Summary
هنا ، نقترح ثلاث طرق مختلفة لإتلاف الألياف الحسية التي تعصب القرنية. تسهل هذه الطرق دراسة تجديد المحور العصبي في الفئران. هذه الطرق الثلاث ، القابلة للتكيف مع النماذج الحيوانية الأخرى ، مثالية لدراسة فسيولوجيا تعصيب القرنية وتجديدها.
Abstract
القرنية هي نسيج شفاف يغطي العين وهو ضروري لرؤية واضحة. هذا هو النسيج الأكثر تعصبا في الجسم. يوفر هذا التعصيب الإحساس والوظيفة الغذائية للعين ويساهم في الحفاظ على سلامة القرنية. يسمى الاضطراب المرضي لهذا التعصيب التهاب القرنية العصبي. يمكن أن يحدث هذا بسبب إصابة العين أو الجراحة أو المرض. في هذه الدراسة ، نقترح ثلاثة بروتوكولات مختلفة لإلحاق الضرر بالتعصيب بطرق تلخص الأنواع الثلاثة من الحالات التي تتم مواجهتها بشكل عام في العيادة.
تتمثل الطريقة الأولى في عمل تآكل للظهارة باستخدام لدغ عيني. يتضمن ذلك إزالة الطبقة الظهارية والنهايات العصبية الحرة والضفيرة تحت القاعدية بطريقة مشابهة لجراحة استئصال القرنية الانكسارية الضوئية التي يتم إجراؤها في العيادة. الطريقة الثانية تستهدف فقط التعصيب عن طريق تقسيمه في المحيط بلكمة خزعة ، والحفاظ على سلامة الظهارة. تشبه هذه الطريقة الخطوات الأولى من رأب القرنية الصفائحي وتؤدي إلى تنكس التعصيب يليه إعادة نمو المحاور العصبية في القرنية المركزية. الطريقة الأخيرة تدمر تعصيب نموذج الماوس المعدل وراثيا باستخدام مجهر متعدد الفوتونات ، والذي يحدد على وجه التحديد موقع الكي للألياف العصبية الفلورية. هذه الطريقة تلحق نفس الضرر مثل التهاب القرنية الضوئي ، وهو التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية.
تصف هذه الدراسة خيارات مختلفة للتحقيق في علم الأمراض الفسيولوجي لتعصيب القرنية ، وخاصة تنكس وتجديد المحاور. تعزيز التجديد أمر بالغ الأهمية لتجنب مضاعفات مثل عيوب الظهارة أو حتى ثقب القرنية. يمكن أن تساعد النماذج المقترحة في اختبار جزيئات دوائية جديدة أو علاج جيني يعزز تجديد الأعصاب ويحد من تطور المرض.
Introduction
تتكون القرنية، وهي السطح الشفاف للعين، من ثلاث طبقات متميزة: الظهارة، والسدى والبطانة. يحتوي هذا العضو على أعلى كثافة للتعصيب في الجسم ويتكون بشكل أساسي من ألياف حسية (النوعان Aδ و C) تنشأ من فرع العيون من العقدة ثلاثية التوائم. تخترق الألياف الحسية محيط القرنية في منتصف السدى على شكل حزم كبيرة تتفرع لتغطية السطح. ثم تتشعب لتخترق غشاء بومان وتشكل الضفيرة تحت القاعدية ، والتي يمكن التعرف عليها بسهولة عن طريق تكوين دوامة في وسط القرنية. تنتهي هذه الألياف كنهايات عصبية حرة على السطح الخارجي للظهارة. فهي قادرة على تحويل المحفزات الحرارية والميكانيكية والكيميائية وإطلاق العوامل الغذائية الضرورية لتوازن الظهارة 1,2. التهاب القرنية العصبي (NK) هو مرض تنكسي يؤثر على التعصيب الحسي للقرنية. ينبع هذا المرض النادر من انخفاض أو فقدان حساسية القرنية مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج الدموع وضعف خصائص الشفاء من القرنية3. يتقدم NK من خلال ثلاث مراحل موصوفة جيدا ، من المرحلة 1 حيث يعاني المرضى من عيوب ظهارية ، إلى المرحلة 3 حيث يحدث ذوبان اللحمة و / أو ثقب القرنية4.
سريريا ، يمكن أن تكون أصول هذا المرض متنوعة. يمكن للمرضى فقدان تعصيب القرنية بعد الإصابة الجسدية للعين أو الجراحة أو من خلال الأمراض المزمنة ، مثل مرض السكري 5,6. حتى الآن ، لا تزال عملية التسبب في NK غير مفهومة بشكل جيد ، والخيارات العلاجية لهذه الحالة التي تهدد البصر محدودة للغاية. لذلك ، هناك حاجة إلى فهم أفضل لخصائص العيوب الظهارية لفهم الآليات الكامنة وراء تجديد تلك الألياف بشكل أفضل وربما تعزيزها. هنا ، نقترح عدة نماذج لإصابة القرنية التي تحفز NK في الفئران.
النموذج الأول هو تآكل الطبقة الظهارية للقرنية مع لدغ العين. تمت دراسة هذا النموذج بشكل أساسي في سياق تجديد الظهارة في المختلفة ، مثل القوارض والأسماك7،8،9 ، واختبار الجزيئات التي تعزز شفاء القرنية10،11. من الناحية الفسيولوجية ، يستغرق الأمر 2-3 أيام حتى تغلق الخلايا الظهارية الجرح. ومع ذلك ، فإن النمط الفسيولوجي للتعصيب يستغرق أكثر من أربعة أسابيع للتعافي من التآكل12,13. أثناء الجراحة ، يزيل نتوء العين الطبقة الظهارية للقرنية التي تحتوي على الضفيرة تحت القاعدية والنهايات العصبية الحرة للألياف. يمكن مقارنة هذا الإجراء سريريا بالمرضى الذين يعانون من استئصال القرنية الانكساري الضوئي (PRK) لتصحيح عيوب انكسار العين. يتكون الإجراء من إزالة ظهارة القرنية ثم إعادة تشكيل السدى باستخدام الليزر14. يمكن للمرضى تجربة العديد من الآثار الجانبية بعد هذه الجراحة ، مثل انخفاض كثافة عصب القرنية لمدة 2 سنوات وانخفاض في الحساسية لمدة 3 أشهر إلى سنة واحدة بعدالجراحة 15. بالنظر إلى أن الجراحة تؤدي إلى هشاشة البيئة المكروية للقرنية ، يمكن أن يساعد هذا النموذج في التحقيق في هذه الآثار الجانبية وتطوير مناهج علاجية من شأنها تعزيز إعادة التعصيب بشكل أسرع ، وبالتالي تقليل الآثار الجانبية المعنية.
يتكون النموذج الثاني من تقسيم المحاور العصبية في محيط القرنية باستخدام خزعة ، مما يؤدي إلى تنكس والر للتعصيب المركزي 16. سريريا ، يمكن مقارنة هذه الطريقة برأب القرنية الصفائحي الأمامي ، حيث يدرك الجراح عملية نقوش جزئية للقرنية لإزالة جزء من السماكة الأمامية للقرنية واستبدالها بزرع متبرع 17. بعد رأب القرنية الرقائقي ، قد يعاني المرضى من عدد من الأعراض بما في ذلك جفاف العين وفقدان تعصيب القرنية ورفض الكسب غير المشروع18. يمكن أن يوفر نموذج بضع البديهية هذا الذي يتم إجراؤه على أعصاب القرنية نظرة ثاقبة لآليات تنكس الألياف ، والذي يحدث بعد الكسب غير المشروع ، يليه تجديد المحاور.
الطريقة الثالثة تدمر أعصاب القرنية بالليزر. باستخدام مجهر متعدد الفوتونات على قرنية المخدرة ، يحدث تنكس الأعصاب المترجمة في المجال البصري نتيجة لتكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي والتجويف الخلوي19. تلخص هذه الطريقة التلف الضوئي للقرنية الناجم عن التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية الطبيعية (حروق الشمس) ، والتي تؤدي أيضا إلى تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي20. يعاني المرضى الذين يعانون من حروق الشمس في القرنية من ألم شديد ، حيث أن تدهور الخلايا الظهارية يحرم أطراف ألياف القرنية من الجميع.
تم تصميم الطرق الثلاث الموضحة هنا لتمكين التحقيق في عملية التسبب في NK وتجديد المحور العصبي. فهي قابلة للتكرار بسهولة ودقيقة. علاوة على ذلك ، فهي تسمح بالشفاء السريع والمراقبة السهلة للحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل المجلس الوطني للتجارب الحيوانية.
1. الاستعدادات
- تحضير محلول مخدر من الكيتامين زيلازين للتخدير. حقن الكيتامين بمعدل 80 ملغم/كغ والزيلازين عند 10 ملغم/كغ عن طريق تخفيف 200 ميكرولتر من الكيتامين (100 ملغم/مل) و125 ميكرولتر من الزيلازين (20 ملغ/مل) في 2175 مل من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪.
- تحضير محلول البوبرينورفين 0.02 مجم / مل كمحلول مسكن عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 0.3 مجم / مل من البوبرينورفين إلى 1400 مل من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪.
- تحضير محلول تلطيخ الفلورسنت.
- استخدم مقياسا دقيقا لوزن 10 مجم من ملح الفلوريسئين وقم بتخفيفه في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للحصول على محلول فلوريسئين 0.1٪.
- حماية الحل من الضوء ويهز لمدة 5 دقائق. استخدم حقنة سعة 10 مل ومرشح حقنة 0.2 ميكرومتر لتصفية المحلول.
ملاحظة: يجب حماية محلول الفلورسنت من الضوء ويمكن تخزينه عند +4 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
- تحضير الماوس
- وزن الفأر وتحفيز التخدير عن طريق إجراء حقن داخل الصفاق من 10 ميكرولتر / غرام من وزن الفأر (MW) من محلول التخدير. عندما يتوقف الماوس عن الحركة ، ضعه على طبق ساخن (37 درجة مئوية) وتحقق من تخديره تماما عن طريق قرص أصابع قدميه.
- ضع قطرة من المسيل للدموع الاصطناعية على العين التي تخضع للجراحة وقطرة من هلام العين على العين المقابلة.
- بمجرد أن لا يستجيب الفأر للقرص ، قم بحقن التسكين (0.02 مجم / مل من البوبرينورفين) عند 5 ميكرولتر / جم من MW لتوفير 0.1 مجم / كجم من البوبرينورفين تحت الجلد في الرقبة.
2. تآكل القرنية
- اتبع الخطوة 1.3 لتحضير محلول تلطيخ الفلورسنت.
- اتبع الخطوة 1.4 لتحضير الماوس.
- قبل القيام بالتآكل ، اغمس نتوء العين في 70٪ EtOH ثم في برنامج تلفزيوني لتنظيفه.
- ضع الماوس على طبق ساخن (37 درجة مئوية) على الجانب للوصول بسهولة إلى العين التي تخضع للجراحة.
- استخدم قطعة قطن لامتصاص الدموع الاصطناعية وفرشاة الرموش بعيدا دون لمس العين.
- قم بتشغيل لدغ العين ، وافتح جفن الماوس بإصبعين ، وقم في نفس الوقت بسد الاهتزازات لتجنب تعلقها في الأزيز.
- توطين التلميذ أو مركز العين وتطبيق نتوء العين على سطح العين ، والقيام بحركات دائرية. من خلال النظر عن كثب ، يمكن ملاحظة سطح الظهارة التي تمت إزالتها. خلاف ذلك ، قم بحوالي 20 حركة دائرية على القرنية.
- ضع الفأر مرة أخرى على بطنه وتحقق مما إذا كان هلام العين لا يزال موجودا في العين المقابلة.
- ضع قطرة من محلول تلطيخ الفلورسنت على العين المتآكلة وانتظر لمدة 20 ثانية. امتصاص القطرة بمنديل دون لمس العين وشطفها بقطرة من المسيل للدموع الاصطناعية. امتصاص قطرة المسيل للدموع الاصطناعية مع الأنسجة وإلقاء الضوء على العين مع مصباح الكوبالت الأزرق.
ملاحظة: يجب أن يكون للتآكل شكل دائري. يتطلب بعض التدريب للحصول عليه. - ضع قطرة من جل العين على العين المتآكلة واترك الماوس يستيقظ على الوسادة الساخنة. عندما يتحرك الماوس من تلقاء نفسه ، أعده إلى قفصه.
- تحقق من رفاهية خلال الأيام التالية 2.
- بعد استخدام لدغ العين ، استخدم منديلا رخويا لإزالة الخلايا الظهارية العالقة في رأس النتوء وغمسها في 70٪ EtOH ثم PBS.
ملاحظة: بمجرد إزالة الخلايا الظهارية بالأنسجة الرخوة ، تأكد من عدم وجود قطع من الأنسجة عالقة في رأس الأزيز.
3. استئصال أعصاب القرنية
- اتبع الخطوة 1.4 لتحضير الماوس.
- ضع الفأر تحت عدسة مجهر على الجانب للوصول إلى العين التي تخضع للجراحة. ضع الجزء السفلي من طبق بتري تحت رأس الماوس حتى تكون العين أفقية.
ملاحظة: سيتم تنفيذ الخطوات التالية من خلال النظر من خلال العدسة مجهر. - قم بإزالة المسيل للدموع الاصطناعية بقطعة قطن وإزالة الرموش دون لمس العين.
- ضع كماشة منحنية ناعمة تحت عين لإخراجه من المدار. تأكد من إغلاق الزردية بما يكفي حتى لا تتمكن العين من العودة إلى المدار بمجرد الضغط ، ولكن ليس بشكل مفرط لمنع تلف العصب البصري.
- ضع لكمة الخزعة 2.5 مم عموديا على العين دون ضغط لضمان التلامس التام للثقب مع سطح القرنية.
ملاحظة: بمجرد تطبيق اللكمة على القرنية ، قد تتداخل يد المجرب مع مجال الرؤية. - ثم ابدأ في الضغط ولف اللكمة عدة مرات.
ملاحظة: اعتمادا على الضغط ، قد يختلف عدد الالتواءات ، ولكن بشكل عام يكون حوالي 5. يتطلب التدريب ليشعر بالضغط والحركة المناسبين. إذا تم تطبيق الكثير من الضغط ، تمزق العين. في هذه الحالة ، يمكن ملاحظة خروج السائل من الآفة وتليين العين. يجب التضحية بالحيوان. - إزالة لكمة الخزعة. يجب أن تكون الدائرة مرئية على القرنية حيث تم تطبيق لكمة الخزعة.
ملاحظة: الخطوات التالية لا تتطلب العدسة مجهر. - تحقق مما إذا كانت العين المقابلة لا تزال تحتوي على هلام العين وقم بتطبيق بعضها على العين المحورية.
- دع الفأر يستيقظ على وسادة ساخنة (37 درجة مئوية) وأعده إلى قفصه عندما يتحرك من تلقاء نفسه.
- تحقق من رفاهية خلال الأيام التالية 2.
4. القرنية تجهيز جبل كامل
- جمع العينات وتثبيتها.
- وزن الفأر والحث على التخدير عن طريق إجراء حقن داخل الصفاق من 10 ميكرولتر / غرام من وزن الماوس (MW) من محلول التخدير.
- عندما يتوقف الماوس عن الحركة وليس لديه ردود فعل عن طريق معسر إصبع القدم ، قم بإجراء خلع عنق الرحم.
- أخرج العين من المدار باستخدام إصبعين وقم باستئصال العين عن طريق قطع العصب البصري باستخدام مقص منحني.
- ضع العين في أنبوب بلاستيكي سعة 2 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني.
- ثبت العين عن طريق استبدال PBS ب 4٪ بارافورمالدهيد ووضعه على شاكر (30 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
- شطف 3 مرات لمدة 10 دقائق مع برنامج تلفزيوني في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
- تشريح القرنية
- ضع قطرة من برنامج تلفزيوني على قطعة من البارافيلم داخل طبق بتري.
- ضع العين في هذه القطرة من برنامج تلفزيوني.
- ضع طبق بتري تحت العدسة مجهر.
- تشريح القرنية باستخدام مقص التشريح المجهري والملقط. قطع فوق الجسم الهدبي للحفاظ على limbus.
- قم بإزالة العدسة والجسم الهدبي والقزحية باستخدام ملقط ناعم.
- ضع القرنية مرة أخرى في أنبوب بلاستيكي سعة 2 مل.
- بروتوكول التألق المناعي
- احتضان القرنية في 2 مل من 2.5٪ جيلاتين جلد السمك ، 5٪ مصل الماعز ، و 0.5٪ منظف في PBS لمدة 1 ساعة في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
- احتضان القرنية في 150 ميكرولتر من محلول يحتوي على 2.5٪ جيلاتين جلد السمك ، و 5٪ مصل الماعز ، و 0.1٪ منظف في PBS يحتوي على الجسم المضاد الأساسي المخفف عند 1/1000 (الجسم المضاد للتوبولين βIII) طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
- شطف 3 مرات لمدة 1 ساعة مع 0.1 ٪ المنظفات في PBS في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
- احتضان القرنية في نفس المحلول كما في الخطوة 4.3.2 ، التي تحتوي على الجسم المضاد الثانوي المخفف عند 1/500 طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
- شطف 3 مرات لمدة 1 ساعة مع PBS في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
- احتضان القرنية لمدة 10 دقائق مع 150 ميكرولتر من مقحم الحمض النووي المخفف عند 1/5000 في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
- شطف 2 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
- تصاعد القرنية
- ضع القرنية على شريحة ، ظهارة تواجه الشريحة ، واستخدم مشرطا لإنشاء أربعة أقسام دون الوصول إلى المركز.
ملاحظة: قم بعمل الأقسام المقابلة لبعضها البعض لتشكيل شكل زهرة. - ضع بطانة القرنية في مواجهة الشريحة وقم بإزالة PBS حول القرنية باستخدام منديل.
ملاحظة: لا تقم بإزالة برنامج تلفزيوني تحت القرنية; خلاف ذلك ، قد تظهر فقاعات الهواء. إذا كان الأمر كذلك ، أضف برنامج تلفزيوني إلى القرنية وقم بإزالة فقاعة الهواء. ثم أعد التشغيل من الخطوة 4.3.2. - أضف لصق النموذج على الزوايا الأربع لغطاء مستطيل.
ملاحظة: يرفع معجون النموذج غطاء الغطاء لأن القرنية عبارة عن نسيج سميك. - قم بإسقاط 50 ميكرولتر من وسط التثبيت على القرنية وضع الغطاء أعلاه بعناية لتجنب تكوين الفقاعة.
- أغلق الغطاء بطلاء الأظافر.
- ضع القرنية على شريحة ، ظهارة تواجه الشريحة ، واستخدم مشرطا لإنشاء أربعة أقسام دون الوصول إلى المركز.
- التصوير
- ضع الشريحة تحت المجهر الفلوري.
- حدد حجم الفسيفساء وعمق الصورة وابدأ عملية الاستحواذ.
- قم بتطبيق برنامج إزالة الضبابية وإزالة الالتفاف على الصورة المكتسبة.
ملاحظة: الخطوة 4.6.3 هي خيار محدد في برنامج الاستحواذ (المقاصة الحسابية كبيرة الحجم [LVCC])
5. الاجتثاث بالليزر الموضعي لأعصاب القرنية
- قم بتشغيل المجهر متعدد الفوتون المستقيم والليزر جنبا إلى جنب مع مذبذب حدودي بصري. قم بتنشيط المرحلة الساخنة للمجهر (37 درجة مئوية) واضبط الليزر على 850 نانومتر و 1100 نانومتر ، بما يتوافق مع الأطوال الموجية المطلوبة لنموذج الماوس.
- استخدم مقياس الطاقة لضبط طاقة الليزر في وقت واحد عند حوالي 20 ميجاوات.
- اتبع الخطوة 1.4 لتحضير الماوس وتطبيق هلام العين على كلتا العينين.
ملاحظة: يجب أن يكون المستخدم في هذا البروتوكول من خط فأر معدل وراثيا (MAGIC-Marker للفأرالمعدل وراثيا 21) يعبر عن فلوروفور داخلي المنشأ في الألياف العصبية للقرنية. - تثبيت في حامل الرأس. أدر 90 درجة للعين المثيرة للاهتمام لمواجهة السقف.
- اربط اهتزازات لتنظيف منطقة العين. اربط جسم لتقليل حركة الرأس الناتجة عن التنفس.
- ضع غطاء دائريا على العين فوق جل العين. يجب أن يكون غطاء الغطاء أفقيا. لا تتردد في تحريك رأس حتى يتم وضع الغطاء بشكل صحيح.
- أضف قطرة من PBS فوق قسيمة الغلاف. ضع على مرحلة المجهر بعناية واضبط البرج الموضوعي على المسافة الصحيحة.
- استخدم الهدف المائي 20x و epifluorescence لتوطين العين والتعصيب من خلال العدسة.
- قم بتنشيط الليزر وتحديد العمق الذي يجب إضاءته.
- احصل على صورة بدقة 1024 × 1024 (بكسل) بسرعة اكتساب تتراوح بين 70٪ و85٪ من الحد الأقصى لسرعة المسح الضوئي.
- بمجرد الحصول على الصورة ، أخرج من المجهر وقم بإزالة غطاء الغطاء والأشرطة. أخرج من حامل الرأس ، وأضف المزيد من جل العين إذا لزم الأمر ، واتركه يستيقظ في قفص على طبق ساخن.
ملاحظة: يمكن ملاحظة تدمير التعصيب بعد 1 أسبوع من التصوير. يمكن تكرار هذا البروتوكول مرة واحدة في الأسبوع لعدة أسابيع لزيادة الضرر الناجم عن الليزر. - عندما يتحرك من تلقاء نفسه ، ضع القفص مرة أخرى في الإسطبل وتحقق من سلامته لمدة 2 أيام التالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقترح هذه الدراسة عدة بروتوكولات لإلحاق الضرر بتعصيب القرنية في الفئران. بينما تم استخدام بروتوكولات مماثلة للتحقيق في علم الأمراض الفسيولوجي لشفاء الظهارة ، اخترنا تكييف وتطوير طرق جديدة للتحقيق في تجديد تعصيب القرنية. لمراقبة التعصيب ، استخدمنا تقنيتين. أولا ، استخدمنا تقنية التألق المناعي لتلطيخ الألياف العصبية باستخدام جسم مضاد لعموم الخلايا العصبية (BIII tubulin) والنوى باستخدام مقحم. ثانيا ، استفدنا من سلالة الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت في الألياف العصبية. تم تصوير القرنيات باستخدام مجهر الفلورسنت.
استخدمت الطريقة الأولى لدغ العيون مع مزيل حلقة الصدأ من 0.5 مم لإزالة الطبقة الظهارية القرنية (الشكل 1 أ). تركز هذه الدراسة على الأضرار التي لحقت بالتعصيب الموجود داخل الظهارة كوسيلة لفهم المكونات الخلوية والجزيئية المشاركة في تجديدها. قبل الجراحة ، كانت الظهارة القاعدية سليمة. شكلت الألياف العصبية في الضفيرة تحت القاعدية نمطا نموذجيا يسمى الدوامة (الشكل 1 ب). أزال طرف النتوء المستخدم في هذه التقنية الطبقة الأولى فقط من القرنية ولكنه حافظ على كل من السدى ، حيث توجد حزم كبيرة من الألياف ، والبطانة. كان جزء الظهارة الذي أزاله الأزيز مرئيا بسهولة ، حيث كان هناك تمزق واضح في الظهارة القاعدية والضفيرة تحت القاعدية (الشكل 1 ب). يمكن التعرف بسهولة على نوى الخلايا القرنية؛ لأنها مرتبة ترتيبا ضئيلا في جميع أنحاء السدى. فيما يتعلق بالتعصيب ، كانت الحدود واضحة أيضا ، مع تمزق الضفيرة تحت القاعدية مما يسمح برؤية الحزم الكبيرة من الألياف داخل السدى. بينما يستغرق الأمر حوالي 3 أيام حتى تلتئم الظهارة ، يستغرق تجديد التعصيب أكثر من 4 أسابيع بعد التآكل. يوضح الشكل 1 تجديد الظهارة بعد أسبوع واحد من الجراحة ، حيث تكون الظهارة القاعدية ناعمة. ومع ذلك ، فإن الدوامة غائبة عن مركز القرنية ، بالنظر إلى أن التعصيب لم يعد بعد إلى تلك النقطة.
تتكون الطريقة الثانية من تقسيم الأعصاب في محيط القرنية باستخدام خزعة قطرها 2.5 مم بدلا من تنظيفها بالنتوء (الشكل 2 أ). هذه الطريقة لا تعطل الظهارة بقدر ما تعطل التآكل. بعد الجراحة ، يمكن ملاحظة حلقة طرفية رقيقة عند النقطة التي تم فيها تطبيق لكمة الخزعة ، مما أدى إلى إتلاف الظهارة القاعدية (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، فقد تم تقسيم الأعصاب في المحيط ، مما أدى إلى انحطاط والر للمحاور. يتكون هذا النوع من التنكس من تسوس الأعصاب من النهاية النهائية للخلايا العصبية نحو جسم الخلية ، وفي هذه الحالة ، نحو القسم الناجم عن لكمة الخزعة. اعتمادا على عمق بضع البديهية ، يمكن أن يكون الضرر شديدا. هنا ، نرى أن انحطاطا شديدا قد حدث ، مما أدى إلى فقدان كامل للتعصيب في مركز القرنية في الظهارة (الشكل 2 ب). نظرا لأن التعصيب ضروري للحفاظ على توازن الظهارة ، يبدأ تفكك الطبقة الظهارية ، مما يخلق قرحة (الشكل 2 ب). حدث تكوين القرحة فقط في القرنيات التالفة بشدة.
تتكون التقنية الأخيرة من حرق أعصاب القرنية موضعيا في الجسم الحي للفئران المعدلة وراثيا المخدرة باستخدام مجهر متعدد الفوتونات (الشكل 3 أ). يتم الحصول على الصورة الأولى في الموقع الذي سيتم فيه الحرق. استخدمت هذه الدراسة فأرا محورا وراثيا يعبر تعصيبه عن بروتينات الفلورسنت. تم الحصول على الصورة في وسط القرنية ، حيث توجد الدوامة (الشكل 3 ب) ، من أعلى الظهارة إلى منتصف السدى. الدوامة لم تعد مرئية 1 أسبوع بعد الحصول على الصورة الأولى. بدلا من ذلك، هاجرت مجموعة من الخلايا المناعية إلى موقع الإضاءة؛ حيث يمكننا تحديد حزمة الألياف في الستروما، التي ضعفت بعد عملية الاكتساب الأولى (الشكل 3B).
الشكل 1: نتوءات العين ومثال على تعصيب القرنية بعد التآكل. (أ) تم استخدام نتوء طب العيون مع مزيل حلقة الصدأ 0.5 مم لصنع التآكل. ب: أمثلة على القرنيات المقطعة والمناعية. توضح صور ما قبل التآكل الظهارة القاعدية الملساء والدوامة (رأس السهم الأبيض) في المركز. تظهر صور ما بعد التآكل ترسما واضحا للضفيرة تحت القاعدية ، والتي تمت إزالتها (رؤوس الأسهم الحمراء). تظهر الصور التي تم الحصول عليها في أسبوع واحد بعد التآكل (1WPAbr) مكان تجدد الألياف (رأس سهم برتقالي). التعصيب ملطخ بالأجسام المضادة للتوبولين المضادة ل BIII (الأخضر). النوى ملطخة بمقحم الحمض النووي (أرجواني). تم الحصول على الصور باستخدام مجهر الفلورسنت. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: لكمة الخزعة ومثال على تعصيب القرنية بعد بضع الأكسوتومي. (أ) توضع خزعة معقمة قطرها 2.5 مم على العين لإحداث بضع الأكسوتوم. ب: أمثلة على القرنيات المقطعة والمناعية. توضح صور ما قبل بضع الأكسوتومي وجود الدوامة في وسط القرنية (رأس السهم الأبيض). تظهر صور ما بعد بضع البديهية الحلقة (رؤوس الأسهم الحمراء) التي تم إنشاؤها بواسطة الثقب في الظهارة. توضح الصور التي تم الحصول عليها في أسبوعين بعد بضع الأكسوتومي (2WPAx) تكوين القرحة (رأس السهم البرتقالي). التعصيب ملطخ بتوبولين BIII (أخضر). النوى ملطخة بمقحم (أرجواني). تم الحصول على الصور باستخدام مجهر الفلورسنت. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إعداد كي عصب القرنية بواسطة الليزر ومثال (أ) يحتفظ حامل الرأس بالفأر المعدل وراثيا MAGIC-Marker21 المخدر ، وتواجه عينه هدف 20x من البيفوتونات. جسم الفأر مربوط لتجنب حركة التنفس أثناء الاستحواذ. (B) عرض ثلاثي الأبعاد (3D) للاكتساب الأول للدوامة باستخدام الأطوال الموجية 850 نانومتر و 1100 نانومتر في وقت واحد قبل التلف الضوئي وأسبوع واحد بعد التلف الضوئي (1WPPhDa) في نفس موقع الدوامة. تسبب الليزر في هجرة الخلايا المناعية (رأس السهم) حيث توجد الدوامة. قضبان المقياس = 80 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| تقنيه | الهيكل المتأثر | درجة التأثير (+/-) | نوع الدراسة | فترة الشفاء |
| خدش | ظهاره | ++ | الظهارة وتجديد التعصيب | ظهارة <1 أسبوع التعصيب >2 أشهر |
| التعصيب | ++ | |||
| بضع التصنيف | ظهاره | +/- | تجديد التعصيب التهاب القرنية العصبي | التعصيب >2 أشهر NK >2 أسابيع |
| ستروما | +/- | |||
| التعصيب | ++ | |||
| الكي العصبي | ظهاره | + (محلي) | تجديد التعصيب الموضعي التهاب القرنية العصبي | اعتمادا على وتيرة الكي |
| ستروما | ||||
| التعصيب |
الجدول 1: مقارنة بين الاستراتيجيات الثلاث المقترحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعتبر التهاب القرنية العصبي مرضا نادرا يصيب 5 من كل 10000 فرد. ومع ذلك ، فإن الأشخاص الذين يعانون من NK بسبب إصابة جسدية مثل الحروق الكيميائية ، أو متلازمات مثل مرض السكري أو التصلب المتعدد غير مدرجين في تلك الإحصاءات3. علاوة على ذلك ، لا تزال هذه الحالة غير مشخصة بشكل كبير22 ، ويتم التقليل من انتشار المرض. هناك حاجة ماسة لعلاجات وعلاجات جديدة من شأنها تعزيز تجديد المحور العصبي كوسيلة للحفاظ على بصر المرضى. حاليا ، العلاج الوحيد المتاح المقدم للمرضى الذين يعانون من المراحل المبكرة من NK هو تطبيق قطرات العين الدوائية23،24،25 التي تدعم تجديد أعصاب القرنية. هذه ، ومع ذلك ، فعالة فقط إلى نقطة معينة. في حالات التغيير الأكثر شدة في القرنية ، مثل القرحة ، تقدم زراعة الغشاء الأمنيوسي أو رأب القرنية 3,4 حلا مؤقتا لإغلاق الجرح وتجنب العدوى. ومع ذلك ، يجب استبدال هذه الطعوم بعد وقت محدود ، مع زيادة خطر الرفض في كل إجراء إضافي.
يقدم هذا التقرير عدة نماذج تلخص أشكالا مختلفة من ناغورني كاراباخ التي تصادف عادة في العيادة (الجدول 1). يمكن استخدامها لتعميق معرفتنا بتعصيب القرنية والتحقيق في بدائل للعلاجات الحالية. يمكن أن يرتبط نموذج التآكل بجراحة PRK ، نظرا لأنه يلخص إعادة النمو البطيئة للتعصيب ، والتي تحدث بعد شفاء الظهارة المتآكلة. لصالحها ، يمكن تعليم هذه التقنية وإعادة إنتاجها بسهولة نسبية عند تطبيق الضغط الصحيح مع لدغ العيون ، ويتم إنشاء منطقة تآكل منتظمة. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذه التقنية مع الاحتياجات المحددة لكل مريض أو لتناسب اهتمامات المستخدم عن طريق اختيار حجم المنطقة المتآكلة.
يشبه بضع القرنية الصفائحي الذي يخضع له المرضى الذين يعانون من المرحلة المتأخرة من NK26. إنه يتيح التحقيق في تنكس الألياف (تنكس Wallerian) وإعادة استعمار المحاور العصبية في القرنية المركزية. في حين أن المواد المطلوبة لإجراء الجراحة بسيطة نسبيا ، يجب تدريب الممارس على التقنية المناسبة ، ولا سيما التطبيق الصحيح للضغط والعدد الصحيح من الدورات باستخدام لكمة الخزعة. في سياق رأب القرنية ، يتم تحديد عمق الشق بدقة من خلال استخدام جهاز trephine والتصوير المقطعي للتماسك البصري أثناء العملية ، وهي تقنيات غير قابلة للتكيف مع نماذج الفئران17. اختلاف آخر عن رأب القرنية هو عدم وجود زرع متبرع في التقنية الموضحة هنا ، حيث أجرينا شق القرنية فقط. هذا النموذج مهم بسبب وجود ظهارة صحية يجب أن ينمو فيها التعصيب مرة أخرى. هذا يميزه عن نموذج التآكل ، حيث تتم إزالة الظهارة مع التعصيب.
تحاكي تقنية الكي العصبي ، باستخدام مجهر متعدد الفوتونات ، الضرر الناجم عن حروق الشمس ولكنها تفعل ذلك في منطقة موضعية من القرنية ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي وتكوين أنواع الأكسجين التفاعلية19,20. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن دراسة تجديد الألياف من مواقع مختلفة على القرنية وحتى تكرار الكي في نفس المنطقة عدة مرات ، مما يتيح تقييم التأثير على نمو المحور العصبي وهجرة الخلايا المناعية.
توفر هذه البروتوكولات الثلاثة إمكانية دراسة الجوانب الأساسية لإعادة نمو المحور العصبي من خلال التحقيق في آليات التجدد ، وكذلك التفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في القرنية والتعصيب. توفر هذه الطرق أيضا وسيلة لتعزيز تجديد المحور العصبي من خلال تطبيق جزيئات دوائية جديدة24 أو العلاج الجيني27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتورة كارين لولييه على الوصول إلى خط الماوس المعدل وراثيا MAGIC-Markers. يشكر المؤلفون أيضا مرفق RAM-Neuro الحيواني الأساسي ومرفق التصوير بالرنين المغناطيسي ، وهو عضو في البنية التحتية الوطنية France-BioImaging التي تدعمها وكالة البحوث الوطنية الفرنسية (ANR-10-INBS-04 ، "الاستثمارات من أجل المستقبل"). تم دعم هذا البحث من قبل برنامج ATIP-Avenir ، Inserm ، Région Occitanie ، جامعة مونبلييه ، الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-21-CE17-0061) ، مؤسسة البحوث الطبية (FRM Regenerative Medicine ، REP202110014140) ، ومؤسسة Groupama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
- Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L.
- Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
- Dua, H. S., et al.
- Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A.
- Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
- Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
- Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
- Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
- Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
- Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
- He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
- Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
- Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
- Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
- Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
- Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
- Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
- Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S.
- Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).
