Summary
Hier stellen we drie verschillende methoden voor om de sensorische vezels die het hoornvlies innerveren te beschadigen. Deze methoden vergemakkelijken de studie van axonregeneratie bij muizen. Deze drie methoden, die kunnen worden aangepast aan andere diermodellen, zijn ideaal voor de studie van de fysiologie en regeneratie van de innervatie van het hoornvlies.
Abstract
Het hoornvlies is een transparant weefsel dat het oog bedekt en cruciaal is voor een helder zicht. Het is het meest geïnnerveerde weefsel in het lichaam. Deze innervatie geeft het oog gevoel en trofische functie en draagt bij aan het behoud van de integriteit van het hoornvlies. De pathologische verstoring van deze innervatie wordt neurotrofe keratitis genoemd. Dit kan worden veroorzaakt door oogletsel, een operatie of een ziekte. In deze studie stellen we drie verschillende protocollen voor om schade toe te brengen aan de innervatie op manieren die de drie soorten gevallen samenvatten die over het algemeen in de kliniek voorkomen.
De eerste methode bestaat uit het maken van een schuur van het epitheel met een oogheelkundige braam. Dit omvat het verwijderen van de epitheellaag, de vrije zenuwuiteinden en de subbasale plexus op een manier die vergelijkbaar is met de fotorefractieve keratectomie-operatie die in de kliniek wordt uitgevoerd. De tweede methode richt zich alleen op de innervatie door deze aan de periferie te doorsnijden met een biopsiepons, waardoor de integriteit van het epitheel behouden blijft. Deze methode is vergelijkbaar met de eerste stappen van lamellaire keratoplastiek en leidt tot een degeneratie van de innervatie, gevolgd door hergroei van de axonen in het centrale hoornvlies. De laatste methode beschadigt de innervatie van een transgeen muismodel met behulp van een multifotonenmicroscoop, die specifiek de plaats van cauterisatie van de fluorescerende zenuwvezels lokaliseert. Deze methode veroorzaakt dezelfde schade als fotokeratitis, een overmatige blootstelling aan UV-licht.
Deze studie beschrijft verschillende opties voor het onderzoeken van de fysiopathologie van cornea-innervatie, met name de degeneratie en regeneratie van de axonen. Het bevorderen van regeneratie is cruciaal om complicaties zoals epitheeldefecten of zelfs perforatie van het hoornvlies te voorkomen. De voorgestelde modellen kunnen helpen bij het testen van nieuwe farmacologische moleculen of gentherapie die de zenuwregeneratie verbeteren en de ziekteprogressie beperken.
Introduction
Het hoornvlies, het transparante oppervlak van het oog, bestaat uit drie verschillende lagen: het epitheel, het stroma en het endotheel. Dit orgaan heeft de hoogste dichtheid van innervatie in het lichaam en bestaat voornamelijk uit sensorische vezels (typen Aδ en C) die afkomstig zijn van de oogheelkundige tak van het trigeminusganglion. Sensorische vezels dringen de periferie van het hoornvlies in het midden van het stroma binnen in de vorm van grote bundels die zich vertakken om het oppervlak te bedekken. Vervolgens splitsen ze zich om het membraan van Bowmann te doorboren en vormen ze de subbasale plexus, die gemakkelijk te herkennen is aan de vorming van een vortex in het midden van het hoornvlies. Die vezels eindigen als vrije zenuwuiteinden aan de buitenkant van het epitheel. Ze zijn in staat om thermische, mechanische en chemische prikkels om te zetten en trofische factoren vrij te maken die essentieel zijn voor de homeostase van epitheel 1,2. Neurotrofe keratitis (NK) is een degeneratieve ziekte die de sensorische innervatie van het hoornvlies aantast. Deze zeldzame ziekte komt voort uit een afname of verlies van de gevoeligheid van het hoornvlies, wat resulteert in een lagere traanproductie en slechte genezende eigenschappen van het hoornvlies3. NK doorloopt drie goed beschreven stadia, van stadium 1 waarin patiënten epitheeldefecten oplopen, tot stadium 3 waarin stromaal smelten en/of hoornvliesperforatie optreedt4.
Klinisch gezien kan de oorsprong van deze ziekte divers zijn. Patiënten kunnen de innervatie van het hoornvlies verliezen na lichamelijk letsel aan het oog, een operatie of door chronische ziekten, zoals diabetes 5,6. Tot op heden blijft het NK-pathogeneseproces slecht begrepen en zijn de therapeutische opties voor deze gezichtsbedreigende aandoening zeer beperkt. Daarom is een beter begrip van de kenmerken van epitheeldefecten nodig om de mechanismen achter de regeneratie van die vezels beter te begrijpen en mogelijk te bevorderen. Hier stellen we verschillende modellen van hoornvliesbeschadiging voor die NK bij muizen induceren.
Het eerste model is het schuren van de epitheellaag van het hoornvlies met een oculaire braam. Dit model is voornamelijk bestudeerd in het kader van de regeneratie van het epitheel bij verschillende dieren, zoals knaagdieren en vissen 7,8,9, en om moleculen te testen die de genezing van het hoornvlies bevorderen10,11. Fysiologisch duurt het 2-3 dagen voordat de epitheelcellen de wond sluiten. Het fysiologische patroon van de innervatie heeft echter meer dan vier weken nodig om te herstellen van de slijtage12,13. Tijdens de operatie verwijdert de oculaire braam de epitheellaag van het hoornvlies die de subbasale plexus en de vrije zenuwuiteinden van de vezels bevat. Deze procedure kan klinisch worden vergeleken met patiënten met fotorefractieve keratectomie (PRK) om oogrefractiedefecten te corrigeren. De procedure bestaat uit het verwijderen van het epitheel van het hoornvlies en vervolgens het opnieuw vormgeven van het stroma met een laser14. Patiënten kunnen verschillende bijwerkingen ervaren na een dergelijke operatie, zoals een afname van de dichtheid van de hoornvlieszenuw gedurende 2 jaar en een vermindering van de gevoeligheid gedurende een periode van 3 maanden tot een jaar na de operatie15. Aangezien de operatie een kwetsbaarheid van de micro-omgeving van het hoornvlies induceert, zou dit model kunnen helpen bij het onderzoeken van deze bijwerkingen en het ontwikkelen van therapeutische benaderingen die een snellere reïnnervatie zouden bevorderen, waardoor de bijwerkingen in kwestie zouden worden verminderd.
Het tweede model bestaat uit het doorsnijden van de axonen aan de periferie van het hoornvlies met een biopsiepons, waardoor een Walleriaanse degeneratie van de centrale innervatie wordt geïnduceerd 16. Klinisch kan deze methode worden vergeleken met anterieure lamellaire keratoplastiek, waarbij de chirurg een gedeeltelijke trephination van het hoornvlies realiseert om een deel van de voorste dikte van het hoornvlies te verwijderen en te vervangen door een donortransplantatie 17. Na lamellaire keratoplastiek kunnen patiënten last hebben van een aantal symptomen, waaronder droge ogen, verlies van hoornvliesinnervatie en afstoting van hettransplantaat18. Dit axotomiemodel dat op hoornvlieszenuwen wordt uitgevoerd, zou inzicht kunnen geven in de mechanismen van vezeldegeneratie, die optreedt na een transplantaat, gevolgd door de regeneratie van de axonen.
De derde methode beschadigt de hoornvlieszenuwen met een laser. Door gebruik te maken van een multifotonenmicroscoop op het hoornvlies van verdoofde dieren, wordt degeneratie van de zenuwen gelokaliseerd in het optische veld geïnduceerd als gevolg van de vorming van reactieve zuurstofsoorten (ROS), wat leidt tot DNA-schade en cellulaire cavitatie19. Deze methode recapituleert de fotoschade aan het hoornvlies die wordt veroorzaakt door overmatige blootstelling aan natuurlijke UV (zonnebrand), die ook ROS-vorming veroorzaakt, wat leidt tot DNA-schade20. Patiënten die lijden aan zonnebrand op het hoornvlies ervaren veel pijn, omdat de achteruitgang van epitheelcellen de uiteinden van de hoornvliesvezels van alles berooft.
De drie methoden die hier worden beschreven, zijn ontworpen om het onderzoek van het NK-pathogeneseproces en axonregeneratie mogelijk te maken. Ze zijn gemakkelijk reproduceerbaar en nauwkeurig. Bovendien zorgen ze voor een snel herstel en een gemakkelijke monitoring van de dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de National Animal Experiment Board.
1. Voorbereidingen
- Bereid een verdovingsoplossing van ketamine-xylazine voor anesthesie. Injecteer ketamine in een dosis van 80 mg/kg en xylazine in een dosis van 10 mg/kg door 200 μL ketamine (100 mg/ml) en 125 μl xylazine (20 mg/ml) te verdunnen in 2.175 ml steriele 0,9% NaCl.
- Bereid 0,02 mg/ml buprenorfine-oplossing als pijnstillende oplossing door 100 μl 0,3 mg/ml buprenorfine toe te voegen aan 1.400 ml steriele 0,9% NaCl.
- Bereid de fluorescerende kleuringsoplossing voor.
- Gebruik een fijne weegschaal om 10 mg fluoresceïnezout af te wegen en verdun het in 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een 0,1% fluoresceïne-oplossing te verkrijgen.
- Bescherm de oplossing tegen het licht en schud deze gedurende 5 minuten. Gebruik een spuit van 10 ml en een spuitfilter van 0,2 μm om de oplossing te filteren.
OPMERKING: De fluorescerende oplossing moet worden beschermd tegen licht en kan 5 dagen bij +4 °C worden bewaard.
- Voorbereiding van de muis
- Weeg de muis en induceer anesthesie door een intraperitoneale injectie uit te voeren van 10 μL/g muisgewicht (MW) van de verdovingsoplossing. Wanneer de muis stopt met bewegen, plaatst u hem op een verwarmde plaat (37 °C) en controleert u of hij volledig verdoofd is door in zijn tenen te knijpen.
- Breng een druppel kunsttraan aan op het oog dat de operatie ondergaat en een druppel oculaire gel op het contralaterale oog.
- Zodra de muis niet meer reageert op knijpen, injecteert u de analgesie (0,02 mg/ml buprenorfine) in een dosis van 5 μl/g MW om 0,1 mg/kg buprenorfine subcutaan in de nek te leveren.
2. Slijtage van het hoornvlies
- Volg stap 1.3 om de fluorescerende kleuroplossing te bereiden.
- Volg stap 1.4 om de muis voor te bereiden.
- Voordat u gaat schuren, dompelt u de oogbraam in 70% EtOH en vervolgens in PBS om deze schoon te maken.
- Plaats de muis op een verwarmde plaat (37 °C) aan de zijkant om gemakkelijk toegang te krijgen tot het oog dat de operatie ondergaat.
- Gebruik een wattenstaafje om de kunsttraan te absorberen en borstel de wimpers weg zonder het oog aan te raken.
- Zet de oculaire braam aan, open het ooglid van de muis met twee vingers en blokkeer tegelijkertijd de vibrissae om te voorkomen dat ze vast komen te zitten in de braam.
- Lokaliseer de pupil of het midden van het oog en breng de oculaire braam aan op het oppervlak van het oog en maak cirkelvormige bewegingen. Door goed te kijken, kan het oppervlak van het verwijderde epitheel worden waargenomen. Voer anders ongeveer 20 cirkelvormige bewegingen uit op het hoornvlies.
- Leg de muis terug op zijn buik en controleer of de oculaire gel nog aanwezig is in het contralaterale oog.
- Breng een druppel fluorescerende kleuringsoplossing aan op het geschaafde oog en wacht 20 s. Absorbeer de druppel met een tissue zonder het oog aan te raken en spoel het met een druppel kunsttraan. Absorbeer de druppel van de kunsttraan met een tissue en verlicht het oog met de blauwe kobaltlamp.
OPMERKING: De slijtage moet een ronde vorm hebben. Het vereist enige training om het te verkrijgen. - Breng een druppel oculaire gel aan op het geschaafde oog en laat de muis wakker worden op het verwarmde kussen. Als de muis uit zichzelf beweegt, plaats hem dan terug in zijn kooi.
- Controleer het welzijn van het dier gedurende de volgende 2 dagen.
- Gebruik na het gebruik van de oculaire braam een zacht weefsel om epitheelcellen te verwijderen die in de kop van de braam vastzitten en dompel deze in 70% EtOH en vervolgens PBS.
NOTITIE: Zodra de epitheelcellen met het zachte weefsel zijn verwijderd, moet u ervoor zorgen dat er geen stukjes weefsel in de kop van de braam vastzitten.
3. Axotomie van de hoornvlieszenuwen
- Volg stap 1.4 om de muis voor te bereiden.
- Plaats de muis onder een binoculaire loep aan de zijkant om toegang te krijgen tot het oog dat de operatie ondergaat. Leg de bodem van een petrischaal onder de kop van de muis zodat het oog horizontaal staat.
NOTITIE: De volgende stappen worden uitgevoerd door door de binoculaire loep te kijken. - Verwijder de kunsttraan met een wattenstaafje en verwijder de wimpers zonder het oog aan te raken.
- Plaats een gladde gebogen tang onder het oog van het dier om het uit de baan te halen. Zorg ervoor dat u de tang voldoende sluit zodat het oog niet terug in de baan kan gaan zodra er druk wordt uitgeoefend, maar niet overmatig om beschadiging van de oogzenuw te voorkomen.
- Breng de biopsiepons van 2,5 mm verticaal aan op het oog zonder druk om een volledig contact van de pons met het oppervlak van het hoornvlies te garanderen.
NOTITIE: Zodra de pons tegen het hoornvlies is aangebracht, kan de hand van de onderzoeker het gezichtsveld verstoren. - Begin dan druk uit te oefenen en draai de pons meerdere keren.
NOTITIE: Afhankelijk van de druk kan het aantal wendingen variëren, maar over het algemeen is het ongeveer 5. Het vereist training om de juiste druk en beweging te voelen. Als er te veel druk wordt uitgeoefend, scheurt het oog. In dit geval kan worden waargenomen dat vloeistof de laesie verlaat en dat het oog zachter wordt. Het dier moet worden geofferd. - Verwijder de biopsiepons. Er moet een cirkel zichtbaar zijn op het hoornvlies waar de biopsiepons is aangebracht.
NOTITIE: Voor de volgende stappen is de verrekijkerloep niet nodig. - Controleer of het contralaterale oog nog oculaire gel bevat en breng wat aan op het geaxotomiseerde oog.
- Laat de muis wakker worden op een verwarmde pad (37 °C) en plaats hem terug in zijn kooi als hij zelfstandig beweegt.
- Controleer het welzijn van het dier gedurende de volgende 2 dagen.
4. Verwerking van het hoornvlies voor het geheel
- Monsterafname en fixatie.
- Weeg de muis en induceer anesthesie door een intraperitoneale injectie uit te voeren van 10 μL/g muisgewicht (MW) van de verdovingsoplossing.
- Wanneer de muis stopt met bewegen en geen reflexen heeft door teenknijpen, voer dan een cervicale dislocatie uit.
- Haal het oog met twee vingers uit de oogkas en verwijder het oog door de oogzenuw door te knippen met een gebogen schaar.
- Plaats het oog in een plastic buisje van 2 ml met PBS.
- Fixeer het oog door de PBS te vervangen door 4% paraformaldehyde en deze gedurende 20 minuten op een shaker (30 rpm) bij kamertemperatuur (RT) te plaatsen.
- Spoel 3 keer gedurende 10 minuten met PBS op RT op een shaker (30 rpm).
- Dissectie van het hoornvlies
- Plaats een druppel PBS op een stuk parafilm in een petrischaaltje.
- Plaats het oog in deze druppel PBS.
- Plaats de petrischaal onder de verrekijkerloep.
- Ontleed het hoornvlies met behulp van een microdissectieschaar en een pincet. Snijd boven het corpus ciliare om de limbus te behouden.
- Verwijder de lens, het corpus ciliare en de iris met een fijne pincet.
- Plaats het hoornvlies terug in een plastic buis van 2 ml.
- Immunofluorescentie protocol
- Incubeer het hoornvlies in 2 ml 2,5% vishuidgelatine, 5% geitenserum en 0,5% wasmiddel in PBS gedurende 1 uur bij RT op een shaker (30 rpm).
- Incubeer het hoornvlies in 150 μl van een oplossing van 2,5% vishuidgelatine, 5% geitenserum en 0,1% wasmiddel in PBS met het primaire antilichaam verdund met 1/1000 (anti βIII tubuline-antilichaam) 's nachts bij 4 °C op een shaker (30 rpm).
- Spoel 3 keer gedurende 1 uur met 0,1% wasmiddel in PBS bij RT op een shaker (30 rpm).
- Incubeer het hoornvlies in dezelfde oplossing als voor stap 4.3.2, met daarin het secundaire antilichaam dat 's nachts bij 4 °C bij 1/500 is verdund op een shaker (30 rpm).
- Spoel 3 keer gedurende 1 uur met PBS bij RT op een shaker (30 rpm).
- Incubeer het hoornvlies gedurende 10 minuten met 150 μL DNA-intercalator verdund bij 1/5000 bij RT op een shaker (30 rpm).
- Spoel 2 keer gedurende 5 minuten met PBS.
- Montage van het hoornvlies
- Plaats het hoornvlies op een objectglaasje, met het epitheel naar het objectglaasje gericht, en gebruik een scalpel om vier secties te maken zonder het midden te bereiken.
OPMERKING: Doe de secties tegenover elkaar om een bloemvorm te vormen. - Plaats het endotheel van het hoornvlies naar het objectglaasje gericht en verwijder de PBS rond het hoornvlies met behulp van een tissue.
NOTITIE: Verwijder de PBS niet onder het hoornvlies; anders kunnen er luchtbellen ontstaan. Als dit het geval is, voeg dan PBS toe aan het hoornvlies en verwijder de luchtbel. Start vervolgens opnieuw vanaf stap 4.3.2. - Breng modelpasta aan op de vier hoeken van een rechthoekig dekglaasje.
OPMERKING: De modelpasta verhoogt het dekglaasje omdat het hoornvlies een dik weefsel is. - Laat 50 μL van een montagemedium op het hoornvlies vallen en leg het dekglaasje er voorzichtig boven om luchtbelvorming te voorkomen.
- Verzegel het dekglaasje met nagellak.
- Plaats het hoornvlies op een objectglaasje, met het epitheel naar het objectglaasje gericht, en gebruik een scalpel om vier secties te maken zonder het midden te bereiken.
- Beeldvorming
- Plaats het objectglaasje onder een epifluorescerende microscoop.
- Definieer de grootte van het mozaïek en de diepte van de afbeelding en start de acquisitie.
- Pas een deblurring- en deconvolutieprogramma toe op de verkregen afbeelding.
OPMERKING: Stap 4.6.3 is een optie die is geselecteerd op de acquisitiesoftware (Large Volume Computational Clearing [LVCC])
5. Gelokaliseerde laserablatie van hoornvlieszenuwen
- Schakel de rechtopstaande multifotonenmicroscoop en de laser in combinatie met een optische parametrische oscillator in. Activeer de verwarmde tafel van de microscoop (37 °C) en stel de lasers in op 850 nm en 1100 nm, wat overeenkomt met de vereiste golflengten voor het muismodel.
- Gebruik een vermogensmeter om het vermogen van de lasers tegelijkertijd in te stellen op ongeveer 20 mW.
- Volg stap 1.4 om de muis voor te bereiden en breng oculaire gel aan op beide ogen.
OPMERKING: Het dier dat voor dit protocol wordt gebruikt, moet afkomstig zijn van een transgene muislijn (MAGIC-Marker transgene muis21) die een endogene fluorofoor tot expressie brengt in de zenuwvezels van het hoornvlies. - Installeer het dier in een kophouder. Draai het dier 90° zodat het oog van belang naar het plafond is gericht.
- Bind de vibrissae van het dier vast om het gebied rond de ogen vrij te maken. Bind het lichaam van het dier vast om de hoofdbeweging die door de ademhaling wordt veroorzaakt te verminderen.
- Plaats een cirkelvormig dekglaasje op het oog boven de oculaire gel. Het dekglaasje moet horizontaal zijn. Aarzel niet om de kop van het dier te verplaatsen om het dekglaasje correct te positioneren.
- Voeg een druppel PBS toe boven het dekglaasje. Plaats het dier voorzichtig op de microscooptafel en stel de objectieftoren op de juiste afstand in.
- Gebruik het waterige 20x objectief en de epifluorescentie om het oog en de innervatie door het oculair te lokaliseren.
- Activeer de lasers en definieer de diepte die moet worden verlicht.
- Verkrijg een afbeelding van 1024 x 1024 (pixels) met een acquisitiesnelheid van 70%-85% van de maximale scansnelheid.
- Zodra het beeld is verkregen, haalt u het dier van de microscoop en verwijdert u het dekglaasje en de riemen. Haal het dier uit de kophouder, voeg indien nodig meer oculaire gel toe en laat het wakker worden in een kooi op een verwarmde plaat.
OPMERKING: Vernietiging van de innervatie kan 1 week na de beeldvorming worden waargenomen. Dit protocol kan gedurende enkele weken eenmaal per week worden herhaald om de schade veroorzaakt door de lasers te vergroten. - Wanneer het dier zelfstandig beweegt, zet u de kooi terug in de stal en controleert u zijn welzijn voor de volgende 2 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze studie stelt verschillende protocollen voor voor het toebrengen van schade aan de innervatie van het hoornvlies bij muizen. Hoewel vergelijkbare protocollen zijn gebruikt om de fysiopathologie van de genezing van het epitheel te onderzoeken, hebben we ervoor gekozen om nieuwe methoden aan te passen en te ontwikkelen om de regeneratie van de innervatie van het hoornvlies te onderzoeken. Om de innervatie te observeren, gebruikten we twee technieken. Eerst gebruikten we een immunofluorescentietechniek om de zenuwvezels te kleuren met behulp van een pan-neuronaal antilichaam (BIII tubuline) en de kernen met een intercalator. Ten tweede hebben we geprofiteerd van een transgene muizenstam die fluorescerende eiwitten tot expressie brengt in de zenuwvezels. De hoornvliezen werden in beeld gebracht met behulp van een epifluorescerende microscoop.
De eerste methode maakte gebruik van een oogbraam met een roestringverwijderaar van 0,5 mm om de epitheellaag van het hoornvlies te verwijderen (figuur 1A). Deze studie richt zich op de schade die wordt toegebracht aan de innervatie in het epitheel als een middel om de cellulaire en moleculaire componenten te begrijpen die betrokken zijn bij de regeneratie ervan. Vóór de operatie was het basale epitheel intact. De zenuwvezels in de plexus subbasale vormden een typisch patroon dat de vortex wordt genoemd (Figuur 1B). De punt van de braam die bij deze techniek werd gebruikt, verwijderde alleen de eerste laag van het hoornvlies, maar behield zowel het stroma, waar grote bundels vezels zich bevinden, als het endotheel. Het deel van het epitheel dat door de braam was verwijderd, was gemakkelijk zichtbaar, omdat er een duidelijke breuk was van het basale epitheel en de subbasale plexus (figuur 1B). De kernen van de keratocyten kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd omdat ze schaars in het stroma zijn gerangschikt. Wat de innervatie betreft, was de grens ook duidelijk, met een breuk van de subbasale plexus waardoor de grote bundels vezels in het stroma te zien waren. Terwijl het ongeveer 3 dagen duurt voordat het epitheel is genezen, duurt regeneratie van de innervatie meer dan 4 weken na een schaafwond. Figuur 1 illustreert de regeneratie van het epitheel 1 week na de operatie, waarbij het basale epitheel glad is. De vortex is echter afwezig in het midden van het hoornvlies, aangezien de innervatie nog niet op dat punt is teruggekeerd.
De tweede methode bestaat uit het doorsnijden van de zenuwen aan de rand van het hoornvlies met een biopsiepons met een diameter van 2,5 mm in plaats van ze weg te borstelen met de braam (figuur 2A). Deze methode verstoort het epitheel niet zo veel als de slijtage. Na de operatie kan een dunne perifere ring worden waargenomen op het punt waar de biopsiepons is aangebracht, waardoor het basale epitheel wordt beschadigd (Figuur 2B). De zenuwen aan de periferie zijn echter doorgesneden, wat de Walleriaanse degeneratie van de axonen veroorzaakt. Dit type degeneratie bestaat uit het verval van zenuwen van het terminale uiteinde van de neuronen naar het cellichaam en, in dit geval, naar het gedeelte dat wordt geïnduceerd door de biopsiepons. Afhankelijk van de diepte van de axotomie kan de schade ernstig zijn. Hier zien we dat er een zware degeneratie is opgetreden, wat leidt tot een totaal verlies van innervatie in het midden van het hoornvlies in het epitheel (Figuur 2B). Aangezien innervatie essentieel is voor het behoud van de homeostase van het epitheel, wordt een desintegratie van de epitheellaag geïnitieerd, waardoor een zweer ontstaat (figuur 2B). Zweervorming vond alleen plaats bij zwaar beschadigde hoornvliezen.
De laatste techniek bestaat uit het in vivo lokaal verbranden van de hoornvlieszenuwen van verdoofde transgene muizen met een multifotonenmicroscoop (Figuur 3A). Het eerste beeld wordt verkregen op de locatie waar de verbranding zal worden gemaakt. Deze studie gebruikte een transgene muis waarvan de innervatie fluorescerende eiwitten tot expressie brengt. Het beeld werd verkregen in het midden van het hoornvlies, waar de vortex zich bevindt (Figuur 3B), van de bovenkant van het epitheel tot het middenstroma. De vortex is 1 week na de eerste beeldacquisitie niet meer zichtbaar. In plaats daarvan is een groep immuuncellen gemigreerd naar de verlichtingsplaats, waar we de bundel vezels in het stroma kunnen identificeren, die na de eerste acquisitie dunner zijn geworden (Figuur 3B).
Figuur 1: Oogbraam en voorbeeld van innervatie van het hoornvlies na slijtage. (A) Een oftalmologische braam met een roestringverwijderaar van 0,5 mm werd gebruikt om de slijtage te maken. (B) Voorbeelden van ontlede en immunogekleurde hoornvliezen. Pre-slijtagebeelden illustreren het gladde basale epitheel en de vortex (witte pijlpunt) in het midden. Post-abrasie beelden tonen een duidelijke afbakening van de subbasale plexus, die werd verwijderd (rode pijlpunten). Beelden verkregen 1 week na slijtage (1WPAbr) laten zien waar de vezels regenereren (oranje pijlpunt). De innervatie is gekleurd met anti-BIII tubuline-antilichaam (groen). De kernen worden gekleurd met een DNA-intercalator (paars). De beelden zijn gemaakt met een epifluorescerende microscoop. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Biopsiepons en voorbeeld van cornea-innervatie na axofomie. (A) Een steriele biopsiepons met een diameter van 2,5 mm wordt op het oog aangebracht om een axotomie te induceren. (B) Voorbeelden van ontlede en immunogekleurde hoornvliezen. Pre-axomiebeelden illustreren de aanwezigheid van de vortex in het midden van het hoornvlies (witte pijlpunt). Post-axomiebeelden tonen de ring (rode pijlpunten) die wordt gecreëerd door de pons in het epitheel. Beelden verkregen 2 weken na axotomie (2WPAx) illustreren de vorming van de zweer (oranje pijlpunt). De innervatie is gekleurd met BIII tubuline (groen). De kernen zijn gekleurd met een intercalator (paars). De beelden zijn gemaakt met een epifluorescerende microscoop. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Opstelling voor cauterisatie van de hoornvlieszenuw door lasers en een voorbeeld (A) De verdoofde MAGIC-Marker transgene muis21 wordt onderhouden door de hoofdhouder en zijn oog is gericht op het 20x objectief van het bifoton. Het lichaam van de muis is vastgebonden om ademhalingsbewegingen tijdens het verwerven te voorkomen. (B) Driedimensionale (3D) weergave van de eerste verwerving van de vortex met behulp van de golflengten 850 nm en 1100 nm gelijktijdig vóór de fotoschade en 1 week na de fotoschade (1WPPhDa) op dezelfde locatie van de vortex. De lasers induceerden migratie van immuuncellen (pijlpunt) waar de vortex zich bevond. Schaalbalken = 80 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Techniek | Beïnvloede structuur | Mate van impact (+/-) | Soort onderzoek | Genezingsperiode |
| Afschaving | Epitheel | ++ | Epitheel en regeneratie van innervatie | Epitheel <1 week Innervatie >2 maanden |
| Innervatie | ++ | |||
| Axotomie | Epitheel | +/- | Innervatieregeneratie Neurotrofe keratitis | Innervatie >2 maanden NK >2 weken |
| Stroma | +/- | |||
| Innervatie | ++ | |||
| Zenuw cauterisatie | Epitheel | + (lokaal) | Lokale innervatieregeneratie Neurotrofe keratitis | Afhankelijk van de frequentie van cauterisatie |
| Stroma | ||||
| Innervatie |
Tabel 1: Vergelijking van de drie voorgestelde strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurotrofe keratitis wordt beschouwd als een zeldzame ziekte, die 5 op de 10.000 personen treft. Mensen die lijden aan NK als gevolg van een lichamelijk letsel zoals chemische brandwonden, of syndromen zoals diabetes of multiple sclerose, worden echter niet opgenomen in die statistieken3. Bovendien blijft deze aandoening aanzienlijk ondergediagnosticeerd22 en wordt de prevalentie van de ziekte onderschat. Er is een sterke behoefte aan nieuwe behandelingen en therapieën die de regeneratie van axonen bevorderen als middel om het gezichtsvermogen van patiënten te behouden. Momenteel is de enige beschikbare behandeling die wordt aangeboden aan patiënten die lijden aan de vroege stadia van NK de toepassing van farmacologische oogdruppels 23,24,25 die de regeneratie van de hoornvlieszenuw ondersteunen. Deze zijn echter slechts tot op zekere hoogte effectief. In geval van ernstigere veranderingen van het hoornvlies, zoals zweren, bieden vruchtwatertransplantatie of keratoplastiek 3,4 een tijdelijke oplossing om de wond te sluiten en infectie te voorkomen. Deze transplantaten moeten echter na een beperkte tijd worden vervangen, waarbij het risico op afstoting bij elke volgende procedure toeneemt.
Dit rapport presenteert verschillende modellen die verschillende vormen van NK samenvatten die vaak in de kliniek worden aangetroffen (tabel 1). Deze kunnen worden gebruikt om onze kennis van hoornvliesinnervatie te verdiepen en alternatieven voor de huidige behandelingen te onderzoeken. Het slijtagemodel kan in verband worden gebracht met PRK-chirurgie, aangezien het de langzame hergroei van de innervatie recapituleert, die optreedt na de genezing van het geschaafde epitheel. In zijn voordeel kan deze techniek relatief gemakkelijk worden aangeleerd en gereproduceerd wanneer de juiste druk met de oogbraam wordt uitgeoefend en een regelmatig geschuurd gebied wordt gecreëerd. Bovendien kan deze techniek worden aangepast aan de specifieke behoeften van elke patiënt of aan de interesse van de gebruiker door de grootte van het geschuurde gebied te kiezen.
De axotomie is vergelijkbaar met de lamellaire keratoplastiek die wordt ondergaan door patiënten die lijden aan NK26 in een laat stadium. Het maakt onderzoek mogelijk naar de degeneratie van de vezels (Walleriaanse degeneratie) en de herkolonisatie van de axonen in het centrale hoornvlies. Hoewel het materiaal dat nodig is om de operatie uit te voeren relatief eenvoudig is, moet de arts worden getraind in de juiste techniek, met name de juiste toepassing van druk en het juiste aantal omwentelingen met de biopsiepons. In het kader van een keratoplastiek wordt de diepte van de incisie nauwkeurig bepaald door het gebruik van een trephine-apparaat en intraoperatieve optische coherentietomografie, welke technieken niet kunnen worden aangepast aan muizenmodellen17. Een ander verschil met keratoplastiek is de afwezigheid van donortransplantatie in de hier beschreven techniek, aangezien we alleen de incisie van het hoornvlies hebben uitgevoerd. Dit model is interessant vanwege de aanwezigheid van een gezond epitheel waarin de innervatie terug moet groeien. Dit onderscheidt het van het schuurmodel, waarbij het epitheel wordt verwijderd met de innervatie.
De zenuwcauterisatietechniek, met behulp van een multifotonenmicroscoop, bootst de schade na die wordt veroorzaakt door zonnebrand, maar doet dit op een gelokaliseerd deel van het hoornvlies, waardoor DNA-schade en ROS-vorming worden veroorzaakt19,20. Met deze methode is het mogelijk om de regeneratie van de vezels vanaf verschillende locaties op het hoornvlies te bestuderen en zelfs om cauterisatie in hetzelfde gebied meerdere keren te herhalen, waardoor de impact op axongroei en migratie van immuuncellen kan worden geëvalueerd.
Deze drie protocollen bieden de mogelijkheid om de fundamentele aspecten van axonale hergroei te bestuderen door de regeneratieve mechanismen te onderzoeken, evenals de interacties tussen de verschillende celtypen die aanwezig zijn in het hoornvlies en de innervatie. Deze methoden bieden ook een middel om de regeneratie van axonen te bevorderen door toepassing van nieuwe farmacologische moleculen24 of gentherapie27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs danken Dr. Karine Loulier voor de toegang tot de transgene muislijn MAGIC-Markers. De auteurs bedanken ook de RAM-Neuro dierlijke kernfaciliteit en de beeldvormingsfaciliteit MRI, een lid van de nationale infrastructuur France-BioImaging die wordt ondersteund door het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR-10-INBS-04, "Investeringen voor de toekomst"). Dit onderzoek werd ondersteund door het ATIP-Avenir-programma, Inserm, Région Occitanie, de Universiteit van Montpellier, het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR-21-CE17-0061), de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) en de Groupama Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
- Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L.
- Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
- Dua, H. S., et al.
- Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A.
- Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
- Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
- Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
- Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
- Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
- Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
- He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
- Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
- Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
- Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
- Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
- Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
- Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
- Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S.
- Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).
