 μL de intercalador de ADN diluido a 1/5000 a RT en un agitador (30 rpm).
- Enjuague 2 veces durante 5 minutos con PBS.
- Montaje de la córnea
- Coloque la córnea en un portaobjetos, con el epitelio orientado hacia el portaobjetos, y use un bisturí para crear cuatro secciones sin llegar al centro.
NOTA: Haz las secciones opuestas entre sí para formar una forma de flor. - Coloque el endotelio de la córnea hacia el portaobjetos y retire el PBS alrededor de la córnea con un pañuelo de papel.
NOTA: No retire el PBS debajo de la córnea; de lo contrario, pueden aparecer burbujas de aire. Si es así, agregue PBS a la córnea y retire la burbuja de aire. A continuación, reinicie desde el paso 4.3.2. - Agregue pasta de modelo en las cuatro esquinas de un cubreobjetos rectangular.
NOTA: La pasta modelo eleva el cubreobjetos ya que la córnea es un tejido grueso. - Deje caer 50 μL de un medio de montaje sobre la córnea y coloque con cuidado el cubreobjetos por encima para evitar la formación de burbujas.
- Sella el cubreobjetos con esmalte de uñas.
- Coloque la córnea en un portaobjetos, con el epitelio orientado hacia el portaobjetos, y use un bisturí para crear cuatro secciones sin llegar al centro.
- Imagenológico
- Coloque el portaobjetos bajo un microscopio epifluorescente.
- Defina el tamaño del mosaico y la profundidad de la imagen e inicie la adquisición.
- Aplique un programa de desenfoque y deconvolución en la imagen adquirida.
NOTA: El paso 4.6.3 es una opción seleccionada en el software de adquisición (Large Volume Computational Clearing [LVCC])
5. Ablación localizada con láser de los nervios corneales
- Encienda el microscopio multifotónico vertical y el láser combinado con un oscilador óptico paramétrico. Active la platina calentada del microscopio (37 °C) y ajuste los láseres a 850 nm y 1100 nm, correspondientes a las longitudes de onda requeridas para el modelo de ratón.
- Utilice un medidor de potencia para ajustar la potencia de los láseres simultáneamente a unos 20 mW.
- Siga el paso 1.4 para preparar el ratón y aplique gel ocular en ambos ojos.
NOTA: El animal utilizado para este protocolo debe ser de una línea de ratón transgénico (ratón transgénico MAGIC-Marker21) que exprese un fluoróforo endógeno en las fibras nerviosas corneales. - Instale el animal en un soporte para la cabeza. Gira el animal 90° para que el ojo de interés mire hacia el techo.
- Amarre las vibrisas del animal para despejar el área de los ojos. Amarre el cuerpo del animal para disminuir el movimiento de la cabeza inducido por la respiración.
- Coloque un cubreobjetos circular en el ojo por encima del gel ocular. El cubreobjetos tiene que ser horizontal. No dude en mover la cabeza del animal para que el cubreobjetos quede correctamente colocado.
- Agregue una gota de PBS sobre el cubreobjetos. Coloque al animal en la platina del microscopio con cuidado y coloque la torreta del objetivo a la distancia correcta.
- Utilice el objetivo acuoso de 20x y la epifluorescencia para localizar el ojo y la inervación a través del ocular.
- Activa los láseres y define la profundidad que hay que iluminar.
- Adquiera imágenes de 1024 x 1024 (píxeles) a una velocidad de adquisición del 70 % al 85 % de la velocidad máxima de escaneo.
- Una vez adquirida la imagen, se retira al animal del microscopio y se le quitan el cubreobjetos y las correas. Retire al animal del soporte para la cabeza, agregue más gel ocular si es necesario y deje que se despierte en una jaula sobre un plato caliente.
NOTA: La destrucción de la inervación se puede observar 1 semana después de la toma de imágenes. Este protocolo se puede repetir una vez a la semana durante varias semanas para aumentar el daño causado por los láseres. - Cuando el animal se mueva por sí solo, vuelva a colocar la jaula en el establo y verifique su bienestar durante los siguientes 2 días.
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Representative Results
Este estudio propone varios protocolos para infligir daño a la inervación corneal en ratones. Si bien se han utilizado protocolos similares para investigar la fisiopatología de la cicatrización del epitelio, optamos por adaptar y desarrollar nuevos métodos para investigar la regeneración de la inervación corneal. Para observar la inervación, se utilizaron dos técnicas. En primer lugar, empleamos una técnica de inmunofluorescencia para teñir las fibras nerviosas utilizando un anticuerpo panneuronal (tubulina BIII) y los núcleos con un intercalador. En segundo lugar, aprovechamos una cepa de ratón transgénico que expresaba proteínas fluorescentes en las fibras nerviosas. Las córneas se obtuvieron con un microscopio epifluorescente.
El primer método utilizó una fresa oftálmica con un removedor de anillos de óxido de 0,5 mm para eliminar la capa epitelial corneal (Figura 1A). Este estudio se centra en el daño causado a la inervación localizada en el interior del epitelio como medio para comprender los componentes celulares y moleculares implicados en su regeneración. Antes de la cirugía, el epitelio basal estaba intacto. Las fibras nerviosas en el plexo subbasal formaron un patrón típico llamado vórtice (Figura 1B). La punta de la fresa utilizada en esta técnica eliminó solo la primera capa de la córnea, pero preservó tanto el estroma, donde se encuentran grandes haces de fibras, como el endotelio. La parte del epitelio removida por la rebaba era fácilmente visible, ya que había una clara ruptura del epitelio basal y del plexo subbasal (Figura 1B). Los núcleos de los queratocitos se pueden identificar fácilmente, ya que están escasamente dispuestos a lo largo del estroma. En cuanto a la inervación, el borde también era claro, con una ruptura del plexo subbasal que permitía ver los grandes haces de fibras en el interior del estroma. Mientras que el epitelio tarda unos 3 días en sanar, la regeneración de la inervación tarda más de 4 semanas después de una abrasión. La figura 1 ilustra la regeneración del epitelio 1 semana después de la cirugía, en la que el epitelio basal es liso. Sin embargo, el vórtice está ausente del centro de la córnea, dado que la inervación aún no ha regresado a ese punto.
El segundo método consiste en seccionar los nervios en la periferia de la córnea con un punzón de biopsia de 2,5 mm de diámetro en lugar de cepillarlos con la fresa (Figura 2A). Este método no altera el epitelio tanto como la abrasión. Después de la cirugía, se puede observar un anillo periférico delgado en el punto donde se aplicó el punzón de biopsia, dañando el epitelio basal (Figura 2B). Sin embargo, los nervios de la periferia han sido seccionados, lo que desencadena la degeneración walleriana de los axones. Este tipo de degeneración consiste en la desintegración de los nervios desde la terminación terminal de las neuronas hacia el cuerpo celular y, en este caso, hacia la sección inducida por la punción de la biopsia. Dependiendo de la profundidad de la axotomía, el daño puede ser grave. Aquí, vemos que se ha producido una fuerte degeneración, lo que lleva a una pérdida total de inervación en el centro de la córnea en el epitelio (Figura 2B). Como la inervación es esencial para el mantenimiento de la homeostasis del epitelio, se inicia una desintegración de la capa epitelial, creando una úlcera (Figura 2B). La formación de úlceras solo ocurrió en córneas muy dañadas.
La última técnica consiste en quemar localmente in vivo los nervios corneales de ratones transgénicos anestesiados con un microscopio multifotónico (Figura 3A). La primera imagen se adquiere en el lugar donde se realizará la quema. En este estudio se utilizó un ratón transgénico cuya inervación expresa proteínas fluorescentes. La imagen fue adquirida en el centro de la córnea, donde se encuentra el vórtice (Figura 3B), desde la parte superior del epitelio hasta el estroma medio. El vórtice ya no es visible 1 semana después de la primera adquisición de la imagen. En cambio, un grupo de células inmunitarias ha migrado al sitio de iluminación, donde podemos identificar el haz de fibras en el estroma, que se han adelgazado después de la primera adquisición (Figura 3B).
Figura 1: Rebaba ocular y ejemplo de inervación corneal después de la abrasión. (A) Se utilizó una fresa oftalmológica con un removedor de anillos de óxido de 0,5 mm para realizar la abrasión. (B) Ejemplos de córneas disecadas e inmunoteñidas. Las imágenes previas a la abrasión ilustran el epitelio basal liso y el vórtice (punta de flecha blanca) en el centro. Las imágenes posteriores a la abrasión muestran una clara delimitación del plexo subbasal, que se eliminó (puntas de flecha rojas). Las imágenes adquiridas a 1 semana después de la abrasión (1WPAbr) muestran dónde se están regenerando las fibras (punta de flecha naranja). La inervación se tiñe con un anticuerpo anti-BIII tubulina (verde). Los núcleos se tiñen con un intercalador de ADN (púrpura). Las imágenes se obtuvieron con un microscopio epifluorescente. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Punción de biopsia y ejemplo de inervación corneal después de una axotomía. (A) Se aplica una punción de biopsia estéril de 2,5 mm de diámetro al ojo para inducir una axotomía. (B) Ejemplos de córneas disecadas e inmunoteñidas. Las imágenes previas a la axotomía ilustran la presencia del vórtice en el centro de la córnea (punta de flecha blanca). Las imágenes posteriores a la axotomía muestran el anillo (puntas de flecha rojas) creado por el punzón en el epitelio. Las imágenes adquiridas a las 2 semanas después de la axotomía (2WPAx) ilustran la formación de la úlcera (punta de flecha naranja). La inervación se tiñe con tubulina BIII (verde). Los núcleos se tiñen con un intercalador (morado). Las imágenes se obtuvieron con un microscopio epifluorescente. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación para la cauterización del nervio corneal mediante láseres y un ejemplo (A) El ratón transgénico MAGIC-Marker21 anestesiado es mantenido por el soporte de la cabeza, y su ojo está orientado hacia el objetivo 20x del bifotón. El cuerpo del ratón está atado para evitar el movimiento respiratorio durante la adquisición. (B) Vista tridimensional (3D) de la primera adquisición del vórtice utilizando las longitudes de onda 850 nm y 1100 nm simultáneamente antes del fotodaño y 1 semana después del fotodaño (1WPPhDa) en la misma ubicación del vórtice. Los láseres indujeron la migración de las células inmunitarias (punta de flecha) donde se encontraba el vórtice. Barras de escala = 80 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Técnica | Estructura impactada | Grado de impacto (+/-) | Tipo de estudio | Periodo de curación |
| Abrasión | Epitelio | ++ | Epitelio y regeneración de inervación | Epitelio <1 semana Inervación >2 meses |
| Inervación | ++ | |||
| Axotomía | Epitelio | +/- | Inervación Regeneración Queratitis neurotrófica | Inervación >2 meses NK >2 semanas |
| Estroma | +/- | |||
| Inervación | ++ | |||
| Cauterización nerviosa | Epitelio | + (local) | Regeneración de inervación local Queratitis neurotrófica | Dependiendo de la frecuencia de cauterización |
| Estroma | ||||
| Inervación |
Tabla 1: Comparación de las tres estrategias propuestas.
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Discussion
La queratitis neurotrófica se considera una enfermedad rara que afecta a 5 de cada 10.000 personas. Sin embargo, las personas que padecen NK debido a una lesión física como quemaduras químicas, o síndromes como la diabetes o la esclerosis múltiple no se incluyen en esas estadísticas3. Además, esta condición sigue estando significativamente infradiagnosticada22 y la prevalencia de la enfermedad está subestimada. Existe una gran necesidad de nuevos tratamientos y terapias que promuevan la regeneración de los axones como un medio para preservar la vista de los pacientes. En la actualidad, el único tratamiento disponible que se ofrece a los pacientes que padecen las primeras etapas de NK es la aplicación de colirios farmacológicos 23,24,25 que apoyan la regeneración del nervio corneal. Estos, sin embargo, son efectivos solo hasta cierto punto. En casos de alteración más severa de la córnea, como úlceras, el trasplante de membrana amniótica o la queratoplastia 3,4 ofrecen una solución temporal para cerrar la herida y evitar la infección. Sin embargo, esos injertos deben reemplazarse después de un tiempo limitado, y el riesgo de rechazo aumenta en cada procedimiento adicional.
En este informe se presentan varios modelos que recapitulan las diferentes formas de NK que se encuentran comúnmente en la clínica (Tabla 1). Estos se pueden utilizar para profundizar nuestro conocimiento de la inervación corneal y para investigar alternativas a los tratamientos actuales. El modelo de abrasión se puede asociar a la cirugía PRK, dado que recapitula el lento rebrote de la inervación, que se produce después de la cicatrización del epitelio desgastado. Esta técnica puede enseñarse y reproducirse con relativa facilidad cuando se aplica la presión correcta con la fresa oftálmica y se crea una zona desgastada regular. Además, esta técnica se puede adaptar a las necesidades específicas de cada paciente o al interés del usuario eligiendo el tamaño de la zona desgastada.
La axotomía es similar a la queratoplastia lamelar a la que se someten los pacientes que padecen NK26 en estadio tardío. Permite investigar la degeneración de las fibras (degeneración walleriana) y la recolonización de los axones en la córnea central. Si bien el material necesario para realizar la cirugía es relativamente sencillo, el profesional debe estar formado en la técnica adecuada, en particular en la correcta aplicación de la presión y el número correcto de vueltas con el punzón de biopsia. En el contexto de una queratoplastia, la profundidad de la incisión se determina con precisión mediante el uso de un dispositivo de trépano y tomografía de coherencia óptica intraoperatoria, técnicas que no son adaptables a modelos murinos17. Otra diferencia con la queratoplastia es la ausencia de trasplante de donante en la técnica aquí descrita, ya que solo realizamos la incisión de la córnea. Este modelo es de interés debido a la presencia de un epitelio sano en el que la inervación debe volver a crecer. Esto lo diferencia del modelo de abrasión, donde el epitelio se elimina con la inervación.
La técnica de cauterización del nervio, utilizando un microscopio multifotónico, imita el daño causado por las quemaduras solares, pero lo hace en un área localizada de la córnea, desencadenando así el daño en el ADN y la formación de ROS19,20. Con este método, es posible estudiar la regeneración de las fibras de diferentes localizaciones de la córnea e incluso repetir la cauterización en la misma zona varias veces, lo que permite evaluar el impacto en el crecimiento de los axones y la migración de las células inmunitarias.
Estos tres protocolos ofrecen la posibilidad de estudiar los aspectos fundamentales del recrecimiento axonal investigando los mecanismos regenerativos, así como las interacciones entre los diferentes tipos celulares presentes en la córnea y la inervación. Estos métodos también ofrecen un medio para promover la regeneración axonal mediante la aplicación de nuevas moléculas farmacológicas24 o la terapia génica27.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Dra. Karine Loulier por el acceso a la línea de ratones transgénicos MAGIC-Markers. Los autores también agradecen a la instalación central de animales RAM-Neuro y a la instalación de imágenes MRI, miembro de la infraestructura nacional France-BioImaging apoyada por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-10-INBS-04, "Inversiones para el futuro"). Esta investigación contó con el apoyo del programa ATIP-Avenir, el Inserm, la Región de Occitania, la Universidad de Montpellier, la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-21-CE17-0061), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) y la Fundación Groupama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
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