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Neuroscience

In-Vivo Imagerie calcique des neurones sensoriels dans le ganglion trijumeau du rat

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

Les indicateurs calciques codés génétiquement (GECI) permettent une analyse robuste de la signalisation des neurones sensoriels à l’échelle de la population. Ici, nous avons développé une nouvelle approche qui permet de visualiser in vivo l’activité des neurones des ganglions trijumeaux chez le rat.

Abstract

Les indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) permettent aux techniques d’imagerie de surveiller les changements dans le calcium intracellulaire dans des populations cellulaires ciblées. Leur rapport signal/bruit élevé fait des GECI un outil puissant pour détecter l’activité évoquée par un stimulus dans les neurones sensoriels. Les GECI facilitent l’analyse au niveau de la population de l’encodage des stimuli avec le nombre de neurones pouvant être étudiés simultanément. Cet encodage de population est le plus approprié in vivo. Les ganglions de la racine dorsale (DRG), qui abritent le soma des neurones sensoriels innervant les structures somatiques et viscérales sous le cou, sont les plus largement utilisés pour l’imagerie in vivo car ces structures sont relativement faciles d’accès. Plus récemment, cette technique a été utilisée chez la souris pour étudier les neurones sensoriels du ganglion trijumeau (TG) qui innervent les structures buccales et craniofaciales. Il existe de nombreuses raisons d’étudier la TG en plus de la DRG, y compris la longue liste de syndromes douloureux spécifiques aux structures buccales et craniofaciales qui semblent refléter des changements dans l’activité des neurones sensoriels, tels que la névralgie du trijumeau. Les souris sont les plus utilisées dans l’étude des neurones DRG et TG en raison de la disponibilité d’outils génétiques. Cependant, avec des différences de taille, de facilité de manipulation et des différences d’espèces potentiellement importantes, il y a des raisons d’étudier les neurones TG du rat plutôt que de la souris. Ainsi, nous avons développé une approche pour l’imagerie des neurones TG de rat in vivo. Nous avons injecté des chiots nouveau-nés (p2) par voie intrapéritonéale avec un AAV codant pour GCaMP6s, ce qui a entraîné une infection de >90% des neurones TG et DRG. La TG a été visualisée chez l’adulte après craniotomie et décortication, et les changements dans la fluorescence de GCaMP6s ont été surveillés dans les neurones TG après stimulation des régions mandibulaires et maxillaires du visage. Nous avons confirmé que les augmentations de fluorescence étaient provoquées par un stimulus avec un bloc nerveux périphérique. Bien que cette approche ait de nombreuses utilisations potentielles, nous l’utilisons pour caractériser la ou les sous-populations de neurones TG modifiées à la suite d’une lésion des nerfs périphériques.

Introduction

La somatosensation, c’est-à-dire l’encodage neuronal des stimuli mécaniques, thermiques et chimiques qui affectent la peau ou d’autres structures corporelles, y compris les muscles, les os et les viscères, commence par l’activité des neurones afférents primaires qui innerventces structures. Les approches électrophysiologiques basées sur une seule unité ont fourni une mine d’informations sur les sous-types afférents impliqués dans ce processus ainsi que sur la façon dont leurs propriétés stimulus-réponses peuvent changer au fil du temps 1,2,3. Cependant, bien qu’il reste des preuves solides à l’appui de la théorie des lignes marquées, qui suggère que des modalités sensorielles spécifiques sont véhiculées par une ou plusieurs sous-populations spécifiques de neurones, la capacité de nombreuses sous-populations de neurones à répondre aux mêmes types de stimuli mécaniques, thermiques et chimiques suggère que la majorité des stimuli somatosensoriels sont codés par plusieurs sous-populations de neurones4, 5. Le Ainsi, une meilleure compréhension de la somatosensation ne viendra qu’avec la capacité d’étudier l’activité de 10, voire de centaines, de neurones simultanément.

Les progrès des approches optiques avec l’avènement relativement récent des techniques d’imagerie confocale et, par la suite, multiphotonique et numérique ont facilité la capacité d’effectuer des analyses relativement non invasives de l’activité neuronale à l’échelle de la population 6,7. L’un des derniers obstacles à l’application de cette technologie a été le développement d’outils permettant l’évaluation optique de l’activité neuronale. Compte tenu de la vitesse d’un potentiel d’action qui peut commencer et se terminer en moins d’une milliseconde, un colorant sensible à la tension ayant la capacité de suivre les changements de potentiel membranaire à la vitesse d’un potentiel d’action serait l’outil idéal à cet effet. Mais bien qu’il y ait eu d’énormes progrès dans ce domaine 7,8,9,10, le rapport signal/bruit pour beaucoup de ces colorants n’est pas encore assez élevé pour permettre une analyse de population de centaines de neurones au niveau d’une seule cellule. Comme approche alternative, les chercheurs se sont tournés vers la surveillance des changements dans la concentration intracellulaire de Ca2+ ([Ca2+]i). Les limites de cette stratégie sont claires dès le départ et comprennent le fait qu’une augmentation de [Ca2+]i est une mesure indirecte de l’activité neuronale11 ; qu’une augmentation de [Ca2+]i peut se produire indépendamment de l’afflux de Ca2+ associé à l’activation des canaux Ca2+ voltage-dépendants (VGCC)12,13 ; que l’amplitude et la durée d’un transitoire de Ca2+ peuvent être contrôlées par des processus indépendants de l’activité du VGCC 11,12,14 ; et que l’évolution temporelle des transitoires Ca2+ dépasse de loin celle d’un potentiel d’action15. Néanmoins, il existe un certain nombre d’avantages significatifs associés à l’utilisation du Ca2+ comme mesure indirecte de l’activité neuronale. Le rapport signal/bruit associé à la plupart des indicateurs de Ca2+ n’est pas le moindre, reflétant à la fois l’ampleur du changement de Ca2+ intracellulaire et le fait que le signal provient de l’espace tridimensionnel du cytosol plutôt que de l’espace bidimensionnel de la membrane cellulaire. De plus, avec le développement d’indicateurs de Ca2+ codés génétiquement (GECI), il est possible de tirer parti de stratégies génétiques pour stimuler l’expression des indicateurs de Ca2+ dans des sous-populations spécifiques de cellules, facilitant ainsi les analyses au niveau de la population dans des préparations intactes (voir par exemple, voir16).

Compte tenu du nombre d’outils génétiques maintenant disponibles chez la souris, il n’est pas surprenant que les GECI aient été les plus largement utilisés chez cette espèce. Des lignées de souris avec une expression constitutive de GECI dans des sous-populations de neurones sensoriels ont été développées 7,16,17. Avec le développement de lignées de souris exprimant des recombinases dans des types cellulaires spécifiques, il est possible d’utiliser des stratégies encore plus sophistiquées pour contrôler l’expression de GECI15. Cependant, bien que ces outils soient de plus en plus puissants, il existe un certain nombre de raisons pour lesquelles d’autres espèces, telles que les rats, pourraient être plus appropriées pour certaines questions expérimentales. Il s’agit notamment de la plus grande taille, facilitant un certain nombre de manipulations expérimentales qui sont difficiles, voire impossibles, chez la souris plus petite ; la facilité d’entraîner les rats à des tâches comportementales relativement complexes ; et au moins quelques preuves que les propriétés biophysiques et les modèles d’expression de plusieurs canaux ioniques dans les neurones sensoriels du rat peuvent être plus similaires à ceux observés dans les neurones sensoriels humains que ne le sont les mêmes canaux chez la souris par rapport à l’homme18.

Alors que la transduction des stimuli somatosensoriels se produit généralement dans les terminaisons périphériques des afférences primaires, le potentiel d’action initié à la périphérie doit passer à travers la structure qui abrite les somates afférents primaires, appelés ganglions de la racine dorsale (DRG) ou du trijumeau (TG) avant d’atteindre le système nerveux central19. Bien qu’il existe des preuves que tous les potentiels d’action se propageant le long d’un axone afférent primaire n’envahiront pas le corps cellulaire20, conséquence du fait que les somata afférents primaires sont connectés à l’axone afférent principal via une jonction en T19, la majorité des potentiels d’action initiés à la périphérie semblent envahir le soma21. Cela confère trois avantages expérimentaux lors de l’utilisation de GECI pour évaluer le codage de population dans les afférences primaires : la grande taille du corps cellulaire par rapport aux axones augmente encore le rapport signal/bruit lors de l’utilisation de [Ca2+]i comme mesure indirecte de l’activité afférente ; les DRG sont généralement faciles d’accès ; et l’évaluation de l’activité sur un site éloigné dans l’espace des terminaisons afférentes minimise l’impact potentiel de la chirurgie nécessaire pour exposer les ganglions sur les propriétés stimulus-réponse des terminaisons afférentes. Cependant, comme les TG sont situés sous le cerveau (ou au-dessus de la palette), ils sont beaucoup plus difficiles d’accès que les DRG. De plus, bien qu’il existe de nombreuses similitudes entre les neurones DRG et TG, il existe également une liste croissante de différences. Cela inclut l’organisation grossièrement somatotopique des neurones dans le TG22, des structures uniques innervées, différents modèles de terminaison terminale centrale 23,24,25,26, et maintenant une liste croissante de différences dans l’expression des gènes27,28 et l’expression des récepteurs fonctionnels29. De plus, parce que nous nous intéressons à l’identification des mécanismes périphériques de la douleur, le nombre relativement élevé de syndromes douloureux qui semblent être uniques au système trijumeau (par exemple, migraine, névralgie du trijumeau, syndrome de la bouche brûlante) qui semblent impliquer une activité aberrante dans les afférences primaires 30,31,32, suggère que le TG doit être étudié directement.

Ainsi, bien que les propriétés stimulus-réponse des neurones TG aient été étudiées avec des GECI chez la souris16, parce que les raisons énumérées ci-dessus suggèrent que le rat pourrait être une espèce plus appropriée pour répondre à une variété de questions expérimentales, le but de la présente étude était de développer une approche pour utiliser les GECI pour étudier les neurones TG chez le rat. Pour y parvenir, nous avons utilisé une approche virale pour piloter l’expression des GECI GCaMP6 dans le système nerveux périphérique. Nous avons ensuite retiré le cerveau antérieur pour permettre l’accès au TG. Enfin, des stimuli mécaniques et thermiques ont été appliqués au visage tandis que les réponses neuronales ont été évaluées par microscopie à fluorescence. Ensemble, ces données soutiennent un rôle dans l’utilisation du rat pour étudier les changements dans le TG dans de nombreux États, élargissant ainsi la boîte à outils pour les chercheurs intéressés par le codage sensoriel dans le système trijumeau.

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Protocol

Toutes les expériences impliquant l’utilisation d’animaux dans la recherche ont été réalisées conformément aux normes mises de l’avant par les National Institutes of Health et l’Association internationale pour l’étude de la douleur et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh (protocole #22051100). À la fin de chaque expérience, les rats ont été euthanasiés par exanguination avec perfusion cardiaque de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), une approche approuvée par l’American Veterinary Medical Association et l’IACUC de l’Université de Pittsburgh.

1. Initiation au GCaMP

  1. Commandez des rats Sprague Dawley gestants afin que les chiots puissent être injectés au moment approprié après la naissance.
  2. Vaporisez les gants avec 70 % d’EtOH avant de manipuler chaque rateau. Cela dissuadera la mère de cannibaliser les jeunes.
  3. Écouvillonner les ratons (P1-2) avec 70% d’EtOH et anesthésier sur de la glace pendant 3 min.
  4. Injecter 15 μL d’AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue Hamilton stérile et étanche au gaz de 25 μL.

2. Chirurgie d’exposition du ganglion du trijumeau

  1. Administrer un cocktail anesthésique (55 mg/kg de kétamine, 5,5 mg/kg de xylazine, 1 mg/kg d’acépromazine) par voie intrapéritonéale en fonction du poids corporel à des rats âgés de 6 à 8 semaines (environ 150 à 200 g).
    REMARQUE : Ceci est généralement suffisant pour maintenir un plan chirurgical d’anesthésie, tel qu’évalué par l’absence d’un réflexe de retrait au pincement nocif d’une patte arrière. Cependant, complétez avec de l’isoflurane via un cône nasal si les animaux deviennent légers.
  2. Une fois complètement anesthésié, rasez les cheveux et les moustaches de la tête et du visage.
  3. Montez le rat sur un cadre stéréotaxique avec des barres auriculaires et placez un coussin chauffant (~37 oC) en dessous pour maintenir la température corporelle.
  4. Surveillez les signes vitaux (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, saturation en oxygène du sang) à l’aide d’un oxymètre de souris ou d’un appareil comparable.
    REMARQUE : La température corporelle est surveillée par une sonde rectale et maintenue en plaçant les rats sur une couverture d’eau à circulation contrôlée par rétroaction.
  5. Placez de la gaze trempée dans une solution saline glacée sur la tête pour resserrer les vaisseaux sanguins afin de minimiser les saignements. À l’aide d’un scalpel de taille 15, faites une incision médiane de la peau et du muscle sur le crâne.
  6. Utilisez une dissection contondante de la peau et des muscles pour exposer le crâne.
  7. À l’aide d’un foret rond 1/4, perforez soigneusement la calotte crânienne pour exposer le cerveau antérieur. Ensuite, utilisez des rongeurs (bonnet de 2,5 mm) pour couper soigneusement le crâne.
  8. À l’aide d’un scalpel de taille 15, faites une incision dans le cerveau (Bregma : -3,80) et le bulbe olfactif.
    REMARQUE : Couper plus caudalement au-delà de ce point entraînera la mort du rat
  9. À l’aide d’une spatule, déconnectez soigneusement la dure-mère du crâne et soulevez doucement le cerveau sectionné pour révéler le TG et la base du crâne.
    REMARQUE : L’utilisation supplémentaire d’une perfusion saline glacée tout au long de l’extraction minimisera les saignements et optimisera le champ de dissection suivant.
  10. À l’aide d’un stylo de cautérisation, endiguer tout saignement résultant de l’extraction.
    REMARQUE : Couper la dure-mère entraînera un saignement inévitable. Il est préférable de préparer de l’aCSF glacé (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glucose, 2,5 mM CaCl2) pour baigner la cavité crânienne afin d’aider à resserrer les vaisseaux sanguins tout en maintenant la santé neuronale.

3. Imagerie GCaMP6s

NOTE : Compte tenu de la taille et de la densité de ces neurones, le système d’imagerie et d’acquisition de données utilisé (objectif, microscope, source lumineuse, caméra) déterminera le nombre de cellules GECI+ visualisées. La source lumineuse, l’objectif et l’appareil photo détermineront également les paramètres utilisés pour l’acquisition de l’image, notamment le temps d’exposition et le taux de capture de l’image. Bien que les techniques multiphotoniques et confocales puissent être utilisées en fonction des paramètres de l’expérience, la microscopie à épifluorescence peut suffire à résoudre de nombreuses cellules. N’importe quel logiciel d’acquisition d’images peut être utilisé. Idéalement, l’application du stimulus est verrouillée dans le temps avec le logiciel d’acquisition d’images.

  1. Placez la cavité crânienne sous l’objectif et faites la mise au point sur le TG à l’aide de la lumière visible.
  2. La longueur d’onde d’excitation des GCaMP6 est de 496 nm et sa longueur d’onde d’émission est de 513 nm ; par conséquent, utilisez les cubes dichroïques et filtrants appropriés pour localiser les cellules GCaMP+ . Ajustez la mise au point pour localiser et résoudre la zone des ganglions dans laquelle les neurones répondent aux stimuli appliqués au champ récepteur d’intérêt.
  3. Utilisez un objectif 10x pour permettre la visualisation de la plupart des neurones du TG répondant à des stimuli mécaniques appliqués à une région de 1 cm2 du visage16. Utilisez un objectif sec 20x avec une longue distance de travail (10,8 mm) pour augmenter la résolution.
  4. Utiliser un logiciel d’acquisition (p. ex., Metamorph) pour recueillir des données de fluorescence au fil du temps et en réponse à l’application d’un stimulus.
    1. Pour minimiser le photoblanchiment des neurones, utilisez un temps d’exposition aussi court que possible pour détecter les augmentations initiales et évoquées de la fluorescence. Avec l’objectif à air 20x, 0,40 NA, une source lumineuse aux halogénures de mercure de 120 W et une caméra CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) utilisée dans la présente étude, un temps d’exposition de 300 ms et un taux d’acquisition d’images de 3 Hz, obtenez des enregistrements de base stables pendant >90 min.
      NOTE : 1) Ces paramètres d’acquisition d’images doivent être déterminés empiriquement. 2) Des applications mécaniques (brosse, ponctuation, vibration, pincement), thermiques (chaleur et froid) et chimiques (capsaïcine, menthol, médiateurs inflammatoires) peuvent être appliquées sur le champ récepteur. Une approche subjective relativement peu coûteuse consiste à appliquer les stimuli à la main. Des approches plus objectives et reproductibles sont toutefois recommandées, lorsque des actionneurs contrôlés par rétroaction peuvent être utilisés pour une application répétée à une force connue. Bien que les dispositifs Peltier contrôlés par rétroaction soient utiles pour le chauffage et le refroidissement contrôlés, ils ne sont pas idéaux pour la stimulation thermique d’un visage incurvé. Les sources de lumière infrarouge contrôlées par rétroaction sont une alternative pour le chauffage, et la pulvérisation froide est une alternative moins qu’idéale pour le refroidissement.

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Representative Results

Comme nous avons déjà eu du succès avec le sérotype AAV9 pour l’infection des neurones sensoriels du rat15, nous avons utilisé ce sérotype pour l’expression des GCaMP6 dans les neurones TG du rat. Nous avons donc d’abord cherché à évaluer l’efficacité de l’infection des neurones sensoriels par AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) lorsque ce virus a été administré à des ratons nouveau-nés20. Ce virus utilise le promoteur CAG, qui entraîne et maintient des niveaux élevés d’expression génique. De plus, il a été démontré que l’AAV9 infecte efficacement les neurones sensoriels lorsqu’il est administré à des rats nouveau-nés33. Les premières injections ont utilisé 5 μL chez les chiots du 5e jour postnatal (p5), ce qui a donné une efficacité d’environ 51,66 % ± 14,33 % (Figure 1A). Pour augmenter le taux d’infection, nous avons finalement utilisé un plus grand volume de virus (15 μL) chez des rats plus jeunes (p2), en gardant le titre du virus de 2,4 x 1014 le même. Cette stratégie a entraîné l’infection de 91,84 % ± 3,18 % (n = 8) des neurones (Figure 1B).

Pour visualiser les neurones TG innervant le coussinet vibrissal, nous avons ensuite développé une stratégie chirurgicale pour exposer le TG in vivo. Environ 60 % du cerveau antérieur peut être enlevé sans affecter les principaux centres respiratoires. Cela correspond au tissu cérébral rostral à Bregma -3,80. Un schéma du TG exposé (à gauche) et du territoire d’innervation du nerf infraorbitaire (ION, à droite) est présenté à la figure 2. La région du TG à l’origine de l’innervation du coussinet vibrissal a été déterminée par l’application d’une stimulation mécanique légère (brosse) sur le coussinet vibrissal tout en surveillant les changements de fluorescence à 20x. Comme prévu, la région V2 du TG, qui innerve la division maxillaire du visage, a été la seule zone activée. C’est-à-dire que, bien qu’ils n’aient pas été étudiés systématiquement, aucun changement de fluorescence n’a été détecté en réponse à des stimuli appliqués aux régions V1 (peau sur le front) ou V3 (peau sur la mandibule) lorsque les neurones étudiés pouvaient être activés avec des stimuli appliqués sur le coussinet vibrissal. Les changements de fluorescence à l’inclusion et en réponse aux stimuli appliqués sur le vibrissal ont ensuite été surveillés. La région d’intérêt (V2) est délimitée à la figure 3A. Conformément aux rapports précédents de niveaux relativement faibles d’activité au repos dans les neurones sensoriels34, la fluorescence au repos était relativement faible dans la plupart des neurones, et il y avait peu de preuves d’augmentations spontanées de la fluorescence (Figure 3B). Les critères utilisés pour identifier l’activité évoquée par le stimulus dans les neurones de la périphérie 6,16,21 et du SNC 12,35,36 sont un domaine en évolution avec plusieurs packages de flux de travail sophistiqués qui ont été mis à disposition gratuitement 37,38. Une discussion complète des forces et des faiblesses des diverses approches employées dépasse le cadre du présent manuscrit. Comme ce n’était pas l’objet de la présente étude, nous avons utilisé des critères relativement arbitraires et subjectifs basés sur le pic de réponse observé dans les régions des ganglions dans lesquelles il n’y avait pas de neurones clairement détectables (basés sur la capacité de voir le noyau), de sorte qu’un neurone était considéré comme réceptif à un stimulus si l’augmentation de la fluorescence était liée à l’application du stimulus (augmentation de la fluorescence détectée dans les 1 s suivant l’application du stimulus ( basé sur l’hypothèse qu’un potentiel d’action initié dans les axones conducteurs les plus lents (0,2 m/s) initié à un site situé à moins de 3 cm du corps cellulaire devrait atteindre le corps cellulaire en moins d’une seconde), et qu’il était >6 fois l’écart-type de la réponse maximale (ΔF/F) détecté un site témoin (Figure 3C). Ensuite, nous avons caractérisé les propriétés de réponse de ces neurones aux stimuli naturels : brosse, ponctué, chaleur et froid. Des exemples de réponses à chacun de ces stimuli sont présentés à la figure 4. Notamment, la réponse à la stimulation ponctuée, qui est le plus souvent utilisée dans les études liées à la douleur, a la réponse la plus robuste (Figure 4B,F).

Notre objectif en développant cette technique était de pouvoir évaluer les changements dans le codage de la population dans les neurones TG. Ainsi, nous avons adapté la lésion de constriction chronique à l’ION (CCI-ION), comme précédemment utilisé29, pour étudier des rats 2 semaines après une lésion nerveuse. À la suite de l’induction du modèle, nous avons exposé le TG et évalué l’activité au repos et évoquée dans le TG ipsilatéral et controlatéral au site de la lésion. Il est intéressant de noter que l’amplitude du pic de réponse évoqué au brossage a été multipliée par ~2 du côté lésiné par rapport au pic de réponse au même stimulus appliqué au côté controlatéral (Figure 5A-C). De plus, lorsque deux stimuli de brosse ont été appliqués en série (avec un intervalle inter-stimulus de 10 s), il y a eu une amplification significative de l’amplitude de la réponse au deuxième stimulus du côté blessé mais non blessé (Figure 5D).

Enfin, dans le cadre d’une première expérience de contrôle visant à confirmer que l’augmentation de la fluorescence évoquée par le stimulus était due à des potentiels d’action initiés en périphérie, nous avons évalué l’impact de la tétrodotoxine (1 μM) sur les réponses évoquées par le stimulus. TTX a été injecté dans un volume de 200 μL par voie percutanée comme décrit précédemment28 afin de cibler le nerf infraorbitaire. Comme le montre la figure 6, l’activité évoquée a été presque complètement éliminée. Pris ensemble, ces résultats démontrent l’utilité de l’utilisation de l’AAV9-GCaMP pour interroger les réponses de la population TG in vivo.

Figure 1
Figure 1 : Haute efficacité de l’infection par GCaMP6s dans les neurones TG avec injection néonatale d’AAV. (A) Des ratons P5 ont reçu une injection intrapéritonéale de 5 μL de virus pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (titre : 2,4 x10 14) : L’expression de GCaMP6s a été détectée dans 51,7 ± 14,3 % des neurones TG (n = 3 coupes par animal, 7 rats). (B) L’augmentation du volume d’injection à 15 μL chez les jeunes animaux (p2) a amélioré l’efficacité de l’infection : l’expression de GCaMP6s a été détectée dans 91,8 ± 3,2 % des neurones TG (n = 3 coupes par animal, 8 rats). Les panneaux de gauche ont été teintés pour les GCaMP6. Les panneaux au milieu ont été colorés avec du NeuN, un marqueur spécifique aux neurones. Les panneaux de droite sont une image fusionnée des panneaux GCaMP6s et NeuN. La barre d’échelle dans le premier panneau est la même pour tous les panneaux suivants. Le graphique de droite est un graphique de l’expression de GCaMP6s (moyenne ± MEB) en pourcentage du nombre total de neurones par tranche et par animal, où les points individuels sont les données pour chaque animal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Localisation du ganglion trijumeau (TG), du nerf sous-orbitaire (ION) et de la zone du visage (coussinet vibrissal) stimulés. (A) Le cerveau antérieur a été retiré pour permettre l’accès au TG. (B) Zone du visage dans laquelle des stimuli naturels ont été appliqués par rapport à l’ION et au TG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Augmentation de la fluorescence de GCaMP6s évoquée par le stimulus. (A) Champ visuel total sous un grossissement de 20x. Les divisions ophtalmiques (V1) et maxillaires (V2) du TG sont indiquées. (B,C) La région de la boîte est représentée dans les panneaux B et C, qui sont des images de fluorescence avant et après la stimulation par brosse du coussinet vibrissal, respectivement. Les cercles blancs sont des régions de comparaison d’intérêt. Les neurones ont été considérés comme sensibles à un stimulus en fonction du pic de variation de la fluorescence observé dans les régions d’intérêt de comparaison, tel que décrit dans le texte. La barre d’échelle dans le premier panneau est la même pour les deux panneaux. (D) Changements représentatifs de la fluorescence des neurones mis en évidence dans B et C en réponse à un stimulus de brosse appliqué sur le visage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Classification des neurones en fonction de leur réponse aux stimuli appliqués sur le visage. Images représentatives des neurones TG avant (panneaux du haut - Ligne de base) et après (panneau du milieu - Stimulation) des réponses à un pinceau en poil de chameau de 1 cm (A - Pinceau), à une grille de 1 cm2 de monofilaments (B - Ponctate), à un chauffage (C - Chaleur) et à un refroidissement (D - Froid) appliqués à la même région du visage. La barre d’échelle dans le premier panneau est la même pour tous les panneaux suivants. Les cercles orange indiquent un exemple de neurone réactif. Les cercles blancs sont des régions de comparaison d’intérêt. (E-H) Traces représentatives de chaque réponse par stimulus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : La lésion nerveuse augmente les réponses évoquées par le pinceau dans les neurones TG. Réponses typiques des neurones TG au brossage appliqué deux fois sur le visage du rat du côté controlatéral à une lésion de constriction chronique du nerf infra-orbitaire (A, Contra) ou du côté ipsilatéral à la lésion nerveuse (B, Ipsi). (C) L’analyse des données regroupées des neurones réactifs de six rats (les données tracées sont par rat) a confirmé que la différence dans l’amplitude de la première réponse au brossage était significative (test t apparié). (D) Lorsque le pic de réponse à la première et au deuxième application de stimulus a été analysé sous forme de rapport (R2/R1), l’analyse des données regroupées a confirmé que l’augmentation du rapport de réponse du côté lésiné était significative. ** p < 0,01 Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Bloc de l’activité évoquée dans les neurones TG avec tétrodotoxine (TTX). (A) Données de fluorescence des neurones TG ipsilatéraux à une lésion nerveuse après injection de TTX (200 μL, 1 μM) adjacent au nerf infra-orbitaire après application d’un stimulus en brosse (barre bleue). (B) Données de réponse de pointe regroupées de trois rats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ici, nous démontrons un moyen rapide et non invasif de générer un rat GECI pour l’imagerie du TG. Nous avons choisi un promoteur CAG pour piloter et maintenir des niveaux élevés d’expression génique. Alors que des études antérieures suggèrent que d’autres sérotypes d’AAV peuvent influencer efficacement l’expression des gènes dans les neurones DRG39, nos résultats sont cohérents avec une étude récente impliquant l’injection intrapéritonéale d’AAV chez les nouveau-nés32, indiquant que le sérotype AAV9 est très efficace dans l’infection des neurones sensoriels néonatals de rat.

Grâce au dépannage de cette technique, il convient de noter certains pièges qui peuvent empêcher une infection optimale. La principale variable à garder à l’esprit est l’âge des chiots. Le système nerveux du rat se développe rapidement au cours des 7 premiers jours postnatals40. Nous avons tenté d’infecter à des moments ultérieurs (p. ex., p4-7), ce qui a entraîné une efficacité variable et médiocre. Les points temporels plus précoces (p1-4) produisent une efficacité plus robuste et constante, p1-2 produisant les taux d’infection les plus élevés. La deuxième variable est le volume d’injection. Quel que soit l’âge, un minimum de 15 μL était nécessaire pour produire une efficacité supérieure à 70 % dans le TG ou le DRG avec un titre de 2,5 x 1014. Nous avons constaté que, même à p2, les injections intrapéritonéales de moins de 10 μL produisent très peu d’expression chez l’adulte. Il est possible que des injections plus localisées, c’est-à-dire directement dans le champ récepteur d’intérêt, à des volumes plus faibles, produisent des effets similaires. Cependant, cette approche nécessiterait que les chiots soient complètement anesthésiés et pourrait causer un traumatisme aux tissus d’intérêt. Enfin, il est possible que des volumes plus petits puissent être utilisés avec des titres plus élevés.

L’exposition du TG pour l’imagerie GECI a déjà été réalisée chez la souris16. Cependant, la traduction de cette approche au rat a révélé plusieurs problèmes qui méritent d’être pris en compte. Tout d’abord, l’épaisseur du crâne et de la dure-mère chez le rat est beaucoup plus grande que chez la souris. Par conséquent, le retrait de la calotte crânienne peut poser des défis. Nous avons constaté qu’une petite perceuse est un moyen efficace de perforer la calotte, qui peut ensuite être retirée avec des rongeurs. Un deuxième problème est le saignement une fois que le cerveau a été enlevé. Cela peut être un problème continu à la fois pour la longévité de la préparation ainsi que pour la clarté de l’imagerie, sinon pour les propriétés des neurones. La gaze trempée dans du LCR glacé peut être appliquée sur la surface exposée du cerveau pour aider à fermer les artères principales. L’utilisation d’un petit stylo de cautérisation peut également être efficace pour endiguer d’autres saignements. Enfin, la mousse de gel située sur le côté controlatéral de la fenêtre d’imagerie peut également aider à empêcher le sang et le LCR de causer des problèmes d’imagerie. Un troisième élément à prendre en compte est la quantité de cerveau à prélever. Nous avons constaté que l’ablation de la caudale cérébrale à ~Bregma -3,80 entraînera la mort dans l’heure suivant l’ablation. Ainsi, le cerveau doit être retiré par petites sections, en gardant autant que possible tout en exposant autant de TG que possible.

Comme indiqué dans l’introduction, [Ca2+]i est une mesure indirecte de l’activité neuronale et, par conséquent, une augmentation de [Ca2+]i ne signifie pas nécessairement qu’il y a une augmentation de l’activité neuronale. Ainsi, les expériences de contrôle sont essentielles pour confirmer que ce qui est considéré comme une activité évoquée est en fait une activité en soi. Par exemple, les stimuli évoqués électriquement devraient produire une augmentation verrouillée dans le temps de [Ca2+]i, qui est sur une échelle similaire à celle des stimuli naturellement évoqués. Il est important de noter que cette activité doit être éliminée avec le bloc du nerf (c’est-à-dire TTX). Cependant, il est également important de noter qu’en dépit de ces contrôles importants, il est toujours possible que certaines des augmentations apparemment évoquées de [Ca2+]i soient dues à une signalisation à l’intérieur des ganglions, par exemple, en raison de la libération de l’émetteur dans les ganglions41, plutôt qu’en raison d’un potentiel d’action initié à la périphérie qui a envahi le soma cellulaire.

Bien que nos résultats confirment que les chercheurs précédents 16,42,43 indiquant que le rapport signal/bruit associé aux changements de fluorescence GCaMP dans les somata sensoriels est suffisant pour être utilisé avec un microscope à épifluorescence standard, des manipulations telles que la lésion nerveuse utilisée dans la présente étude peuvent être associées à des changements aussi spectaculaires dans l’activité neuronale et la signalisation Ca2+ 34, que les réponses dans l’ensemble des ganglions peuvent être associées à une augmentation si importante du bruit de fond apparent que les réponses des neurones individuels peuvent être artificiellement atténuées. Bien que des approches de traitement de l’imagerie aient été développées pour aider à remédier à cette limitation44, l’imagerie confocale ou multiphotonique peut être nécessaire pour résoudre ce problème le plus efficacement possible.

Dans l’ensemble, cette technique fournit une approche pour étudier les propriétés stimulus-réponse des neurones TG chez le rat au niveau de la population. Nos résultats avec l’ICC de l’ION confirment la faisabilité de la détection de changements dans ces propriétés stimulus-réponse. Bien que seuls des stimuli mécaniques et thermiques aient été utilisés dans la présente étude, cette préparation devrait se prêter à l’application de stimuli chimiques pour définir pleinement les propriétés stimulus-réponse des neurones TG. De même, alors que nous nous sommes concentrés sur les propriétés stimulus-réponse des afférences cutanées, en raison de l’émergence de phénomènes tels que l’allodynie mécanique dynamique à la suite d’une lésion traumatique d’un nerf cutané, il devrait également être possible de détecter des changements dans les propriétés des afférences innervant d’autres structures craniofaciales telles que l’articulation temporo-mandibulaire (en réponse à des mouvements inoffensifs ou nocifs de la mâchoire), cornée ou langue. L’injection périphérique du sérotype AAV9 permet d’induire le GCaMP spécifique au neurone qui est spécifique au SNP. L’un des principaux avantages de cette stratégie est que le marquage viral fournit une expression robuste et persistante dans les cellules post-mitotiques (c’est-à-dire les neurones), mais pas dans les cellules mitotiques (par exemple, les cellules épithéliales). De plus, le dépistage préliminaire de différents tissus du SNP indique que cette stratégie virale peut également être utilisée pour étudier les ganglions para/sympathiques, le DRG et le système nerveux entérique (données non présentées).

Cette préparation in vivo fournit également la base pour explorer de nombreuses comparaisons qui font défaut dans la littérature actuelle. Des études de population in vivo entre le TG du rat et le DRG, le TG du rat et de la souris, n’ont pas encore été menées. Les données présentées ici illustrent la nouvelle faisabilité de ces importantes expériences à mener.

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Disclosures

Le Dr Gold a reçu une subvention de Grunenthal pendant le développement de cette préparation. Il n’y avait pas de chevauchement entre l’objectif de l’étude de Grunenthal et la préparation décrite dans ce manuscrit. Ni l’un ni l’autre des autres auteurs n’a d’autres conflits d’intérêts potentiels à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier les Drs Kathy Albers et Brian Davis pour l’utilisation de leur programme Leica Microscope and Metamorph, Charles Warwick pour l’aide qu’il a apportée à la construction de notre appareil thermique Peltier, et le Dr Raymond Sekula pour son aide au dépannage de la préparation chirurgicale. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health : F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) et R01NS122784 (MSG et RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

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Neurosciences Numéro 204
<em>In-Vivo</em> Imagerie calcique des neurones sensoriels dans le ganglion trijumeau du rat
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Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

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