Summary
Här föreslår vi tre olika metoder för att skada de sensoriska fibrerna som innerverar hornhinnan. Dessa metoder underlättar studier av axonregenerering hos möss. Dessa tre metoder, som är anpassningsbara till andra djurmodeller, är idealiska för studier av hornhinnans innervationsfysiologi och regenerering.
Abstract
Hornhinnan är en genomskinlig vävnad som täcker ögat och är avgörande för klar syn. Det är den mest innerverade vävnaden i kroppen. Denna innervation ger känsel och trofisk funktion till ögat och bidrar till att bevara hornhinnans integritet. Den patologiska störningen av denna innervation kallas neurotrofisk keratit. Detta kan utlösas av skada på ögat, operation eller sjukdom. I denna studie föreslår vi tre olika protokoll för att tillfoga skada på innernervationen på ett sätt som rekapitulerar de tre typer av fall som vanligtvis förekommer i kliniken.
Den första metoden består i att göra en nötning av epitelet med en oftalmisk burr. Detta innebär avlägsnande av epitelskiktet, de fria nervändarna och den subbasala plexus på ett sätt som liknar den fotorefraktiva keratektomioperationen som utförs på kliniken. Den andra metoden riktar sig endast mot innervationen genom att snitta den i periferin med en biopsistans, vilket bibehåller epitelets integritet. Denna metod liknar de första stegen i lamellär keratoplastik och leder till en degeneration av innervationen följt av återväxt av axonerna i den centrala hornhinnan. Den sista metoden skadar innervationen av en transgen musmodell med hjälp av ett multifotonmikroskop, som specifikt lokaliserar platsen för kauterisering av de fluorescerande nervfibrerna. Denna metod orsakar samma skada som fotokeratit, en överexponering för UV-ljus.
Denna studie beskriver olika alternativ för att undersöka fysiopatologin vid hornhinnans innervation, särskilt degeneration och regenerering av axonerna. Att främja regenerering är avgörande för att undvika sådana komplikationer som epiteldefekter eller till och med perforering av hornhinnan. De föreslagna modellerna kan hjälpa till att testa nya farmakologiska molekyler eller genterapi som förbättrar nervregenerering och begränsar sjukdomsprogression.
Introduction
Hornhinnan, som är ögats genomskinliga yta, består av tre distinkta lager: epitelet, stromat och endotelet. Detta organ har den högsta tätheten av innervation i kroppen och består huvudsakligen av sensoriska fibrer (typ Aδ och C) som härrör från den oftalmiska grenen av trigeminusgangliet. Sensoriska fibrer tränger in i hornhinnans periferi i mitten av stromat i form av stora knippen som förgrenar sig för att täcka ytan. De förgrenar sig sedan för att tränga igenom Bowmanns membran och bildar den subbasala plexus, som är lätt att känna igen genom bildandet av en virvel i mitten av hornhinnan. Dessa fibrer slutar som fria nervändar på epitelets yttre yta. De kan överföra termiska, mekaniska och kemiska stimuli och frigöra trofiska faktorer som är väsentliga för epitelhomeostas 1,2. Neurotrofisk keratit (NK) är en degenerativ sjukdom som påverkar hornhinnans sensoriska innervation. Denna sällsynta sjukdom härrör från en minskning eller förlust av hornhinnans känslighet som resulterar i lägre tårproduktion och dåliga läkande egenskaper hos hornhinnan3. NK utvecklas genom tre väl beskrivna stadier, från stadium 1 där patienter drabbas av epiteldefekter, till stadium 3 där stromasmältning och/eller hornhinneperforering sker4.
Kliniskt kan ursprunget till denna sjukdom vara olika. Patienter kan förlora hornhinnans innervation efter fysisk skada på ögat, kirurgi eller genom kroniska sjukdomar, såsom diabetes 5,6. Hittills är NK-patogenesprocessen fortfarande dåligt förstådd, och terapeutiska alternativ för detta synhotande tillstånd är mycket begränsade. Därför behövs en bättre förståelse för egenskaperna hos epiteldefekter för att bättre förstå mekanismerna bakom regenereringen av dessa fibrer och potentiellt främja dem. Här föreslår vi flera modeller av hornhinneskador som inducerar NK hos möss.
Den första modellen är nötning av hornhinnans epitelskikt med en okulär borr. Denna modell har främst studerats i samband med regenerering av epitelet hos olika djur, såsom gnagare och fiskar 7,8,9, och för att testa molekyler som främjar hornhinnans läkning10,11. Fysiologiskt tar det 2-3 dagar för epitelcellerna att stänga såret. Det fysiologiska mönstret för innervationen tar dock mer än fyra veckor att återhämta sig från nötningen12,13. Under operationen tar den okulära borren bort hornhinnans epitelskikt som innehåller subbasal plexus och fibrernas fria nervändar. Denna procedur kan kliniskt jämföras med patienter med fotorefraktiv keratektomi (PRK) för att korrigera ögonbrytningsdefekter. Proceduren består av att ta bort hornhinnans epitel och sedan omforma stromat med en laser14. Patienter kan uppleva flera biverkningar efter sådan operation, såsom en minskning av hornhinnans nervtäthet i 2 år och en minskning av känsligheten under en period av 3 månader till ett år efter operationen15. Med tanke på att operationen inducerar en bräcklighet i hornhinnans mikromiljö, kan denna modell hjälpa till att undersöka dessa biverkningar och utveckla terapeutiska metoder som skulle främja snabbare reinnervering och därmed minska biverkningarna i fråga.
Den andra modellen består av att snitta axonerna i hornhinnans periferi med en biopsistans, vilket inducerar en wallersk degeneration av den centrala innervationen 16. Kliniskt kan denna metod jämföras med främre lamellär keratoplastik, där kirurgen realiserar en partiell trepanering av hornhinnan för att ta bort en del av hornhinnans främre tjocklek och ersätta den med en donatortransplantation 17. Efter lamellär keratoplastik kan patienter drabbas av ett antal symtom, inklusive torra ögon, förlust av hornhinneinnervation och transplantatavstötning18. Denna axotomimodell utförd på hornhinnans nerver kan ge insikt i mekanismerna för fiberdegeneration, som sker efter ett transplantat, följt av axonernas regenerering.
Den tredje metoden skadar hornhinnans nerver med laser. Genom att använda ett multifotonmikroskop på hornhinnan hos sövda djur induceras degeneration av nerverna lokaliserade i det optiska fältet som ett resultat av bildning av reaktiva syrearter (ROS), vilket leder till DNA-skador och cellulära kavitationer19. Denna metod rekapitulerar hornhinnans fotoskada som induceras av överexponering för naturlig UV (solbränna), vilket också utlöser ROS-bildning, vilket leder till DNA-skador20. Patienter som lider av solbränna på hornhinnan upplever stor smärta, eftersom försämringen av epitelcellerna berövar hornhinnans extremiteter allt.
De tre metoderna som beskrivs här är utformade för att möjliggöra undersökning av NK-patogenesprocessen och axonregenerering. De är lätta att reproducera och exakta. Dessutom möjliggör de snabb återhämtning och enkel övervakning av djuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök godkändes av Statens Djurförsöksnämnd.
1. Förberedelser
- Bered en bedövningslösning av ketamin-xylazin för anestesi. Injicera ketamin 80 mg/kg och xylazin 10 mg/kg genom spädning av 200 μl ketamin (100 mg/ml) och 125 μl xylazin (20 mg/ml) i 2 175 ml steril 0,9 % NaCl.
- Bered 0,02 mg/ml buprenorfinlösning som smärtstillande lösning genom att tillsätta 100 μl 0,3 mg/ml buprenorfin till 1 400 ml steril 0,9 % NaCl.
- Bered den fluorescerande färgningslösningen.
- Använd en fin våg för att väga 10 mg fluoresceinsalt och späd det i 10 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att erhålla en 0,1 % fluoresceinlösning.
- Skydda lösningen från ljuset och skaka den i 5 minuter. Använd en 10 ml spruta och ett sprutfilter på 0,2 μm för att filtrera lösningen.
OBS: Den fluorescerande lösningen måste skyddas från ljuset och kan förvaras vid +4 °C i 5 dagar.
- Förberedelse av musen
- Väg musen och inducera anestesi genom att utföra en intraperitoneal injektion av 10 μL/g musvikt (MW) av anestesilösningen. När musen slutar röra sig, placera den på en uppvärmd platta (37 °C) och kontrollera att den är helt bedövad genom att nypa ihop tårna.
- Applicera en droppe konstgjord tår på ögat som genomgår operationen och en droppe ögongel på det kontralaterala ögat.
- När musen inte svarar på nyp, injicera analgesin (0,02 mg/ml buprenorfin) vid 5 μL/g MW för att ge 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant i halsen.
2. Nötning av hornhinnan
- Följ steg 1.3 för att bereda den fluorescerande färgningslösningen.
- Följ steg 1.4 för att förbereda musen.
- Innan du gör nötningen, doppa okulärgraden i 70 % EtOH och sedan i PBS för att rengöra den.
- Placera musen på en uppvärmd platta (37 °C) på sidan för att enkelt komma åt ögat som genomgår operationen.
- Använd en bomullspinne för att absorbera den konstgjorda tåren och borsta bort ögonfransarna utan att röra vid ögat.
- Slå på okulära grader, öppna ögonlocket på musen med två fingrar och blockera samtidigt vibrationerna för att undvika att de fastnar i graden.
- Lokalisera pupillen eller mitten av ögat och applicera okulärt borr på ögats yta och gör cirkulära rörelser. Genom att titta noga kan ytan på det borttagna epitelet observeras. Gör annars cirka 20 cirkulära rörelser på hornhinnan.
- Sätt tillbaka musen på magen och kontrollera om ögongelen fortfarande finns kvar i det kontralaterala ögat.
- Applicera en droppe fluorescerande färgningslösning på det avskavda ögat och vänta i 20 s. Absorbera droppen med en servett utan att röra vid ögat och skölj den med en droppe konstgjord tår. Absorbera droppen av den konstgjorda tåren med en servett och lys upp ögat med en blå koboltlampa.
OBS: Nötningen måste ha en cirkulär form. Det krävs en del träning för att få det. - Applicera en droppe ögongel på det avskavda ögat och låt musen vakna på den uppvärmda dynan. När musen rör sig av sig själv, sätt tillbaka den i buren.
- Kontrollera djurets välbefinnande under de följande 2 dagarna.
- Efter användning av den okulära graden, använd en mjuk vävnad för att ta bort epitelceller som fastnat i gradens huvud och doppa den i 70 % EtOH och sedan PBS.
OBS: När epitelcellerna har tagits bort med mjukvävnaden, se till att inga vävnadsbitar har fastnat i gradens huvud.
3. Axotomi av hornhinnans nerver
- Följ steg 1.4 för att förbereda musen.
- Placera musen under en kikarlupp på sidan för att komma åt ögat som genomgår operationen. Lägg botten av en petriskål under mushuvudet för att ögat ska vara horisontellt.
OBS: Följande steg kommer att utföras genom att titta genom kikarluppen. - Ta bort den konstgjorda tåren med en bomullspinne och ta bort ögonfransarna utan att röra vid ögat.
- Placera en slät böjd tång under djurets öga för att få ut den ur omloppsbanan. Se till att stänga tången tillräckligt för att ögat inte ska kunna gå tillbaka i omloppsbanan när tryck appliceras, men inte för mycket för att förhindra synnervsskador.
- Applicera biopsistansen på 2,5 mm vertikalt på ögat utan tryck för att säkerställa att stansen har total kontakt med hornhinnans yta.
OBS: När stansen appliceras mot hornhinnan kan experimentledarens hand störa synfältet. - Börja sedan applicera tryck och vrid stansen flera gånger.
OBS: Beroende på trycket kan antalet vridningar variera, men i allmänhet är det runt 5. Det krävs träning för att känna rätt tryck och rörelse. Om man trycker för hårt spricker ögat. I detta fall kan vätska observeras komma ut ur lesionen och ögat mjukna. Djuret måste offras. - Ta bort biopsistansen. En cirkel måste vara synlig på hornhinnan där biopsistansen applicerades.
OBS: Nästa steg kräver inte den binokulära luppen. - Kontrollera om det kontralaterala ögat fortfarande har ögongel och applicera lite på det axotomiserade ögat.
- Låt musen vakna på en uppvärmd dyna (37 °C) och sätt tillbaka den i sin bur när den rör sig av sig själv.
- Kontrollera djurets välbefinnande under de följande 2 dagarna.
4. Bearbetning av hornhinnan
- Provtagning och fixering.
- Väg musen och inducera anestesi genom att utföra en intraperitoneal injektion av 10 μL/g musvikt (MW) av anestesilösningen.
- När musen slutar röra sig och inte har reflexer genom att nypa ihop tårna, utför en cervikal luxation.
- Skjut ut ögat ur omloppsbanan med två fingrar och förslut ögat genom att klippa synnerven med en böjd sax.
- Placera ögat i ett 2 ml plaströr som innehåller PBS.
- Fixera ögat genom att byta ut PBS mot 4 % paraformaldehyd och placera den på en shaker (30 rpm) i rumstemperatur (RT) i 20 min.
- Skölj 3 gånger i 10 min med PBS vid RT på en shaker (30 rpm).
- Dissektion av hornhinnan
- Placera en droppe PBS på en bit parafilm inuti en petriskål.
- Placera ögat i denna droppe PBS.
- Placera petriskålen under kikarluppen.
- Dissekera hornhinnan med mikrodissektionssax och pincett. Skär ovanför ciliarkroppen för att behålla limbus.
- Ta bort linsen, ciliarkroppen och iris med en fin pincett.
- Sätt tillbaka hornhinnan i ett 2 ml plaströr.
- Immunofluorescensprotokoll
- Inkubera hornhinnan i 2 ml 2,5 % fiskskinnsgelatin, 5 % getserum och 0,5 % tvättmedel i PBS i 1 timme vid RT på en shaker (30 rpm).
- Inkubera hornhinnan i 150 μl av en lösning av 2,5 % fiskhudsgelatin, 5 % getserum och 0,1 % rengöringsmedel i PBS innehållande den primära antikroppen utspädd vid 1/1000 (anti βIII tubulinantikropp) över natten vid 4 °C i en shaker (30 rpm).
- Skölj 3 gånger i 1 timme med 0,1 % tvättmedel i PBS vid RT på en shaker (30 rpm).
- Inkubera hornhinnan i samma lösning som i steg 4.3.2 och innehållande sekundärantikroppen utspädd vid 1/500 över natten vid 4 °C i en skakapparat (30 rpm).
- Skölj 3 gånger i 1 h med PBS vid RT på en shaker (30 rpm).
- Inkubera hornhinnan i 10 minuter med 150 μL DNA-interkalator utspädd vid 1/5000 vid RT på en shaker (30 rpm).
- Skölj 2 gånger i 5 min med PBS.
- Montering av hornhinnan
- Placera hornhinnan på ett objektglas, epitelet vänd mot objektglaset och använd en skalpell för att skapa fyra sektioner utan att nå mitten.
OBS: Gör sektionerna mittemot varandra för att bilda en blomform. - Placera hornhinnans endotel vänd mot objektglaset och ta bort PBS runt hornhinnan med hjälp av en servett.
OBS: Ta inte bort PBS under hornhinnan; annars kan luftbubblor uppstå. Om så är fallet, tillsätt PBS på hornhinnan och ta bort luftbubblan. Starta sedan om från steg 4.3.2. - Lägg modellpasta i de fyra hörnen på ett rektangulärt täckglas.
OBS: Modellpastan höjer täckglaset eftersom hornhinnan är en tjock vävnad. - Droppa 50 μL av ett monteringsmedium på hornhinnan och lägg försiktigt täckglaset ovanför för att undvika bubbelbildning.
- Försegla täckglaset med nagellack.
- Placera hornhinnan på ett objektglas, epitelet vänd mot objektglaset och använd en skalpell för att skapa fyra sektioner utan att nå mitten.
- Imaging
- Placera objektglaset under ett epifluorescerande mikroskop.
- Definiera storleken på mosaiken och djupet på bilden och starta förvärvet.
- Tillämpa ett program för att sudda ut och minska faltningen på den hämtade bilden.
OBS: Steg 4.6.3 är ett alternativ som valts i förvärvsprogramvaran (Large Volume Computational Clearing [LVCC])
5. Lokaliserad laserablation av hornhinnenerver
- Slå på det upprättstående multifotonmikroskopet och lasern i kombination med en optisk parametrisk oscillator. Aktivera den uppvärmda stage av mikroskopet (37 °C) och ställ in lasrarna på 850 nm och 1100 nm, motsvarande de önskade våglängderna för musmodellen.
- Använd en effektmätare för att ställa in laserns effekt samtidigt på cirka 20 mW.
- Följ steg 1.4 för att förbereda musen och applicera ögongel på båda ögonen.
OBS: Djuret som används för detta protokoll måste komma från en transgen muslinje (MAGIC-Marker transgenic mouse21) som uttrycker en endogen fluorofor i hornhinnans nervfibrer. - Installera djuret i en huvudhållare. Vrid djuret 90° för att ögat av intresse ska vara vänt mot taket.
- Spänn fast djurets vibrissae för att rensa ögonområdet. Spänn fast djurets kropp för att minska huvudrörelsen som induceras av andningen.
- Placera ett cirkulärt täckglas på ögat ovanför ögongelen. Täckglaset måste vara horisontellt. Tveka inte att flytta djurets huvud för att täckglaset ska placeras korrekt.
- Tillsätt en droppe PBS ovanför täckglaset. Placera djuret försiktigt på mikroskopsteget och ställ in objektivtornet på rätt avstånd.
- Använd det vattenhaltiga 20x-objektivet och epifluorescensen för att lokalisera ögat och innervationen genom okularet.
- Aktivera lasrarna och definiera det djup som behöver belysas.
- Ta en bild på 1024 x 1024 (pixlar) med en förvärvshastighet på 70–85 % av den maximala skanningshastigheten.
- När bilden är tagen, ta bort djuret från mikroskopet och ta bort täckglaset och remmarna. Ta bort djuret från huvudhållaren, tillsätt mer ögongel om det behövs och låt det vakna i en bur på en uppvärmd platta.
OBS: Förstörelse av innervationen kan observeras 1 vecka efter avbildningen. Detta protokoll kan upprepas en gång i veckan i flera veckor för att öka skadorna som orsakas av lasrarna. - När djuret rör sig på egen hand, sätt tillbaka buren i stallet och kontrollera dess välbefinnande under de följande 2 dagarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie föreslår flera protokoll för att tillfoga skador på hornhinnans innervation hos möss. Medan liknande protokoll har använts för att undersöka fysiopatologin för läkning av epitelet, valde vi att anpassa och utveckla nya metoder för att undersöka regenerering av hornhinnans innerver. För att observera innervationen använde vi två tekniker. Först använde vi en immunofluorescensteknik för att färga nervfibrerna med hjälp av en panneuronal antikropp (BIII tubulin) och kärnorna med en interkalator. För det andra utnyttjade vi en transgen musstam som uttrycker fluorescerande proteiner i nervfibrerna. Hornhinnorna avbildades med hjälp av ett epifluorescensmikroskop.
Den första metoden använde en oftalmisk borr med en rostringborttagare på 0,5 mm för att ta bort hornhinnans epitelskikt (Figur 1A). Denna studie fokuserar på skadorna på innervationen inuti epitelet som ett sätt att förstå de cellulära och molekylära komponenterna som är involverade i dess regenerering. Före operationen var det basala epitelet intakt. Nervfibrerna i den subbasala plexus bildade ett typiskt mönster som kallas virveln (Figur 1B). Spetsen på borren som användes i denna teknik tog bara bort det första lagret av hornhinnan men bevarade både stromat, där stora buntar av fibrer finns, och endotelet. Den del av epitelet som avlägsnats av borren var lätt synlig, eftersom det fanns en tydlig bristning av det basala epitelet och den subbasala plexus (Figur 1B). Keratocyternas kärnor kan lätt identifieras eftersom de är glest ordnade i hela stromat. När det gäller innervationen var gränsen också tydlig, med en bristning av den subbasala plexus som gjorde att de stora buntarna av fibrer inuti stromat kunde ses. Medan det tar cirka 3 dagar för epitelet att läka, tar regenerering av innervationen mer än 4 veckor efter en nötning. Figur 1 illustrerar regenereringen av epitelet 1 vecka efter operationen, där basalepitelet är slätt. Virveln är dock frånvarande från mitten av hornhinnan, med tanke på att innervationen ännu inte har återvänt till den punkten.
Den andra metoden består i att snitta nerverna i hornhinnans periferi med en biopsistans med en diameter på 2,5 mm i stället för att borsta bort dem med graden (Figur 2A). Denna metod stör inte epitelet lika mycket som nötningen. Efter operationen kan en tunn perifer ring observeras vid den punkt där biopsistansen applicerades, vilket skadar basalepitelet (Figur 2B). Nerverna i periferin har dock snittats, vilket utlöser den wallerianska degenerationen av axonerna. Denna typ av degeneration består av sönderfall av nerver från neuronernas ändpunkt mot cellkroppen och, i detta fall, mot den del som induceras av biopsistansen. Beroende på axotomins djup kan skadorna vara allvarliga. Här ser vi att kraftig degeneration har inträffat, vilket leder till en total förlust av innervation i mitten av hornhinnan i epitelet (Figur 2B). Eftersom innervation är avgörande för upprätthållandet av epitelhomeostas, initieras en sönderdelning av epitelskiktet, vilket skapar ett sår (Figur 2B). Sårbildning skedde endast i kraftigt skadade hornhinnor.
Den sista tekniken består i att lokalt bränna hornhinnenerverna hos sövda transgena möss med ett multifotonmikroskop (Figur 3A). Den första bilden tas på den plats där bränningen kommer att göras. I denna studie användes en transgen mus vars innervation uttrycker fluorescerande proteiner. Bilden togs i mitten av hornhinnan, där virveln är belägen (Figur 3B), från toppen av epitelet till mitten av stromat. Virveln är inte längre synlig 1 vecka efter den första bildtagningen. Istället har en grupp immunceller migrerat till belysningsplatsen, där vi kan identifiera knippet av fibrer i stromat, som har tunnats ut efter den första exponeringen (Figur 3B).
Figur 1: Okulär malning och exempel på hornhinneinnervation efter nötning. (A) En oftalmologisk malning med en rostringborttagare på 0,5 mm användes för att göra nötningen. B) Exempel på dissekerade och immunfärgade hornhinnor. Bilder före nötning illustrerar det släta basala epitelet och virveln (vit pilspets) i mitten. Bilder efter nötning visar en tydlig avgränsning av den subbasala plexus, som togs bort (röda pilspetsar). Bilder tagna 1 vecka efter nötning (1WPAbr) visar var fibrerna regenereras (orange pilspets). Innervationen är färgad med anti-BIII tubulinantikropp (grön). Kärnorna är färgade med en DNA-interkalator (lila). Bilderna är tagna med ett epifluorescensmikroskop. Skalstreck = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Biopsistans och exempel på hornhinneinnervering efter axotomi. A) En steril biopsistans med en diameter på 2,5 mm appliceras på ögat för att inducera en axotomi. B) Exempel på dissekerade och immunfärgade hornhinnor. Bilder före axotomi illustrerar närvaron av virveln i mitten av hornhinnan (vit pilspets). Bilder efter axotomi visar ringen (röda pilspetsar) som skapas av stansen i epitelet. Bilder tagna 2 veckor efter axotomi (2WPAx) illustrerar bildandet av såret (orange pilspets). Innervationen är färgad med BIII-tubulin (grönt). Kärnorna är färgade med en interkalator (lila). Bilderna är tagna med ett epifluorescensmikroskop. Skalstreck = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Upplagd för kauterisering av hornhinnenerven med laser och ett exempel (A) Den bedövade transgena musenMAGIC-Marker 21 underhålls av huvudhållaren, och dess öga är vänt mot bifotonens 20x-objektiv. Musens kropp är fastspänd för att undvika andningsrörelser under förvärvet. (B) Tredimensionell (3D) bild av den första insamlingen av virveln med våglängderna 850 nm och 1100 nm samtidigt före fotoskadan och 1 vecka efter fotoskadan (1WPPhDa) på samma plats i virveln. Lasrarna inducerade migration av immunceller (pilspets) där virveln brukade sitta. Skalstreck = 80 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Teknik | Påverkad struktur | Grad av påverkan (+/-) | Typ av studie | Läkningsperiod |
| Nötning | Epitel | ++ | Epitel och innervationsregenerering | Epitel <1 vecka Innervation >2 månader |
| Innervation | ++ | |||
| Abotomi | Epitel | +/- | Regenerering av nerver Neurotrofisk keratit | Innervation >2 månader NK >2 veckor |
| Stroma | +/- | |||
| Innervation | ++ | |||
| Nervkauterisering | Epitel | + (lokal) | Lokal innervationsregenerering Neurotrofisk keratit | Beroende på frekvensen av kauterisering |
| Stroma | ||||
| Innervation |
Tabell 1: Jämförelse av de tre föreslagna strategierna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurotrofisk keratit anses vara en sällsynt sjukdom som drabbar 5 av 10 000 individer. Personer som lider av NK på grund av en fysisk skada, t.ex. kemiska brännskador, eller syndrom som diabetes eller multipel skleros ingår dock inte i denna statistik. Dessutom är detta tillstånd fortfarande kraftigt underdiagnostiserat22, och förekomsten av sjukdomen är underskattad. Det finns ett stort behov av nya behandlingar och terapier som skulle främja axonregenerering som ett sätt att bevara patienternas syn. För närvarande är den enda tillgängliga behandlingen som erbjuds patienter som lider av de tidiga stadierna av NK applicering av farmakologiska ögondroppar 23,24,25 som stöder regenerering av hornhinnans nerv. Dessa är dock effektiva endast till en viss punkt. Vid allvarligare förändringar av hornhinnan, såsom sår, fosterhinnetransplantation eller keratoplastik 3,4 erbjuder en tillfällig lösning för att stänga såret och undvika infektion. Dessa transplantat måste dock bytas ut efter en begränsad tid, och risken för avstötning ökar vid varje ytterligare ingrepp.
Denna rapport presenterar flera modeller som rekapitulerar olika former av NK som är vanligt förekommande i kliniken (Tabell 1). Dessa kan användas för att fördjupa vår kunskap om hornhinnans innervation och för att undersöka alternativ till nuvarande behandlingar. Nötningsmodellen kan associeras med PRK-kirurgi, eftersom den rekapitulerar den långsamma återväxten av innervationen, som inträffar efter läkning av det avskavda epitelet. Till sin fördel kan denna teknik läras in och reproduceras relativt enkelt när rätt tryck med den oftalmiska borren appliceras och ett regelbundet slipat område skapas. Dessutom kan denna teknik anpassas till varje patients specifika behov eller för att passa användarens intresse genom att välja storleken på det slipade området.
Amotomin liknar den lamellär keratoplastik som patienter som lider av NK26 i sent stadium genomgår. Det möjliggör undersökning av degenerationen av fibrerna (Wallerian degeneration) och återkolonisering av axonerna i den centrala hornhinnan. Även om det material som krävs för att utföra operationen är relativt enkelt, måste läkaren utbildas i rätt teknik, särskilt korrekt applicering av tryck och rätt antal varv med biopsistansen. I samband med en keratoplastik bestäms snittets djup exakt genom användning av en trefinanordning och intraoperativ optisk koherenstomografi, vilka tekniker inte kan anpassas till murina modeller17. En annan olikhet med keratoplastik är frånvaron av donatortransplantation i den teknik som beskrivs här, eftersom vi bara utförde snittet i hornhinnan. Denna modell är av intresse på grund av närvaron av ett friskt epitel där innervationen måste växa tillbaka. Detta skiljer den från nötningsmodellen, där epitelet avlägsnas med innervationen.
Nervkauteriseringstekniken, med hjälp av ett multifotonmikroskop, efterliknar skadorna som orsakas av solbränna men gör det på ett lokaliserat område av hornhinnan, vilket utlöser DNA-skador och ROS-bildning19,20. Med denna metod är det möjligt att studera regenereringen av fibrerna från olika platser på hornhinnan och till och med att upprepa kauteriseringen i samma område flera gånger, vilket gör det möjligt att utvärdera effekten på axontillväxt och immuncellsmigration.
Dessa tre protokoll erbjuder möjligheten att studera de grundläggande aspekterna av axonal återväxt genom att undersöka de regenerativa mekanismerna, såväl som interaktionerna mellan de olika celltyperna som finns i hornhinnan och innervationen. Dessa metoder erbjuder också ett sätt att främja axonregenerering genom att tillämpa nya farmakologiska molekyler24 eller genterapi27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Karine Loulier för tillgången till den transgena muslinjen MAGIC-Markers. Författarna tackar också RAM-Neuro animal core facility och imaging facility MRI, en medlem av den nationella infrastrukturen France-BioImaging som stöds av den franska nationella forskningsbyrån (ANR-10-INBS-04, "Investments for the future"). Denna forskning stöddes av ATIP-Avenir-programmet, Inserm, Région Occitanie, universitetet i Montpellier, den franska nationella forskningsbyrån (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) och Groupama Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
- Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L.
- Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
- Dua, H. S., et al.
- Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A.
- Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
- Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
- Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
- Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
- Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
- Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
- He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
- Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
- Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
- Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
- Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
- Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
- Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
- Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S.
- Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).
