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Neuroscience

体内 大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

基因编码钙指示剂 （GECI） 能够对感觉神经元信号传导进行稳健的群体水平分析。在这里，我们开发了一种新方法，可以对大鼠三叉神经节神经元活动进行 体内 GECI可视化。

Abstract

基因编码钙指示剂 （GECI） 使成像技术能够监测靶细胞群中细胞内钙的变化。其大信噪比使GECI成为检测感觉神经元中刺激诱发活动的有力工具。GECI有助于对刺激编码的群体水平分析，以及可以同时研究的神经元数量。这种群体编码在 体内进行最合适。背根神经节 （DRG） 容纳了支配颈部以下躯体和内脏结构的感觉神经元体体，最广泛地用于 体内 成像，因为这些结构相对容易进入。最近，该技术被用于小鼠研究三叉神经节（TG）中支配口腔和颅面结构的感觉神经元。除了 DRG 之外，研究 TG 的原因还有很多，包括一长串特定于口腔和颅面结构的疼痛综合征，这些综合征似乎反映了感觉神经元活动的变化，例如三叉神经痛。由于遗传工具的可用性，小鼠在 DRG 和 TG 神经元的研究中使用最广泛。然而，由于大小的差异、易于处理的程度以及潜在的重要物种差异，有理由研究大鼠而不是小鼠 TG 神经元。因此，我们开发了一种 在体内对大鼠TG神经元进行成像的方法。我们腹膜内注射了编码 GCaMP6 的 AAV 给新生儿幼崽 （p2），导致 >90% 的 TG 和 DRG 神经元感染。开颅手术和去皮后在成人中观察到 TG，并在刺激面部下颌和上颌区域后监测 TG 神经元中 GCaMP6 荧光的变化。我们证实，荧光的增加是由周围神经阻滞诱发的刺激引起的。虽然这种方法有许多潜在的用途，但我们正在用它来表征周围神经损伤后改变的TG神经元的亚群。

Introduction

躯体感觉是影响皮肤或其他身体结构（包括肌肉、骨骼和内脏）的机械、热和化学刺激的神经编码，始于支配这些结构的初级传入神经元的活动 1。基于单单元的电生理学方法提供了有关该过程所涉及的传入亚型以及它们的刺激反应特性如何随时间变化的大量信息1,2,3。然而，虽然仍然有强有力的证据支持标记线理论，该理论表明特定的感觉模式是由特定的神经元亚群传达的，但许多神经元亚群对相同类型的机械、热和化学刺激做出反应的能力表明，大多数体感刺激是由多个神经元亚群编码的 4，5.因此，要更好地理解躯体感觉，就必须同时研究10个（如果不是数百个）神经元的活动。

随着最近共聚焦以及随后的多光子和数字成像技术的出现，光学方法的进步促进了对神经元活动进行相对非侵入性群体水平分析的能力6,7。该技术应用的最后一个障碍是开发能够对神经活动进行光学评估的工具。鉴于动作电位的速度可以在不到一毫秒的时间内开始和结束，能够以动作电位的速度跟踪膜电位变化的电压敏感染料将是实现此目的的理想工具。但是，尽管在7,8,9,10这一领域取得了巨大进展，但其中许多染料的信噪比仍然不够高，无法在单细胞水平上对数百个神经元进行群体分析。作为替代方法，研究人员已转向监测细胞内 Ca2+ 浓度 （[Ca2+]i） 的变化。这种策略的局限性从一开始就很明显，包括 [Ca2+]i 的增加是神经活动的间接测量11;[Ca2+]i 的增加可能与与电压门控 Ca2+ 通道 （VGCC） 激活相关的 Ca2+ 流入无关12,13;Ca2+瞬变的幅度和持续时间可以由独立于VGCC活动的过程控制11,12,14;并且 Ca2+ 瞬变的时间过程远远超过动作电位15 的时间过程。然而，使用 Ca2+ 作为神经活动的间接测量具有许多显着优势。其中最重要的是与大多数 Ca2+ 指标相关的信噪比，它反映了细胞内 Ca2+ 变化的幅度以及信号来自胞质溶胶的三维空间而不是细胞膜的二维空间这一事实。此外，随着遗传编码的 Ca2+ 指示剂 （GECI） 的发展，可以利用遗传策略来驱动 Ca2+ 指示剂在特定细胞亚群中的表达，从而促进完整制剂中的群体水平分析（例如，参见16）。

鉴于现在在小鼠中可用的遗传工具的数量，GECI在该物种中被最广泛地使用也就不足为奇了。在感觉神经元亚群中具有组成型 GECI 表达的小鼠系已被开发出来 7,16,17。随着在特定细胞类型中表达重组酶的小鼠品系的发展，可以使用更复杂的策略来控制GECI表达15。然而，虽然这些工具越来越强大，但有很多原因可以解释为什么其他物种，如老鼠，可能更适合一些实验问题。这些包括更大的尺寸，促进了许多实验操作，这些操作在较小的小鼠中是困难的，如果不是不可能的话;训练大鼠完成相对复杂的行为任务的便利性;至少有一些证据表明，大鼠感觉神经元中几种离子通道的生物物理特性和表达模式可能与在人类感觉神经元中观察到的更相似，而不是在小鼠中相对于人类18的相同通道。

虽然躯体感觉刺激的转导通常发生在初级传入神经的外周末梢，但在外周启动的动作电位必须通过容纳初级传入体细胞的结构，称为背根 （DRG） 或三叉神经 （TG） 神经节，然后才能到达中枢神经系统19。虽然有证据表明，并非每个沿初级传入轴突传播的动作电位都会侵入细胞体20，这是由于初级传入体体通过T型连接19连接到主传入轴突，因此在外周启动的大多数动作电位似乎侵入了体细胞21.当使用 GECI 评估初级传入细胞中的群体编码时，这赋予了三个实验优势：当使用 [Ca2+]i 作为传入活动的间接测量时，相对于轴突的细胞体尺寸较大，进一步增加了信噪比;DRG 通常易于访问;在空间上远离传入末梢的部位评估活动，可以最大限度地减少暴露神经节所需的手术对传入末梢刺激-反应特性的潜在影响。然而，由于 TG 位于大脑下方（或调色板上方），因此它们比 DRG 更难获得。此外，虽然 DRG 和 TG 神经元之间有许多相似之处，但差异也越来越多。这包括 TG22 中神经元的大致体位组织、支配的独特结构、不同的中央末端终止模式23、24、25、26，以及现在基因表达27,28 和功能受体表达29 的越来越多的差异列表.此外，由于我们对疼痛的外周机制的鉴定感兴趣，因此似乎有大量三叉神经系统特有的疼痛综合征（例如，偏头痛、三叉神经痛、灼口综合征）似乎涉及初级传入神经的异常活动30,31,32，这表明需要直接研究 TG。

因此，虽然已经用小鼠 GECI 研究了 TG 神经元的刺激-反应特性16，但由于上面列出的原因表明大鼠可能是更适合解决各种实验问题的物种，本研究的目的是开发一种使用 GECI 研究大鼠 TG 神经元的方法。为了实现这一目标，我们利用病毒方法来驱动 GECI GCaMP6 在周围神经系统中的表达。然后，我们移除了前脑以允许访问TG。最后，将机械和热刺激施加到面部，同时在荧光显微镜下评估神经元反应。总之，这些数据支持利用大鼠在许多状态下研究 TG 的变化，为对三叉神经系统中的感觉编码感兴趣的研究人员扩展了工具包。

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Protocol

所有涉及在研究中使用动物的实验均按照美国国立卫生研究院和国际疼痛研究协会提出的标准进行，并得到匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（协议#22051100）的批准。在每个实验结束时，通过用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行心脏灌注对大鼠进行安乐死，这种方法得到了美国兽医协会和匹兹堡大学IACUC的批准。

1. GCaMP 感应

  1. 订购怀孕的 Sprague Dawley 大鼠，以便幼崽可以在出生后的适当时间注射。
  2. 在处理每只大鼠幼崽之前，用 70% 的 EtOH 喷洒手套。这将阻止大坝蚕食年轻人。
  3. 用70%EtOH擦拭大鼠幼崽（P1-2），并在冰上麻醉3分钟。
  4. 使用 25 μL 无菌气密 Hamilton 注射器腹膜内注射 15 μL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40（Addgene）。

2. 三叉神经节暴露手术

  1. 根据体重对6-8周龄大鼠（约150-200g）腹膜内施用麻醉混合物（55mg / kg氯胺酮，5.5mg / kg甲苯噻嗪，1mg / kg乙酰丙嗪）。
    注意：这通常足以维持手术麻醉平面，通过没有对后爪有害捏合的退缩反射来评估。但是，如果动物变轻，则通过鼻锥补充异氟烷。
  2. 完全麻醉后，剃掉头部和面部的头发和胡须。
  3. 将大鼠安装到带有耳杆的立体定位框架上，并在下面放置加热垫（~37 oC）以保持体温。
  4. 使用鼠标血氧仪或类似仪器监测生命体征（心率、呼吸频率、血氧饱和度）。
    注意：体温由直肠探头监测，并通过将大鼠放在反馈控制的循环水毯上来维持。
  5. 将蘸有冰冷盐水的纱布放在头部，以收缩血管以尽量减少出血。使用 15 号手术刀，在颅骨上方的皮肤和肌肉上做一个中线切口。
  6. 使用皮肤和肌肉的钝解剖来暴露颅骨。
  7. 使用 1/4 圆形钻头，小心地在颅骨上穿孔以露出前脑。然后，使用rongeurs（2.5毫米杯）小心地切开头骨。
  8. 使用 15 号手术刀在大脑（Bregma：-3.80）和嗅球上切开一个切口。
    注意：超过这一点的尾部切割将导致老鼠死亡
  9. 用刮刀小心地将硬脑膜与颅骨断开，轻轻提起被切断的大脑，露出颅底的TG和颅底。
    注意：在整个提取过程中额外使用冰冷盐水灌注将最大限度地减少出血并优化以下解剖区域。
  10. 使用烧灼笔，止除拔牙引起的任何出血。
    注意：切割硬脑膜将导致不可避免的出血。最好制备冰冷的 aCSF（119 mM NaCl、26.2 mM NaHCO3、2.5 mM KCl、1 mM NaH2PO4、1.3 mM MgCl2、10 mM 葡萄糖、2.5 mM CaCl2）沐浴颅腔，以帮助收缩血管，同时保持神经元健康。

3. GCaMP6s成像

注意：鉴于这些神经元的大小和密度，使用的成像和数据采集系统（物镜、显微镜、光源、相机）将确定可视化的 GECI+ 细胞的数量。光源、物镜和相机还将决定用于图像采集的参数，包括曝光时间和图像捕获速率。虽然根据实验参数可以使用多光子和共聚焦技术，但落射荧光显微镜可能足以解析许多细胞。可以使用任何图像采集包。理想情况下，激励应用与图像采集软件包进行时间锁定。

  1. 将颅骨腔放在物镜下方，并使用可见光使TG聚焦。
  2. GCaMP6s的激发波长为496 nm，发射波长为513 nm;因此，使用适当的二向色性和滤波立方体来定位 GCaMP+ 细胞。调整焦点以定位和解析神经节区域，其中神经元对施加到感兴趣感受野的刺激做出反应。
  3. 使用 10 倍物镜可实现 TG 中大多数神经元对施加到面部 1 cm2 区域的机械刺激做出反应的可视化16。使用工作距离长 （10.8 mm） 的 20 倍干物镜以提高分辨率。
  4. 使用采集软件（例如，Metamorph）收集随时间变化的荧光数据，并响应刺激应用。
    1. 为了尽量减少神经元的光漂白，请使用尽可能短的曝光时间来检测基线和诱发的荧光增加。使用本研究中使用的 20 倍、0.40 NA 空气物镜、120 W 卤化汞光源和互补金属氧化物半导体 （CMOS） 相机，曝光时间为 300 ms，图像采集速率为 3 Hz，可获得 >90 分钟的稳定基线记录。
      注：1）这些图像采集参数必须根据经验确定。2）机械（刷子、点状、振动、捏）、热（热和冷）和化学（辣椒素、薄荷醇、炎症介质）可以应用于感受野。一种相对便宜的主观方法是用手施加刺激。然而，建议采用更客观和可重复的方法，其中反馈控制执行器可用于在已知力下重复应用。虽然反馈控制的帕尔贴器件可用于受控加热和冷却，但它们并不适用于曲面的热刺激。反馈控制的红外光源是加热的替代方案，而冷喷雾是不太理想的冷却替代方案。

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Representative Results

由于我们之前已成功使用AAV9血清型感染大鼠感觉神经元15，因此我们将该血清型用于大鼠TG神经元中GCaMP6s的表达。因此，我们首先试图评估 AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 （AAV9-GCaMP） 对新生大鼠幼崽施用该病毒时的感觉神经元感染效率20。该病毒利用CAG启动子，该启动子驱动和维持高水平的基因表达。此外，AAV9已被证明在给予新生大鼠时可以有效地感染感觉神经元33。首次注射在出生后第5天（p5）幼崽中使用5μL，效率约为51.66%±14.33%（图1A）。为了提高感染率，我们最终在年轻大鼠（p2）中使用了更大体积的病毒（15μL），保持2.4×1014 的病毒滴度不变。该策略导致91.84%±3.18%（n = 8）的神经元感染（图1B）。

为了可视化支配振动垫的 TG 神经元，我们接下来开发了一种手术策略来暴露体内 TG。大约 60% 的前脑可以在不影响主要呼吸中枢的情况下切除。这对应于Bregma -3.80的脑组织喙部。暴露的 TG（左）和眶下神经的神经支配区域（ION，右）的示意图如图 2 所示。通过对振动垫施加光机械刺激（刷子）来确定引起振动垫神经支配的 TG 区域，同时监测 20 倍荧光的变化。正如预测的那样，支配面部上颌支的 TG 的 V2 区域是唯一被激活的区域。也就是说，虽然没有系统地研究，但当所研究的神经元可以通过施加到振动垫的刺激被激活时，对施加在 V1（前额皮肤）或 V3（下颌骨上的皮肤）区域的刺激没有检测到荧光的变化。然后监测基线荧光的变化和对施加到振动垫的刺激的反应。感兴趣区域（V2）在图3A中划定。与先前关于感觉神经元中相对较低的静息活动水平的报道一致34，大多数神经元的静息荧光相对较低，并且几乎没有荧光自发增加的证据（图3B）。用于识别外围神经元中刺激诱发活动的标准 6,16,21 和 CNS 12,35,36 是一个不断发展的领域，具有多个已免费提供的复杂工作流程包37,38。对所采用的各种方法的优缺点的全面讨论超出了本手稿的范围。由于这不是本研究的重点，我们使用了相对武断和主观的标准，该标准基于在没有明显可检测神经元的神经节区域观察到的峰值反应（基于看到细胞核的能力），因此如果荧光的增加与刺激应用的时间锁定（在刺激应用后 1 秒内检测到的荧光增加（基于以下假设：在距离细胞体不超过 3 cm 的位点启动的最慢导电轴突 （0.2 m/s） 中启动的动作电位应在不到一秒的时间内到达细胞体），并且是 >6 倍检测到的峰值响应标准偏差 （ΔF/F） 检测到的控制位点（图 3C）。接下来，我们表征了这些神经元对自然刺激的反应特性：刷子、点状、热和冷。对每种刺激的反应示例如图 4 所示。值得注意的是，对点状刺激的反应（最常用于疼痛相关研究）具有最强大的反应（图4B，F）。

我们开发这项技术的目标是能够评估TG神经元中群体编码的变化。因此，我们将慢性收缩损伤应用于 ION （CCI-ION），如前所述29，以研究神经损伤后 2 周的大鼠。在模型诱导之后，我们暴露了 TG 并评估了 TG 同侧和对侧损伤部位的静息和诱发活动。有趣的是，相对于施加在对侧的相同刺激的峰值反应，神经损伤侧对刷子的峰值诱发反应的幅度增加了~2倍（图5A-C）。此外，当连续施加两个刷子刺激时（刺激间隔为10秒），受伤但未受伤的一侧对第二个刺激的反应幅度显着放大（图5D）。

最后，作为初步对照实验，以确认刺激诱发的荧光增加是由于在外周启动的动作电位，我们评估了河豚毒素（1μM）对刺激诱发反应的影响。如前所述，经皮注射 200 μL 的 TTX，以靶向眶下神经。如图 6 所示，诱发活动几乎完全消除。综上所述，这些结果证明了使用AAV9-GCaMP在体内询问TG群体反应的效用。

Figure 1
图 1：新生儿 AAV 注射后 TG 神经元中 GCaMP6s 感染的高效性。 （A） 腹膜内注射 5 μL pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 （滴度：2.4 x10 14） 病毒的 P5 大鼠幼崽：在 51.7 ± 14.3% 的 TG 神经元中检测到 GCaMP6s 表达（n = 每只动物 3 片，7 只大鼠）。（B） 将年轻动物的注射量增加到 15 μL （p2） 提高了感染效率：在 91.8 ± 3.2% 的 TG 神经元中检测到 GCaMP6s 表达（n = 每只动物 3 片，8 只大鼠）。左侧的面板对 GCaMP6 进行了染色。中间的面板用神经元特异性标记物NeuN染色。右侧的面板是 GCaMP6 和 NeuN 面板的合并图像。第一个面板中的比例尺对于所有后续面板都是相同的。右图是GCaMP6s表达（平均值±SEM）占每只动物每片神经元总数的百分比，其中单个点是每只动物的数据。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2：三叉神经节 （TG）、眶下神经 （ION） 和面部区域（振动垫）受刺激的位置。 （A） 切除前脑以进入 TG。（B） 相对于 ION 和 TG 施加自然刺激的面部区域。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3：刺激诱发的 GCaMP6 荧光增加。 （A） 20倍放大倍率下的总视野。指示 TG 的眼科 （V1） 和上颌 （V2） 分区。（乙、丙）框中的区域显示在图 B 和 C 中，分别是振动垫刷刺激前后的荧光图像。白色圆圈是感兴趣的比较区域。神经元被认为对刺激有反应，这是基于在感兴趣的比较区域观察到的荧光峰值变化，如文中所述。第一个面板中的比例尺对于两个面板是相同的。（D） B 和 C 中显示的神经元荧光的代表性变化，以响应施加到面部的刷子刺激。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图4：根据神经元对施加到面部的刺激的反应对神经元进行分类。TG神经元在（上图-基线）和之后（中图-刺激）对1厘米骆驼毛刷（A-刷子），1厘米2网格的单丝（B-点状），加热（C-热）和冷却（D-冷）的反应之前（上图-基线）和之后（中图-刺激）应用于面部的同一区域。第一个面板中的比例尺对于所有后续面板都是相同的。橙色圆圈表示响应神经元的示例。白色圆圈是感兴趣的比较区域。（E-H）每个刺激的每个反应的代表性轨迹。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5：神经损伤会增加 TG 神经元的刷诱发反应。 TG神经元对眶下神经慢性收缩损伤（A，Contra）对侧的大鼠面部或神经损伤同侧（B，Ipsi）的典型反应。（C） 对来自六只大鼠的反应神经元的汇总数据的分析（绘制的数据是每只大鼠）证实，对刷子的第一次反应幅度的差异是显着的（配对 t 检验）。（D）当对第一次和第二次刺激应用的峰值反应以比率（R2 / R1）进行分析时，对合并数据的分析证实，神经损伤侧的反应比率的增加是显着的。** p < 0.01 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6：河豚毒素 （TTX） 在 TG 神经元中的诱发电场阻断。（A） 在施加刷子刺激（蓝条）后注射眶下神经附近的 TTX（200 μL，1 μM）后，来自同侧神经损伤的 TG 神经元的荧光数据。（B）来自三只大鼠的汇总峰值反应数据。 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

在这里，我们展示了一种快速、非侵入性的方法，用于生成用于 TG 成像的 GECI 大鼠。我们选择了CAG启动子来驱动和维持高水平的基因表达。虽然先前的研究表明其他 AAV 血清型可以有效地驱动 DRG 神经元中的基因表达39，但我们的结果与最近一项涉及在新生儿腹膜内注射 AAV的研究一致 32，表明 AAV9 血清型在大鼠新生儿感觉神经元感染中非常有效。

通过对这种技术进行故障排除，值得注意的是一些可能阻止最佳感染的陷阱。要记住的主要变量是幼崽的年龄。大鼠神经系统在出生后的前 7 天内迅速发育40.我们尝试在较晚的时间点（例如，p4-7）进行感染，这导致了可变且效率低下。较早的时间点 （p1-4） 产生更强大和一致的效率，其中 p1-2 产生最高的感染率。第二个变量是注射量。无论年龄大小，至少需要 15 μL 才能在滴度为 2.5 x 1014 的 TG 或 DRG 中产生超过 70% 的效率。我们发现，即使在 p2 时，腹腔内注射少于 10 μL 在成人中也很少表达。以较低的体积进行更局部的注射，即直接注射到感兴趣的感受野中，可能会产生类似的效果。然而，这种方法需要幼崽被完全麻醉，并可能对感兴趣的组织造成创伤。最后，较小的体积可能与较高的滴度一起使用。

暴露 TG 用于 GECI 成像先前已在小鼠中进行 16。然而，将这种方法转化为大鼠揭示了几个值得考虑的问题。首先，大鼠的头骨和硬脑膜的厚度远大于小鼠。因此，取下颅骨帽可能会带来挑战。我们发现，小钻头是穿孔颅帽的有效方法，然后可以用 rongeurs 将其移除。第二个问题是大脑被切除后出血。对于制剂的寿命和成像的清晰度（如果不是神经元的特性）来说，这可能是一个持续存在的问题。可以将蘸有冰冷脑脊液的纱布涂在大脑的暴露表面，以帮助关闭主要动脉。使用小型烧灼笔也可能有效阻止进一步出血。最后，位于成像窗口对侧的凝胶泡沫也可能有助于防止血液和脑脊液引起成像问题。第三个考虑因素是要切除的大脑数量。我们发现，将脑尾部切除至 ~Bregma -3.80 将导致切除后一小时内死亡。因此，大脑应分小段切除，尽可能多地保留，同时尽可能多地暴露TG。

如引言所述，[Ca2+]i 是神经元活动的间接量度，因此，[Ca2+]i 的增加并不一定意味着神经活动的增加。因此，对照实验对于确认被认为是诱发活动的东西实际上是活动本身至关重要。例如，电诱发刺激应产生 [Ca2+]i 的时间锁定增加， 其规模与自然诱发刺激的规模相似。重要的是，这种活动应该通过神经阻滞（即 TTX）来消除。然而，同样重要的是要注意，尽管有这些重要的控制，仍然有可能一些明显诱发的 [Ca2+]i 增加是由于神经节内的信号传导，例如，由于神经节内的递质释放 41，而不是由于在外周启动的动作电位侵入细胞体。

虽然我们的结果证实，先前的研究者 16,42,43 表明与感觉体细胞中 GCaMP 荧光变化相关的信噪比足以与标准落射荧光显微镜一起使用，但本研究中使用的神经损伤等操作可能与神经元活动和 Ca 2+ 信号传导的这种显着变化有关34，整个神经节的反应可能与表观背景的大幅增加有关，以至于单个神经元的反应可能被人为地减弱。虽然已经开发出可能有助于解决这一局限性的成像处理方法44，但可能需要共聚焦或多光子成像来最有效地解决这个问题。

综上所述，该技术提供了一种在群体水平上研究大鼠TG神经元刺激-反应特性的方法。我们对ION的CCI的结果证实了检测这些刺激-反应特性变化的可行性。虽然本研究中仅采用机械和热刺激，但该制剂应适合应用化学刺激以充分定义 TG 神经元的刺激-反应特性。同样，虽然我们专注于皮肤传入神经的刺激反应特性，但由于皮肤神经创伤性损伤后出现动态机械异常性疼痛等现象，也应该有可能检测到支配其他颅面结构（如颞下颌关节）的传入神经特性的变化（响应无害与有害的下颌运动）， 角膜或舌头。AAV9 血清型的外周注射允许神经元特异性诱导 PNS 特异性的 GCaMP。该策略的一个主要优点是，病毒标记在有丝分裂后细胞（即神经元）中提供稳健、持久的表达，但在有丝分裂细胞（例如上皮细胞）中则不然。此外，对不同 PNS 组织的初步筛选表明，这种病毒策略也可用于研究副/交感神经节、DRG 和肠道神经系统（数据未显示）。

这种 体内 制备也为探索当前文献中缺乏的许多比较提供了基础。大鼠 TG 和 DRG、大鼠与小鼠 TG 之间的 体内 种群研究尚未进行。这里提供的数据说明了将要进行的这些重要实验的新可行性。

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Disclosures

在开发这种制剂的过程中，Gold博士得到了Grunenthal的资助。Grunenthal 研究的重点与本手稿中描述的制备工作没有重叠。其他作者均未披露任何其他潜在的利益冲突。

Acknowledgments

我们要感谢 Kathy Albers 博士和 Brian Davis 博士使用他们的徕卡显微镜和 Metamorph 程序，感谢 Charles Warwick 帮助构建我们的热帕尔帖设备，感谢 Raymond Sekula 博士帮助解决手术准备问题。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助：F31NS125993（JYG），T32NS073548（JYG）和R01NS122784（MSG和RS）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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神经科学，第204期，
<em>体内</em> 大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像
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Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

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