Summary
여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.
Abstract
각막은 눈을 덮고 있는 투명한 조직으로 선명한 시력에 매우 중요합니다. 그것은 신체에서 가장 신경 분포가 심한 조직입니다. 이 신경 분포는 눈에 감각과 영양 기능을 제공하고 각막을 온전하게 보존하는 데 기여합니다. 이러한 신경 분포의 병리학적 파괴를 신경 영양성 각막염이라고 합니다. 이것은 눈 부상, 수술 또는 질병에 의해 유발될 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 클리닉에서 일반적으로 접하는 세 가지 유형의 사례를 요약하는 방식으로 신경 자극에 손상을 입히기 위한 세 가지 프로토콜을 제안합니다.
첫 번째 방법은 안과 버로 상피를 마모시키는 것입니다. 여기에는 상피층, 자유 신경 말단 및 기저하 신경총을 제거하는 것이 포함되며 클리닉에서 수행되는 광굴절 각막 절제술 수술과 유사한 방식으로 수행됩니다. 두 번째 방법은 상피의 무결성을 유지하면서 생검 펀치로 주변부를 절개하여 신경 분포만을 표적으로 합니다. 이 방법은 라멜라 각막 성형술의 첫 번째 단계와 유사하며 신경 분포의 퇴화와 중앙 각막의 축삭의 재성장으로 이어집니다. 마지막 방법은 형광 신경 섬유의 소작 부위를 특이적으로 국소화하는 다광자 현미경을 사용하여 형질전환 마우스 모델의 신경 분포를 손상시킵니다. 이 방법은 자외선에 과도하게 노출되는 광각막염과 동일한 손상을 입힙니다.
이 연구는 각막 신경 분포의 생리병리학, 특히 축삭의 퇴화 및 재생을 조사하기 위한 다양한 옵션을 설명합니다. 재생을 촉진하는 것은 상피 결손이나 각막 천공과 같은 합병증을 피하는 데 매우 중요합니다. 제안된 모델은 신경 재생을 강화하고 질병 진행을 제한하는 새로운 약리학적 분자 또는 유전자 요법을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
눈의 투명한 표면인 각막은 상피, 기질, 내피의 세 가지 층으로 구성되어 있습니다. 이 기관은 신체에서 가장 높은 밀도의 신경 분포를 가지며 주로 삼차 신경절의 안과 분지에서 유래한 감각 섬유(Aδ 및 C 유형)로 구성됩니다. 감각 섬유는 간질 중간의 각막 주변부를 뚫고 표면을 덮기 위해 가지를 뻗는 큰 다발 형태로 침투합니다. 그런 다음 두 갈래로 갈라져 보우만 막을 뚫고 각막 중앙에 소용돌이가 형성되어 쉽게 알아볼 수 있는 기저하신경총을 형성합니다. 이러한 섬유는 상피의 외부 표면에서 자유 신경 말단으로 끝납니다. 그들은 열적, 기계적, 화학적 자극을 전달하고 상피 항상성에 필수적인 영양 인자를 방출할 수 있습니다 1,2. 신경영양성 각막염(NK)은 각막 감각 신경 분포에 영향을 미치는 퇴행성 질환입니다. 이 희귀 질환은 각막 민감도가 감소하거나 상실되어 눈물 생성이 감소하고 각막의 치유 특성이 저하되기 때문에 발생한다3. NK는 상피 결손이 생기는 1기부터 기질 융해 및/또는 각막 천공이 발생하는 3기까지 3단계로 진행된다4.
임상적으로 이 질병의 기원은 다양할 수 있습니다. 환자는 눈의 신체적 손상, 수술 또는 당뇨병과 같은 만성 질환을 통해 각막 신경 분포를 잃을 수 있습니다 5,6. 현재까지 NK의 발병 과정은 잘 알려져 있지 않으며, 시력을 위협하는 이 질환에 대한 치료 옵션은 매우 제한적입니다. 따라서 상피 결손의 특성을 더 잘 이해하여 이러한 섬유의 재생 이면에 있는 메커니즘을 더 잘 이해하고 잠재적으로 촉진할 수 있습니다. 여기서는 생쥐에서 NK를 유발하는 각막 손상의 몇 가지 모델을 제안합니다.
첫 번째 모델은 안구 버가 있는 각막 상피층의 찰과상입니다. 이 모델은 주로 설치류 및 어류와 같은 다른 동물에서 상피의 재생과 관련하여 연구되었습니다 7,8,9 및 각막 치유를 촉진하는 분자10,11을 테스트하기 위해 연구되었습니다. 생리학적으로 상피 세포가 상처를 봉합하는 데 2-3일이 걸립니다. 그러나 신경 분포의 생리적 패턴은 찰과상으로부터 회복하는 데 4주 이상이 걸린다12,13. 수술 중에 안구 버는 기저부 신경총과 섬유의 자유 신경 말단을 포함하는 각막의 상피층을 제거합니다. 이 시술은 눈의 굴절 결손을 교정하기 위해 광굴절 각막절제술(PRK)을 받은 환자와 임상적으로 비교할 수 있습니다. 이 시술은 각막의 상피를 제거한 후 레이저(14)로 기질을 재형성하는 것으로 구성된다. 환자는 수술 후 2년 동안 각막 신경 밀도가 감소하고 수술 후 3개월에서 1년 동안 민감도가 감소하는 등 여러 가지 부작용을 경험할 수 있다15. 수술이 각막 미세환경의 취약성을 유발한다는 점을 감안할 때, 이 모델은 이러한 부작용을 조사하고 더 빠른 신경 재형성을 촉진하여 문제의 부작용을 줄이는 치료 접근법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.
두 번째 모델은 생검 펀치로 각막 주변부의 축삭돌기를 절단하여 중심 신경 분포( 16)의 월러리안 변성을 유도하는 것으로 구성된다. 임상적으로 이 방법은 전방 판상 각막 성형술과 비교할 수 있는데, 이 경우 외과의는 각막의 전방 두께의 일부를 제거하고 이를 기증자 이식으로 대체하기 위해 각막의 부분적인 트레피레이션을 실현한다 17. 판상 각막 성형술 후 환자는 안구 건조증, 각막 신경 분포 상실, 이식 거부 반응 등 여러 가지 증상을 겪을 수 있다18. 각막 신경에 수행된 이 축삭 절제술 모델은 이식 후 발생하는 섬유 퇴행과 축삭돌기 재생의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
세 번째 방법은 레이저로 각막 신경을 손상시키는 것입니다. 마취된 동물의 각막에 다광자 현미경을 사용함으로써, 활성산소종(ROS) 형성의 결과로 광학계에 국한된 신경의 퇴화가 유도되어 DNA 손상과 세포 공동현상을 유발한다19. 이 방법은 자연 자외선(일광 화상)에 과다 노출되어 유발된 각막 광손상을 재현하며, 이는 또한 ROS 형성을 유발하여 DNA 손상을 유발합니다20. 각막 햇볕에 화상을 입은 환자는 상피 세포의 악화로 인해 각막 섬유의 말단을 모두 빼앗기기 때문에 큰 통증을 경험합니다.
여기에 설명된 세 가지 방법은 NK 발병 과정과 축삭 재생을 조사할 수 있도록 설계되었습니다. 쉽게 재현 가능하고 정확합니다. 또한 빠른 회복과 동물의 쉬운 모니터링이 가능합니다.
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Protocol
모든 실험은 국립 동물 실험 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 준비
- 마취를 위해 케타민-자일라진 마취액을 준비합니다. 멸균 0.9% NaCl 2,175mL에 케타민(100mg/mL) 200μL와 자일라진 125μL(20mg/mL)를 희석하여 케타민 80mg/kg, 자일라진 10mg/kg을 주입합니다.
- 멸균 0.9% NaCl 1,400mL에 0.3mg/mL 부프레노르핀 100μL를 첨가하여 진통제로 0.02mg/mL 부프레노르핀 용액을 준비합니다.
- 형광 염색 용액을 준비합니다.
- 미세한 저울을 사용하여 10mg의 플루오레세인 염을 칭량하고 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석하여 0.1% 플루오레세인 용액을 얻습니다.
- 용액을 빛으로부터 보호하고 5분 동안 흔듭니다. 10mL 주사기와 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
알림: 형광 용액은 빛으로부터 보호되어야 하며 +4°C에서 5일 동안 보관할 수 있습니다.
- 마우스 준비
- 마우스의 무게를 잰 후 마취액의 마우스 무게(MW) 10μL/g을 복강내 주사하여 마취를 유도합니다. 마우스가 움직임을 멈추면 가열판(37°C) 위에 놓고 발가락을 꼬집어 완전히 마취되었는지 확인합니다.
- 수술을 받는 눈에 인공 눈물 한 방울을 바르고 반대쪽 눈에 안구 젤 한 방울을 바릅니다.
- 마우스가 꼬집음에 반응하지 않으면 진통제(0.02mg/mL 부프레노르핀)를 5μL/g의 MW로 주사하여 목에 0.1mg/kg 부프레노르핀을 피하로 제공합니다.
2. 각막의 마모
- 1.3단계에 따라 형광 염색 용액을 준비합니다.
- 1.4단계에 따라 마우스를 준비합니다.
- 마모를 하기 전에 안구 버를 70% EtOH에 담근 다음 PBS에 담가 청소합니다.
- 마우스를 측면의 가열판(37°C)에 올려 놓으면 수술 중인 눈에 쉽게 접근할 수 있습니다.
- 면봉을 사용하여 인공 눈물을 흡수하고 눈을 만지지 않고 속눈썹을 빗어냅니다.
- 안구 버를 켜고 두 손가락으로 쥐의 눈꺼풀을 열고 동시에 비브리새를 차단하여 버에 끼지 않도록 합니다.
- 동공이나 눈의 중심을 국소화하고 눈 표면에 안구 버를 바르고 원을 그리며 움직입니다. 자세히 보면 제거된 상피의 표면을 관찰할 수 있습니다. 그렇지 않으면 각막을 약 20회 원을 그리며 움직입니다.
- 마우스를 다시 배에 대고 안구 젤이 반대쪽 눈에 여전히 존재하는지 확인합니다.
- 마모된 눈에 형광 염색액 한 방울을 떨어뜨리고 20초 동안 기다립니다. 눈을 만지지 않고 티슈로 물방울을 흡수하고 인공 눈물 한 방울로 헹굽니다. 인공 눈물의 물방울을 티슈로 흡수하고 블루 코발트 램프로 눈을 비춥니다.
알림: 마모는 원형 모양이어야 합니다. 그것을 얻으려면 약간의 훈련이 필요합니다. - 긁힌 눈에 안구 젤 한 방울을 바르고 가열된 패드에서 쥐를 깨우십시오. 마우스가 스스로 움직이면 케이지에 다시 넣으십시오.
- 다음 2일 동안 동물의 안녕을 확인하십시오.
- 안구 버를 사용한 후 연조직을 사용하여 버 머리에 붙어있는 상피 세포를 제거하고 70% EtOH에 담근 다음 PBS에 담그십시오.
알림: 연조직으로 상피세포를 제거한 후 버 머리에 조직 조각이 끼지 않았는지 확인하십시오.
3. 각막 신경의 축삭 절제술
- 1.4단계에 따라 마우스를 준비합니다.
- 측면의 쌍안경 확대경 아래에 마우스를 놓아 수술을 받는 눈에 접근합니다. 페트리 접시의 바닥을 마우스 머리 아래에 놓아 눈이 수평이 되도록 합니다.
알림: 다음 단계는 쌍안경 확대경을 통해 수행됩니다. - 면봉으로 인공 눈물을 제거하고 눈을 만지지 않고 속눈썹을 제거합니다.
- 동물이 궤도에서 튀어나오도록 동물의 눈 아래에 부드러운 곡선 펜치를 놓습니다. 압력이 가해지면 눈이 안와로 돌아갈 수 없을 만큼 펜치를 닫되 시신경 손상을 방지하기 위해 과도하게 닫지 마십시오.
- 펀치가 각막 표면에 완전히 닿도록 2.5mm의 생검 펀치를 압력 없이 눈에 수직으로 적용합니다.
알림: 펀치가 각막에 가해지면 실험자의 손이 시야를 방해할 수 있습니다. - 그런 다음 압력을 가하기 시작하고 펀치를 여러 번 비틀십시오.
알림: 압력에 따라 비틀림 횟수가 다를 수 있지만 일반적으로 약 5회입니다. 적절한 압력과 움직임을 느끼기 위해서는 훈련이 필요합니다. 너무 많은 압력이 가해지면 눈이 파열됩니다. 이 경우 액체가 병변에서 빠져나가는 것을 관찰할 수 있으며 눈이 부드러워집니다. 동물은 희생되어야 한다. - 생검 펀치를 제거합니다. 생검 펀치가 적용된 각막에 원이 보여야 합니다.
참고: 다음 단계에는 쌍안 확대경이 필요하지 않습니다. - 반대쪽 눈에 여전히 안구 젤이 있는지 확인하고 축삭 절제술 된 눈에 약간 바릅니다.
- 가열된 패드(37°C)에서 마우스를 깨우고 스스로 움직일 때 케이지에 다시 넣습니다.
- 다음 2일 동안 동물의 안녕을 확인하십시오.
4. 각막 전체 마운트 처리
- 샘플 수집 및 고정.
- 마우스의 무게를 측정하고 마취액의 마우스 무게(MW) 10μL/g을 복강내 주사하여 마취를 유도합니다.
- 마우스가 움직임을 멈추고 발가락 꼬집음에 의한 반사가 없으면 경추 탈구를 수행합니다.
- 두 손가락을 사용하여 안와 밖으로 눈을 빼내고 구부러진 가위로 시신경을 절단하여 눈을 적출합니다.
- PBS가 들어 있는 2mL 플라스틱 튜브에 눈을 넣습니다.
- PBS를 4% 파라포름알데히드로 교체하고 실온(RT)에서 셰이커(30rpm)에 올려 20분 동안 눈을 고정합니다.
- 셰이커(3rpm)에서 RT에서 PBS로 10분 동안 30회 헹굽니다.
- 각막 해부
- 페트리 접시 안의 파라필름 조각에 PBS 한 방울을 떨어뜨립니다.
- 이 PBS 방울에 눈을 놓으십시오.
- 쌍안경 확대경 아래에 페트리 접시를 놓습니다.
- 미세 해부 가위와 집게를 사용하여 각막을 절개합니다. 변두를 유지하기 위해 섬모체 위를 자릅니다.
- 미세한 집게로 수정체, 섬모체, 홍채를 제거합니다.
- 각막을 2mL 플라스틱 튜브에 다시 넣습니다.
- 면역형광 프로토콜
- 각막을 PBS의 2.5% 생선 껍질 젤라틴, 5% 염소 혈청 및 0.5% 세제 2mL에 넣고 셰이커(30rpm)의 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- 1/1000(anti βIII 튜불린 항체)으로 희석한 1차 항체를 포함하는 PBS에서 2.5% 어피 젤라틴, 5% 염소 혈청 및 0.1% 세제 용액 150μL에 각막을 배양합니다(항 βIII 튜불린 항체).
- 셰이커(3rpm)에서 RT에서 PBS의 0.1% 세제로 1시간 동안 30회 헹굽니다.
- 4.3.2단계와 동일한 용액에 각막을 배양하고, 2차 항체를 셰이커(30rpm)에서 4°C에서 하룻밤 동안 1/500으로 희석합니다.
- Shaker(3rpm)에서 RT에서 PBS로 1시간 동안 30회 헹굽니다.
- 셰이커(30rpm)에서 RT에서 1/5000으로 희석한 150μL의 DNA 인터컬레이터로 10분 동안 각막을 배양합니다.
- PBS로 5분 동안 2회 헹굽니다.
- 각막 장착
- 각막을 슬라이드에 놓고 상피가 슬라이드를 향하도록 하고 메스를 사용하여 중앙에 도달하지 않고 4개의 섹션을 만듭니다.
알림: 꽃 모양을 만들기 위해 서로 반대쪽 섹션을 수행하십시오. - 각막 내피를 슬라이드를 향하게 놓고 티슈를 사용하여 각막 주위의 PBS를 제거합니다.
알림: 각막 아래의 PBS를 제거하지 마십시오. 그렇지 않으면 기포가 나타날 수 있습니다. 그렇다면 각막에 PBS를 추가하고 기포를 제거하십시오. 그런 다음 4.3.2단계부터 다시 시작합니다. - 직사각형 커버 슬립의 네 모서리에 모델 페이스트를 추가하십시오.
알림: 모델 페이스트는 각막이 두꺼운 조직이기 때문에 커버슬립을 올립니다. - 각막에 장착 배지 50μL를 떨어뜨리고 기포가 형성되지 않도록 위에 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.
- 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.
- 각막을 슬라이드에 놓고 상피가 슬라이드를 향하도록 하고 메스를 사용하여 중앙에 도달하지 않고 4개의 섹션을 만듭니다.
- 이미징
- 슬라이드를 형광 현미경 아래에 놓습니다.
- 모자이크의 크기와 이미지의 깊이를 정의하고 수집을 시작합니다.
- 획득한 이미지에 디블러링(deblurring) 및 디콘볼루션(deconvolution) 프로그램을 적용합니다.
참고: 4.6.3단계는 수집 소프트웨어(LVCC[Large Volume Computational Clearing])에서 선택한 옵션입니다.
5. 각막 신경의 국소 레이저 절제
- 정립 다광자 현미경과 광학 파라메트릭 발진기와 결합된 레이저를 켭니다. 현미경의 가열 스테이지(37°C)를 활성화하고 마우스 모델에 필요한 파장에 해당하는 850nm 및 1100nm로 레이저를 설정합니다.
- 파워 미터를 사용하여 레이저의 파워를 약 20mW로 동시에 설정합니다.
- 1.4단계에 따라 마우스를 준비하고 양쪽 눈에 안구 젤을 바릅니다.
참고: 이 프로토콜에 사용되는 동물은 각막 신경 섬유에서 내인성 형광단을 발현하는 형질전환 마우스 계통(MAGIC-Marker 형질전환 마우스21)에서 유래해야 합니다. - 헤드 홀더에 동물을 설치하십시오. 관심 있는 눈이 천장을 향하도록 동물을 90° 돌립니다.
- 눈가를 깨끗하게 하기 위해 동물의 vibrissae를 끈으로 묶습니다. 동물의 몸에 끈을 묶어 호흡으로 인한 머리 움직임을 줄입니다.
- 안구 젤 위의 눈에 원형 커버슬립을 놓습니다. 커버슬립은 수평이어야 합니다. 커버슬립이 올바른 위치에 놓이도록 동물의 머리를 움직이는 것을 주저하지 마십시오.
- 커버슬립 위에 PBS 한 방울을 추가합니다. 동물을 현미경 스테이지에 조심스럽게 놓고 대물 포탑을 적절한 거리에 설정합니다.
- 수성 20x 대물렌즈와 형광을 사용하여 접안렌즈를 통해 눈과 신경 분포의 위치를 파악합니다.
- 레이저를 활성화하고 조명해야 하는 깊이를 정의합니다.
- 최대 스캔 속도의 1024%-70%의 획득 속도로 85 x 1024(픽셀) 이미지를 획득합니다.
- 이미지가 획득되면 현미경에서 동물을 꺼내고 커버슬립과 스트랩을 제거합니다. 머리 홀더에서 동물을 꺼내고 필요한 경우 안구 젤을 더 추가하고 가열된 판의 케이지에서 깨어나게 합니다.
참고: 신경 분포의 파괴는 이미징 후 1주일 후에 관찰할 수 있습니다. 이 프로토콜은 레이저로 인한 손상을 증가시키기 위해 몇 주 동안 일주일에 한 번 반복될 수 있습니다. - 동물이 스스로 움직일 때 케이지를 마구간에 다시 넣고 다음 2일 동안 잘 지내는지 확인하십시오.
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Representative Results
이 연구는 생쥐의 각막 신경 분포에 손상을 입히기 위한 몇 가지 프로토콜을 제안합니다. 상피 치유의 생리병리학을 조사하기 위해 유사한 프로토콜이 사용되었지만, 우리는 각막 신경 분포 재생을 조사하는 새로운 방법을 채택하고 개발하기로 결정했습니다. 신경 분포를 관찰하기 위해 두 가지 기술을 사용했습니다. 먼저, 면역형광 기법을 사용하여 범 뉴런 항체(BIII tubulin)와 인터컬레이터로 핵을 사용하여 신경 섬유를 염색했습니다. 둘째, 신경 섬유에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 마우스 균주를 활용했습니다. 각막은 형광 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다.
첫 번째 방법은 각막 상피층을 제거하기 위해 0.5mm의 녹 고리 제거제가 있는 안과용 버를 사용했습니다(그림 1A). 이 연구는 재생에 관련된 세포 및 분자 구성 요소를 이해하는 수단으로 상피 내부에 위치한 신경 분포에 가해지는 손상에 중점을 둡니다. 수술 전에는 기저 상피가 온전했습니다. 기저신경총하(subbasal plexus)의 신경 섬유는 소용돌이(vortex)라고 불리는 전형적인 패턴을 형성했습니다(그림 1B). 이 기술에 사용된 버의 끝은 각막의 첫 번째 층만 제거했지만 큰 섬유 다발이 있는 기질과 내피는 모두 보존했습니다. 버에 의해 제거된 상피 부분은 기저 상피와 기저신경총이 명확하게 파열되어 있었기 때문에 쉽게 볼 수 있었습니다(그림 1B). 각질세포의 핵은 기질 전체에 드문드문 배열되어 있기 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다. 신경 분포와 관련하여, 경계도 명확했으며, 기저하 신경총이 파열되어 기질 내부의 큰 섬유 다발을 볼 수 있었습니다. 상피가 치유되는 데 약 3일이 걸리지만 신경 분포 재생은 찰과상 후 4주 이상 걸립니다. 그림 1 은 수술 후 1주일 후의 상피 재생을 보여주며, 기저 상피는 매끄럽습니다. 그러나 소용돌이는 신경 분포가 아직 그 지점으로 돌아 오지 않았기 때문에 각막의 중심에는 없습니다.
두 번째 방법은 각막 주변부의 신경을 버로 털어내는 대신 직경 2.5mm의 생검 펀치로 절개하는 것입니다(그림 2A). 이 방법은 마모만큼 상피를 파괴하지 않습니다. 수술 후 생검 펀치가 적용된 지점에서 얇은 주변 고리가 관찰되어 기저 상피가 손상될 수 있습니다(그림 2B). 그러나 말초의 신경이 절단되어 축삭돌기의 월러식 퇴화를 촉발했습니다. 이러한 유형의 퇴행은 뉴런의 말단 말단에서 세포체를 향한 신경의 붕괴로 구성되며, 이 경우 생검 펀치에 의해 유도된 부분을 향해 붕괴됩니다. 축삭 절개술의 깊이에 따라 손상이 심각할 수 있습니다. 여기에서 우리는 심한 퇴행이 발생하여 상피의 각막 중앙에서 신경 분포가 완전히 소실되었음을 알 수 있습니다(그림 2B). 신경 분포는 상피 항상성의 유지에 필수적이기 때문에 상피층의 붕괴가 시작되어 궤양이 발생합니다(그림 2B). 궤양 형성은 심하게 손상된 각막에서만 발생했습니다.
마지막 기술은 다광자 현미경으로 마취된 형질전환 마우스의 각막 신경을 생체 내에서 국소적으로 태우는 것입니다(그림 3A). 첫 번째 이미지는 굽기가 이루어질 위치에서 획득됩니다. 이 연구는 신경 분포가 형광 단백질을 발현하는 형질전환 마우스를 사용했습니다. 이미지는 소용돌이가 위치한 각막 중앙(그림 3B)에서 상피 상단에서 중간 기질까지 획득되었습니다. 소용돌이는 첫 번째 이미지 획득 후 1주일이 지나면 더 이상 보이지 않습니다. 대신, 면역 세포 그룹이 조명 부위로 이동했으며, 여기서 첫 번째 획득 후 얇아진 기질의 섬유 다발을 식별할 수 있습니다(그림 3B).
그림 1: 안구 버와 찰과상 후 각막 신경 분포의 예. (A) 0.5mm의 녹 고리 제거제가 있는 안과 버를 사용하여 마모를 만들었습니다. (B) 절개 및 면역염색된 각막의 예. 마모 전 이미지는 중앙의 매끄러운 기저 상피와 소용돌이(흰색 화살촉)를 보여줍니다. 마모 후 이미지는 제거된 기저하신경총(빨간색 화살촉)의 명확한 경계를 보여줍니다. 마모 후 1주일(1WPAbr)에 획득한 이미지는 섬유가 재생되는 위치(주황색 화살촉)를 보여줍니다. 신경 분포는 항-BIII 튜불린 항체(녹색)로 염색됩니다. 핵은 DNA 인터컬레이터(보라색)로 염색됩니다. 이미지는 epifluorescent 현미경으로 획득되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 생검 펀치 및 축삭 절개술 후 각막 신경 분포 의 예. (A) 2.5mm 직경의 멸균 생검 펀치를 눈에 적용하여 축삭 절개술을 유도합니다. (B) 절개 및 면역염색된 각막의 예. 축삭 절개술 전 이미지는 각막 중앙에 소용돌이가 있는 것을 보여줍니다(흰색 화살촉). 축삭 절개술 후 이미지는 상피의 펀치에 의해 생성된 고리(빨간색 화살촉)를 보여줍니다. 축삭 절개술 후 2주에 획득한 이미지(2WPAx)는 궤양(주황색 화살촉)의 형성을 보여줍니다. 신경 분포는 BIII 튜불린(녹색)으로 염색됩니다. 핵은 인터컬레이터(보라색)로 염색됩니다. 이미지는 epifluorescent 현미경으로 획득되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 레이저에 의한 각막 신경 소작을 위한 설정 및 예 (A) 마취된 MAGIC-Marker 형질전환 마우스(21 )는 헤드 홀더에 의해 유지되며, 눈은 이광자의 20x 대물렌즈를 향하고 있습니다. 마우스의 몸체는 획득 중 호흡 움직임을 피하기 위해 묶여 있습니다. (B) 소용돌이의 동일한 위치에서 광손상 전과 광손상 후 1주일(1WPPhDa) 파장 850nm와 1100nm를 동시에 사용하여 소용돌이의 첫 번째 획득에 대한 3차원(3D) 보기. 레이저는 소용돌이가 있는 곳에 면역 세포(화살촉)의 이동을 유도했습니다. 스케일 바 = 80 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 기술 | 영향을 받은 구조물 | 충격 정도(+/-) | 연구 유형 | 치유 기간 |
| 마모 | 상피 | ++ | 상피와 신경 재생 | 상피 <1주 신경 분포 >2개월 |
| 신경 분포 | ++ | |||
| 액소토미(Axotomy) | 상피 | +/- | 신경 자극 재생 신경 영양 각막염 | 신경 분포 >2 개월 NK > 2 주 |
| 기질 | +/- | |||
| 신경 분포 | ++ | |||
| 신경 소작 | 상피 | +(로컬) | 국소 신경 자극 재생 신경 영양성 각막염 | 소작의 빈도에 따라 |
| 기질 | ||||
| 신경 분포 |
표 1: 제안된 세 가지 전략 비교.
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Discussion
신경영양성 각막염은 10,000명 중 5명에게 영향을 미치는 희귀 질환으로 간주됩니다. 그러나 화학적 화상과 같은 신체적 손상이나 당뇨병, 다발성 경화증과 같은 증후군으로 인해 NK를 앓고 있는 사람은 이러한 통계에 포함되지 않는다3. 더욱이, 이 질환은 여전히 현저하게 과소 진단되고있으며22 이 질병의 유병률은 과소평가되고 있다. 환자의 시력을 보존하는 수단으로 축삭 재생을 촉진하는 새로운 치료법과 치료법이 절실히 필요합니다. 현재 NK의 초기 단계인 환자에게 제공되는 유일한 치료법은 각막 신경 재생을 지원하는 약리학적 점안액 23,24,25를 사용하는 것입니다. 그러나 이것들은 특정 지점까지만 효과적입니다. 궤양과 같은 각막의 더 심각한 변형의 경우, 양막 이식 또는 각막 성형술 3,4은 상처를 봉합하고 감염을 피하기 위한 일시적인 해결책을 제공합니다. 그러나 이러한 이식편은 제한된 시간 후에 교체해야 하며 추가 시술을 받을 때마다 거부 반응의 위험이 증가합니다.
이 보고서는 임상에서 흔히 접할 수 있는 다양한 형태의 NK를 요약한 몇 가지 모델을 제시한다(표 1). 이는 각막 신경 분포에 대한 지식을 심화하고 현재 치료법에 대한 대안을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 마모 모델은 마모된 상피가 치유된 후 발생하는 신경 분포의 느린 재성장을 재현한다는 점에서 PRK 수술과 관련이 있을 수 있습니다. 장점으로, 이 기술은 안과 버로 올바른 압력을 가하고 규칙적인 마모 영역을 만들 때 비교적 쉽게 가르치고 재현할 수 있습니다. 또한 이 기술은 각 환자의 특정 요구에 맞게 조정하거나 마모 부위의 크기를 선택하여 사용자의 관심에 맞게 조정할 수 있습니다.
축삭 절개술은 말기 NK26을 앓고 있는 환자가 받는 라멜라 각막 성형술과 유사합니다. 그것은 섬유의 퇴화(Wallerian 퇴보)와 중앙 각막의 축삭돌기의 재식민지화를 조사할 수 있습니다. 수술을 수행하는 데 필요한 재료는 비교적 간단하지만 시술자는 적절한 기술, 특히 생검 펀치를 사용한 올바른 압력 적용 및 올바른 회전 횟수에 대해 교육을 받아야 합니다. 각막 성형술의 맥락에서, 절개 깊이는 트레핀 장치와 수술 중 광간섭 단층 촬영을 사용하여 정밀하게 결정되며, 이 기술은 쥐 모델에 적용할 수 없다17. 각막 성형술과의 또 다른 차이점은 각막 절개만 수행했기 때문에 여기에 설명된 기술에서 기증자 이식이 없다는 것입니다. 이 모델은 신경 분포가 다시 자라야 하는 건강한 상피의 존재 때문에 흥미롭습니다. 이것은 신경 분포와 함께 상피가 제거되는 마모 모델과 구별됩니다.
다광자 현미경을 사용하는 신경 소작 기술은 일광 화상으로 인한 손상을 모방하지만 각막의 국소 부위에 발생하여 DNA 손상 및 ROS 형성을 유발합니다19,20. 이 방법을 사용하면 각막의 다른 위치에서 섬유의 재생을 연구할 수 있으며 동일한 부위에서 여러 번 소작을 반복하여 축삭 성장 및 면역 세포 이동에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.
이 세 가지 프로토콜은 재생 메커니즘을 조사하여 축삭 재성장의 근본적인 측면과 각막에 존재하는 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다. 이들 방법은 또한 새로운 약리학적 분자(24 ) 또는 유전자 치료(27)를 적용함으로써 축삭돌기 재생을 촉진하는 수단을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 형질전환 마우스 계통 MAGIC-Markers에 대한 접근에 대해 Karine Loulier 박사에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 프랑스 국립 연구국(ANR-10-INBS-04, "Investments for the future")이 지원하는 France-BioImaging 국가 인프라의 회원인 RAM-Neuro 동물 핵심 시설과 이미징 시설 MRI에 감사를 표합니다. 이 연구는 ATIP-Avenir 프로그램, Inserm, Région Occitanie, 몽펠리에 대학교, 프랑스 국립 연구 기관(ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale(FRM 재생 의학, REP202110014140) 및 Groupama Foundation의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
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