Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الحسية في العقدة الثلاثية التوائم للفئران

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

تتيح مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECI) إجراء تحليل قوي على مستوى السكان لإشارات الخلايا العصبية الحسية. هنا ، قمنا بتطوير نهج جديد يسمح بتصور GECI في الجسم الحي لنشاط الخلايا العصبية للعقد مثلثة التوائم في الفئران.

Abstract

تمكن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) تقنيات التصوير من مراقبة التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا في مجموعات الخلايا المستهدفة. نسبة الإشارة إلى الضوضاء الكبيرة تجعل GECIs أداة قوية للكشف عن النشاط المستحث في الخلايا العصبية الحسية. تسهل GECIs التحليل على مستوى السكان لتشفير التحفيز مع عدد الخلايا العصبية التي يمكن دراستها في وقت واحد. يتم ترميز السكان هذا بشكل مناسب في الجسم الحي. تستخدم العقد الجذرية الظهرية (DRG) ، التي تضم سوما الخلايا العصبية الحسية التي تعصب الهياكل الجسدية والحشوية أسفل الرقبة ، على نطاق واسع للتصوير في الجسم الحي لأن هذه الهياكل يمكن الوصول إليها بسهولة نسبية. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه التقنية في الفئران لدراسة الخلايا العصبية الحسية في العقدة الثلاثية التوائم (TG) التي تعصب الهياكل الفموية والقحفية الوجهية. هناك العديد من الأسباب لدراسة TG بالإضافة إلى DRG ، بما في ذلك القائمة الطويلة من متلازمات الألم الخاصة بالهياكل الفموية والقحفية الوجهية التي يبدو أنها تعكس التغيرات في نشاط الخلايا العصبية الحسية ، مثل ألم العصب الثلاثي التوائم. تستخدم الفئران على نطاق واسع في دراسة الخلايا العصبية DRG و TG بسبب توفر الأدوات الوراثية. ومع ذلك ، مع وجود اختلافات في الحجم ، وسهولة التعامل ، والاختلافات المحتملة في الأنواع المهمة ، هناك أسباب لدراسة الخلايا العصبية TG للفئران بدلا من الفأر. وهكذا ، قمنا بتطوير نهج لتصوير الخلايا العصبية TG الفئران في الجسم الحي. قمنا بحقن الجراء حديثي الولادة (p2) داخل الصفاق بترميز AAV GCaMP6s ، مما أدى إلى إصابة >90٪ من كل من الخلايا العصبية TG و DRG. تم تصوير TG في البالغين بعد حج القحف والتقشير ، وتم رصد التغيرات في مضان GCaMP6s في الخلايا العصبية TG بعد تحفيز مناطق الفك السفلي والفك العلوي من الوجه. أكدنا أن الزيادات في التألق كانت محفزة مع إحصار الأعصاب المحيطية. في حين أن هذا النهج له العديد من الاستخدامات المحتملة ، فإننا نستخدمه لتوصيف السكان (السكان) الفرعية للخلايا العصبية TG التي تغيرت بعد إصابة الأعصاب الطرفية.

Introduction

يبدأ الإحساس الجسدي ، وهو الترميز العصبي للمحفزات الميكانيكية والحرارية والكيميائية التي تصطدم بالجلد أو الهياكل الجسدية الأخرى ، بما في ذلك العضلات والعظام والأحشاء ، بالنشاط في الخلايا العصبية الواردة الأولية التي تعصب هذه الهياكل1. قدمت الأساليب الفيزيولوجية الكهربية القائمة على وحدة واحدة ثروة من المعلومات حول الأنواع الفرعية الواردة المشاركة في هذه العملية وكذلك كيف يمكن أن تتغير خصائص استجابات التحفيز بمرور الوقت1،2،3. ومع ذلك ، في حين لا تزال هناك أدلة قوية تدعم نظرية الخط المسمى ، والتي تشير إلى أن طرائق حسية محددة يتم نقلها بواسطة مجموعة (مجموعات) فرعية محددة من الخلايا العصبية ، فإن قدرة العديد من المجموعات السكانية الفرعية للخلايا العصبية على الاستجابة لنفس الأنواع من المحفزات الميكانيكية والحرارية والكيميائية تشير إلى أن غالبية المحفزات الحسية الجسدية يتم ترميزها بواسطة مجموعات فرعية متعددة من الخلايا العصبية4 ، 5. وبالتالي ، فإن الفهم الأفضل للإحساس الجسدي لن يأتي إلا مع القدرة على دراسة نشاط 10 ، إن لم يكن المئات ، من الخلايا العصبية في وقت واحد.

سهلت التطورات في الأساليب البصرية مع ظهور تقنيات التصوير البؤري والمتعدد الفوتونات والرقمي ، وبالتالي تقنيات التصوير الرقمي ، القدرة على إجراء تحليلات غير جراحية نسبيا على مستوى السكان للنشاط العصبي 6,7. كانت إحدى العقبات الأخيرة في تطبيق هذه التكنولوجيا هي تطوير أدوات لتمكين التقييم البصري للنشاط العصبي. بالنظر إلى سرعة جهد الفعل الذي يمكن أن يبدأ وينتهي في أقل من ميلي ثانية ، فإن الصبغة الحساسة للجهد مع القدرة على متابعة التغيرات في جهد الغشاء بسرعة جهد الفعل ستكون الأداة المثالية لهذا الغرض. ولكن في حين كان هناك تقدم هائل في هذا المجال7،8،9،10 ، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء للعديد من هذه الأصباغ لا تزال غير عالية بما يكفي لتمكين تحليل السكان لمئات الخلايا العصبية على مستوى الخلية الواحدة. كنهج بديل ، تحول الباحثون إلى مراقبة التغيرات في تركيز Ca2+ داخل الخلايا ([Ca2+] i). كانت القيود المفروضة على هذه الاستراتيجية واضحة منذ البداية وتشمل حقيقة أن الزيادة في [Ca2+] i هي مقياس غير مباشر للنشاط العصبي11 ؛ أن زيادة في [Ca2+]i قد تحدث بشكل مستقل عن تدفق Ca2+ المرتبط بتنشيط قنوات Ca2+ ذات الجهد الكهربائي (VGCCs)12,13؛ أن حجم ومدة عابر Ca2+ يمكن التحكم فيهما من خلال عمليات مستقلة عن نشاط VGCC11،12،14؛ وأن المسار الزمني لعابري Ca2+ يتجاوز بكثير مسار جهدالفعل 15. ومع ذلك ، هناك عدد من المزايا المهمة المرتبطة باستخدام Ca2+ كمقياس غير مباشر للنشاط العصبي. ليس أقلها نسبة الإشارة إلى الضوضاء المرتبطة بمعظم مؤشرات Ca2+ ، مما يعكس حجم التغيير في Ca2+ داخل الخلايا وحقيقة أن الإشارة تنشأ من الفضاء ثلاثي الأبعاد للسيتوسول بدلا من الفضاء ثنائي الأبعاد لغشاء الخلية. علاوة على ذلك ، مع تطوير مؤشرات Ca2+ المشفرة وراثيا (GECI's) ، من الممكن الاستفادة من الاستراتيجيات الجينية لدفع التعبير عن مؤشرات Ca2+ في مجموعات فرعية محددة من الخلايا ، وتسهيل التحليلات على مستوى السكان في الاستعدادات السليمة (على سبيل المثال ، انظر16).

بالنظر إلى عدد الأدوات الوراثية المتاحة الآن في الفئران ، فلا ينبغي أن يكون مفاجئا أن GECI قد تم استخدامه على نطاق واسع في هذا النوع. تم تطوير خطوط الماوس مع تعبير GECI التأسيسي في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية الحسية7،16،17. مع تطور خطوط الماوس التي تعبر عن عمليات إعادة التركيب في أنواع معينة من الخلايا ، من الممكن استخدام استراتيجيات أكثر تعقيدا للتحكم في تعبير GECI15. ومع ذلك ، في حين أن هذه الأدوات أقوى من أي وقت مضى ، إلا أن هناك عددا من الأسباب التي تجعل الأنواع الأخرى ، مثل الفئران ، أكثر ملاءمة لبعض الأسئلة التجريبية. وتشمل هذه الحجم الأكبر ، مما يسهل عددا من عمليات التلاعب التجريبية التي يصعب ، إن لم يكن مستحيلا ، في الماوس الأصغر ؛ سهولة تدريب الفئران في المهام السلوكية المعقدة نسبيا ؛ وعلى الأقل بعض الأدلة على أن الخصائص الفيزيائية الحيوية وأنماط التعبير للعديد من القنوات الأيونية في الخلايا العصبية الحسية للفئران قد تكون أكثر تشابها مع تلك التي لوحظت في الخلايا العصبية الحسية البشرية من نفس القنوات في الفئران بالنسبة إلىالإنسان 18.

في حين أن نقل المنبهات الحسية الجسدية يحدث بشكل عام في المحطات الطرفية للوارد الأولي ، يجب أن يمر جهد الفعل الذي يبدأ في المحيط عبر الهيكل الذي يضم سوماتا واردة أولية ، يشار إليها باسم الجذر الظهري (DRG) أو العقد ثلاثية التوائم (TG) قبل الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي19. في حين أن هناك أدلة على أنه ليس كل جهد فعل ينتشر على طول محور وارد أولي سيغزو جسم الخلية20 ، نتيجة لحقيقة أن سوماتا الواردة الأولية متصلة بالمحور العصبي الوارد الرئيسي عبر تقاطع T19 ، يبدو أن غالبية جهود الفعل التي بدأت في المحيط تغزو سوما21. وهذا يمنح ثلاث مزايا تجريبية عند استخدام GECIs لتقييم الترميز السكاني في الواردات الأولية: الحجم الكبير لجسم الخلية بالنسبة إلى المحاور يزيد من الإشارة إلى الضوضاء عند استخدام [Ca2+] i كمقياس غير مباشر للنشاط الوارد. من السهل الوصول إلى DRG بشكل عام ؛ وتقييم النشاط في موقع بعيد مكانيا عن المحطات الواردة يقلل من التأثير المحتمل للجراحة اللازمة لكشف العقد على خصائص استجابة التحفيز للمحطات الواردة. ومع ذلك ، نظرا لأن TG تقع أسفل الدماغ (أو فوق اللوحة) ، فإن الوصول إليها أصعب بكثير من DRG. علاوة على ذلك ، في حين أن هناك العديد من أوجه التشابه بين الخلايا العصبية DRG و TG ، إلا أن هناك قائمة متزايدة من الاختلافات أيضا. وهذا يشمل التنظيم الجسدي تقريبا للخلايا العصبية في TG22 ، والهياكل الفريدة المعصبة ، وأنماط الإنهاء الطرفية المركزية المختلفة23،24،25،26 ، والآن قائمة متزايدة من الاختلافات في كل من التعبير الجيني27،28 وتعبير المستقبلات الوظيفية29. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأننا مهتمون بتحديد الآليات المحيطية للألم ، فإن العدد الكبير نسبيا من متلازمات الألم التي تبدو فريدة من نوعها في النظام الثلاثي التوائم (على سبيل المثال ، الصداع النصفي ، ألم العصب الثلاثي التوائم ، متلازمة الفم الحارق) التي يبدو أنها تنطوي على نشاط شاذ في الحالات الأولية30،31،32 ، يشير إلى أن TG يحتاج إلى دراسة مباشرة.

وهكذا ، في حين تمت دراسة خصائص استجابة التحفيز للخلايا العصبية TG مع GECIs في الفأر16 ، لأن الأسباب المذكورة أعلاه تشير إلى أن الفئران قد تكون نوعا أكثر ملاءمة لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة التجريبية ، كان الغرض من الدراسة الحالية هو تطوير نهج لاستخدام GECIs لدراسة الخلايا العصبية TG في الفئران. لتحقيق ذلك ، استخدمنا نهجا فيروسيا لدفع التعبير عن GECI GCaMP6s في الجهاز العصبي المحيطي. ثم أزلنا الدماغ الأمامي للسماح بالوصول إلى TG. أخيرا ، تم تطبيق المحفزات الميكانيكية والحرارية على الوجه بينما تم تقييم الاستجابات العصبية تحت المجهر الفلوري. تدعم هذه البيانات معا دورا لاستخدام الفئران للتحقيق في التغييرات في TG في العديد من الولايات ، وتوسيع مجموعة الأدوات للمحققين المهتمين بالترميز الحسي في نظام مثلث التوائم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب التي تنطوي على استخدام في البحث وفقا للمعايير التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة والرابطة الدولية لدراسة الألم وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة بيتسبرغ (البروتوكول #22051100). في نهاية كل تجربة ، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق التضخيم مع التروية القلبية للمحلول الملحي المخزن بالفوسفات المثلج (PBS) ، وهو نهج وافقت عليه الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية وجامعة بيتسبرغ IACUC.

1. تحريض GCaMP

  1. اطلب فئران Sprague Dawley الحامل بالوقت حتى يمكن حقن الجراء في الوقت المناسب بعد الولادة.
  2. رش القفازات بنسبة 70٪ EtOH قبل التعامل مع كل جرو فئران. هذا سوف يردع السد عن أكل لحوم الشباب.
  3. مسحة الجراء الفئران (P1-2) مع 70 ٪ EtOH وتخدير على الجليد لمدة 3 دقائق.
  4. حقن 15 ميكرولتر من AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) داخل الصفاق باستخدام حقنة هاملتون معقمة 25 ميكرولتر ومحكمة الغلق.

2. جراحة التعرض للعقدة الثلاثية التوائم

  1. يتم تطبيق كوكتيل مخدر (55 ملغ/كغ من الكيتامين، 5.5 ملغ/كغ من الزيلازين، 1 ملغ/كغ من الأسيبرومازين) داخل الصفاق على أساس وزن الجسم لدى الفئران البالغة من العمر 6-8 أسابيع (حوالي 150-200 غ).
    ملاحظة: هذا يكفي بشكل عام للحفاظ على مستوى التخدير الجراحي كما تم تقييمه من خلال عدم وجود منعكس انسحابي لقرصة ضارة من مخلب خلفي. ومع ذلك ، تكملة مع isoflurane عن طريق مخروط الأنف إذا أصبحت خفيفة.
  2. بمجرد التخدير الكامل ، احلق شعر وشعيرات الرأس والوجه.
  3. قم بتركيب الجرذ على إطار مجسم مع قضبان الأذن وضع وسادة تدفئة (~ 37 درجة مئوية) تحتها للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
  4. راقب العلامات الحيوية (معدل ضربات القلب ، معدل التنفس ، تشبع الأكسجين في الدم) باستخدام مقياس تأكسج الماوس أو ما يعادله.
    ملاحظة: تتم مراقبة درجة حرارة الجسم بواسطة مسبار المستقيم ويتم الحفاظ عليها عن طريق وضع الفئران على بطانية مياه متداولة يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة.
  5. ضع شاشا مغموسا في محلول ملحي بارد على الرأس لتضييق الأوعية الدموية لتقليل النزيف. باستخدام مشرط بحجم 15 ، قم بعمل شق في خط الوسط للجلد والعضلات فوق الجمجمة.
  6. استخدم تشريحا حادا للجلد والعضلات لفضح الجمجمة.
  7. باستخدام مثقاب دائري 1/4 ، قم بثقب غطاء الجمجمة بعناية لكشف الدماغ الأمامي. بعد ذلك ، استخدم rongeurs (كوب 2.5 مم) لقطع الجمجمة بعناية.
  8. باستخدام مشرط بحجم 15 ، قم بعمل شق في الدماغ (Bregma: -3.80) والبصلة الشمية.
    ملاحظة: سيؤدي قطع هذه النقطة بشكل أكثر ذيلية إلى موت الفئران
  9. استخدم ملعقة لفصل الجافية بعناية عن الجمجمة ورفع الدماغ المقطوع برفق للكشف عن TG وقاعدة الجمجمة.
    ملاحظة: الاستخدام الإضافي للتروية الملحية الباردة في جميع أنحاء الاستخراج سيقلل من النزيف ويحسن مجال التشريح التالي.
  10. باستخدام قلم الكي ، أوقف أي نزيف ناتج عن الاستخراج.
    ملاحظة: سيؤدي قطع الجافية إلى نزيف لا مفر منه. من الأفضل تحضير aCSF المثلج (119 mM NaCl ، 26.2 mM NaHCO3 ، 2.5 mM KCl ، 1 mM NaH2PO4 ، 1.3 mM MgCl2 ، 10 mM Glucose ، 2.5 mM CaCl2) لاستحمام تجويف الجمجمة للمساعدة في تضييق الأوعية الدموية مع الحفاظ على صحة الخلايا العصبية.

3. تصوير GCaMP6s

ملاحظة: نظرا لحجم وكثافة هذه الخلايا العصبية ، فإن نظام التصوير والحصول على البيانات المستخدم (الهدف ، المجهر ، مصدر الضوء ، الكاميرا) سيحدد عدد خلايا GECI + المرئية. سيحدد مصدر الضوء والهدف والكاميرا أيضا المعلمات المستخدمة للحصول على الصور ، بما في ذلك وقت التعرض ومعدل التقاط الصورة. بينما يمكن استخدام التقنيات متعددة الفوتونات والبؤر اعتمادا على معلمات التجربة ، قد يكون الفحص المجهري الفلوري كافيا لحل العديد من الخلايا. يمكن استخدام أي حزمة الحصول على الصور. من الناحية المثالية ، يكون تطبيق التحفيز مقفلا زمنيا مع حزمة برامج الحصول على الصور.

  1. ضع تجويف الجمجمة أسفل الهدف واجعل TG في التركيز باستخدام الضوء المرئي.
  2. الطول الموجي للإثارة ل GCaMP6s هو 496 نانومتر ، وطول موجة الانبعاث 513 نانومتر ؛ وبالتالي ، استخدم مكعبات ثنائية اللون ومرشحة مناسبة لتحديد موقع خلايا GCaMP+ . اضبط التركيز لتحديد منطقة العقد وحلها حيث تستجيب الخلايا العصبية للمنبهات المطبقة على مجال الاهتمام الاستقبالي.
  3. استخدم هدف 10x لتمكين تصورات معظم الخلايا العصبية في TG تستجيب للمنبهات الميكانيكية المطبقة على منطقة 1 سم2 من الوجه16. استخدم هدفا جافا بمعدل 20 ضعفا مع مسافة عمل طويلة (10.8 مم) لزيادة الدقة.
  4. استخدم برنامج الاستحواذ (على سبيل المثال ، Metamorph) لجمع بيانات التألق بمرور الوقت واستجابة لتطبيق التحفيز.
    1. لتقليل التبييض الضوئي للخلايا العصبية ، استخدم وقت التعرض القصير قدر الإمكان للكشف عن خط الأساس والزيادات المستثارة في التألق. وباستخدام الهدف الجوي 20x، 0.40 NA، ومصدر ضوء هاليد الزئبق بقدرة 120 واط، وكاميرا تكميلية لأشباه الموصلات بأكسيد المعادن (CMOS) المستخدمة في هذه الدراسة، ووقت تعرض يبلغ 300 مللي ثانية، ومعدل التقاط صور يبلغ 3 هرتز، احصل على تسجيلات أساسية مستقرة لمدة >90 دقيقة.
      ملاحظة: 1) يجب تحديد معلمات الحصول على الصور هذه تجريبيا. 2) يمكن تطبيق الميكانيكية (فرشاة ، مثقوبة ، اهتزاز ، قرصة) ، حرارية (حرارة وبرودة) ، وكيميائية (كبخاخات ، منثول ، وسطاء التهابات) على المجال المستقبل. النهج الذاتي غير المكلف نسبيا هو تطبيق المحفزات باليد. ومع ذلك ، يوصى بنهج أكثر موضوعية وقابلة للتكرار ، حيث يمكن استخدام المشغلات التي يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة للتطبيق المتكرر بقوة معروفة. في حين أن أجهزة بلتيير التي يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة مفيدة للتحكم في التدفئة والتبريد ، إلا أنها ليست مثالية للتحفيز الحراري للوجه المنحني. تعد مصادر ضوء الأشعة تحت الحمراء التي يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة بديلا للتدفئة ، والرذاذ البارد هو بديل أقل من مثالي للتبريد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نظرا لأننا حققنا نجاحا سابقا مع النمط المصلي AAV9 لعدوى الخلايا العصبية الحسية للفئران15 ، فقد استخدمنا هذا النمط المصلي للتعبير عن GCaMP6s في الخلايا العصبية TG للفئران. لذلك سعينا أولا إلى تقييم كفاءة عدوى الخلايا العصبية الحسية ل AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) عندما تم إعطاء هذا الفيروس لجراء الفئران حديثي الولادة20. يستخدم هذا الفيروس مروج CAG ، الذي يدفع ويحافظ على مستويات عالية من التعبير الجيني. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن AAV9 يصيب الخلايا العصبية الحسية بكفاءة عند إعطائه للفئران حديثي الولادة33. استخدمت الحقن الأولى 5 ميكرولتر في اليوم الخامس بعد الولادة (p5) ، مما أدى إلى حوالي 51.66٪ ± كفاءة 14.33٪ (الشكل 1 أ). لزيادة معدل الإصابة ، استخدمنا في النهاية حجما أكبر من الفيروس (15 ميكرولتر) في الفئران الأصغر سنا (p2) ، مع الحفاظ على عيار الفيروس 2.4 × 1014 كما هو. أسفرت هذه الاستراتيجية عن إصابة 91.84٪ ± 3.18٪ (ن = 8) من الخلايا العصبية (الشكل 1 ب).

لتصور الخلايا العصبية TG التي تعصب الوسادة الاهتزازية ، قمنا بعد ذلك بتطوير استراتيجية جراحية لفضح TG في الجسم الحي. يمكن إزالة ما يقرب من 60٪ من الدماغ الأمامي دون التأثير على مراكز الجهاز التنفسي الرئيسية. هذا يتوافق مع منضدة أنسجة المخ إلى Bregma -3.80. يظهر في الشكل 2 رسم تخطيطي ل TG المكشوف (يسار) ومنطقة التعصيب للعصب تحت الحجاج (أيون ، يمين). تم تحديد منطقة TG التي أدت إلى تعصيب الوسادة الاهتزازية من خلال تطبيق التحفيز الميكانيكي الضوئي (الفرشاة) على الوسادة الاهتزازية أثناء مراقبة التغيرات في التألق عند 20x. كما هو متوقع ، كانت منطقة V2 من TG ، التي تعصب الانقسام الفكي للوجه ، هي المنطقة الوحيدة التي تم تنشيطها. أي أنه على الرغم من عدم دراستها بشكل منهجي ، لم تكن هناك تغييرات في التألق المكتشف استجابة للمنبهات المطبقة على مناطق V1 (الجلد على الجبهة) أو V3 (الجلد على الفك السفلي) عندما يمكن تنشيط الخلايا العصبية قيد الدراسة مع تطبيق المنبهات على وسادة الاهتزاز. ثم تم رصد التغيرات في التألق عند خط الأساس واستجابة للمنبهات المطبقة على الوسادة الاهتزازية. تم تحديد منطقة الاهتمام (V2) في الشكل 3A. تمشيا مع التقارير السابقة عن مستويات منخفضة نسبيا من نشاط الراحة في الخلايا العصبية الحسية34 ، كان مضان الراحة منخفضا نسبيا في معظم الخلايا العصبية ، وكان هناك القليل من الأدلة على الزيادات التلقائية في التألق (الشكل 3 ب). المعايير المستخدمة لتحديد النشاط المستحث بالتحفيز في الخلايا العصبية في المحيط6،16،21 و CNS12،35،36 هي مجال متطور مع العديد من حزم سير العمل المتطورة التي تم توفيرها مجانا37،38. إن المناقشة الكاملة لنقاط القوة والضعف في مختلف الأساليب المستخدمة تتجاوز نطاق هذه المخطوطة. نظرا لأن هذا لم يكن محور الدراسة الحالية ، فقد استخدمنا معايير تعسفية وذاتية نسبيا بناء على استجابة الذروة التي لوحظت في مناطق العقد التي لم تكن فيها خلايا عصبية يمكن اكتشافها بوضوح (بناء على القدرة على رؤية النواة) ، بحيث تم اعتبار الخلية العصبية مستجيبة للتحفيز إذا كانت الزيادة في التألق مقفلة زمنيا لتطبيق التحفيز (تم اكتشاف زيادة في التألق خلال 1 ثانية من تطبيق التحفيز ( استنادا إلى افتراض أن جهد الفعل الذي بدأ في أبطأ محاور عصبية موصلة (0.2 م / ث) بدأ في موقع لا يزيد عن 3 سم من جسم الخلية يجب أن يصل إلى جسم الخلية في أقل من ثانية) ، وكان >6 أضعاف الانحراف المعياري لاستجابة الذروة (ΔF / F) المكتشفة في موقع التحكم (الشكل 3C). بعد ذلك ، قمنا بتمييز خصائص استجابة هذه الخلايا العصبية للمحفزات الطبيعية: الفرشاة ، والثقب ، والحرارة ، والبرودة. يوضح الشكل 4 أمثلة على الاستجابات لكل من هذه المثيرات. والجدير بالذكر أن الاستجابة لتحفيز النقاط ، والتي تستخدم غالبا في الدراسات المتعلقة بالألم ، لديها أقوى استجابة (الشكل 4B ، F).

كان هدفنا في تطوير هذه التقنية هو أن نكون قادرين على تقييم التغيرات في ترميز السكان في الخلايا العصبية TG. وهكذا ، قمنا بتكييف إصابة الانقباض المزمن مع ION (CCI-ION) ، كما تم توظيفه سابقا29 ، لدراسة الفئران بعد أسبوعين من إصابة الأعصاب. بعد تحريض النموذج ، كشفنا عن TG وقيمنا الراحة واستثارنا النشاط في TG المماثل والمقابل لموقع الإصابة. ومن المثير للاهتمام ، أن حجم استجابة الذروة المثارة للفرشاة زاد ~ 2 أضعاف على الجانب المصاب بالعصب بالنسبة إلى استجابة الذروة لنفس التحفيز المطبق على الجانب المقابل (الشكل 5A-C). علاوة على ذلك ، عندما تم تطبيق اثنين من محفزات الفرشاة على التوالي (مع فاصل تحفيز داخلي يبلغ 10 ثوان) ، كان هناك تضخيم كبير لحجم الاستجابة للحافز الثاني على الجانب المصاب ولكن ليس غير المصاب (الشكل 5 د).

أخيرا ، كتجربة تحكم أولية لتأكيد أن الزيادة المستثارة بالتحفيز في التألق كانت بسبب جهود الفعل التي بدأت في المحيط ، قمنا بتقييم تأثير السموم الرباعية (1 ميكرومتر) على الاستجابات المستحثة. تم حقن TTX بحجم 200 ميكرولتر عن طريق الجلد كما هو موضح سابقا28 وذلك لاستهداف العصب تحت الحجاج. كما هو موضح في الشكل 6 ، تم القضاء على النشاط المستثار بالكامل تقريبا. مجتمعة ، توضح هذه النتائج فائدة استخدام AAV9-GCaMP لاستجواب استجابات TG السكانية في الجسم الحي.

Figure 1
الشكل 1: كفاءة عالية لعدوى GCaMP6s في الخلايا العصبية TG مع حقن AAV الوليدي. (أ) تم حقن جراء الفئران P5 ب 5 ميكرولتر من pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (عيار: 2.4 × 1014) فيروس داخل الصفاق: تم الكشف عن تعبير GCaMP6s في 51.7 ± 14.3٪ من الخلايا العصبية TG (ن = 3 شرائح لكل ، 7 فئران). (ب) أدت زيادة حجم الحقن إلى 15 ميكرولتر في الأصغر سنا (p2) إلى تحسين كفاءة العدوى: تم الكشف عن تعبير GCaMP6s في 91.8 ± 3.2٪ من الخلايا العصبية TG (n = 3 شرائح لكل ، 8 فئران). كانت الألواح الموجودة على اليسار ملطخة ب GCaMP6s. كانت الألواح الموجودة في المنتصف ملطخة ب NeuN ، وهي علامة خاصة بالخلايا العصبية. اللوحات الموجودة على اليمين هي صورة مدمجة للوحات GCaMP6s و NeuN. شريط المقياس في اللوحة الأولى هو نفسه لجميع اللوحات اللاحقة. الرسم البياني على اليمين هو مخطط لتعبير GCaMP6s (يعني ± SEM) كنسبة مئوية من إجمالي عدد الخلايا العصبية لكل شريحة لكل ، حيث النقاط الفردية هي البيانات لكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحفيز موقع العقدة الثلاثية التوائم (TG) والعصب تحت الحجاج (ION) ومنطقة الوجه (الوسادة الاهتزازية). (أ) تمت إزالة الدماغ الأمامي لتمكين الوصول إلى TG. (ب) منطقة الوجه التي تم فيها تطبيق المحفزات الطبيعية بالنسبة إلى ION و TG. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الزيادة المستثارة بالتحفيز في مضان GCaMP6s. (أ) المجال البصري الكلي تحت تكبير 20x. يشار إلى أقسام العيون (V1) والفك العلوي (V2) من TG. (ب، ج) تظهر المنطقة الموجودة في الصندوق في اللوحتين B و C ، وهما صورتان مضان قبل وبعد تحفيز الفرشاة لوسادة الاهتزاز ، على التوالي. الدوائر البيضاء هي مناطق ذات أهمية مقارنة. اعتبرت الخلايا العصبية مستجيبة للتحفيز بناء على ذروة التغير في التألق الذي لوحظ في مناطق المقارنة ذات الأهمية كما هو موضح في النص. شريط المقياس في اللوحة الأولى هو نفسه لكلا اللوحتين. د: التغيرات التمثيلية في مضان الخلايا العصبية الموضحة في B و C استجابة لمحفز الفرشاة المطبق على الوجه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصنيف الخلايا العصبية بناء على استجابتها للمثيرات المطبقة على الوجه. صور تمثيلية للخلايا العصبية TG قبل (الألواح العلوية - خط الأساس) وبعد (اللوحة الوسطى - التحفيز) للاستجابات لفرشاة شعر الإبل 1 سم (A - فرشاة) ، شبكة 1 سم2 من الشعيرات الأحادية (B - Punctate) ، التسخين (C - الحرارة) والتبريد (D - Cold) المطبقة على نفس المنطقة من الوجه. شريط المقياس في اللوحة الأولى هو نفسه لجميع اللوحات اللاحقة. تشير الدوائر البرتقالية إلى مثال على الخلايا العصبية المستجيبة. الدوائر البيضاء هي مناطق ذات أهمية مقارنة. (ه-ح) آثار تمثيلية لكل استجابة لكل حافز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تزيد إصابة العصب من الاستجابات المستحثة بالفرشاة في الخلايا العصبية TG . الاستجابات النموذجية للخلايا العصبية TG للفرشاة تطبق مرتين على وجه الجرذ على الجانب المقابل لإصابة انقباض مزمنة للعصب تحت الحجاج (A ، Contra) أو على الجانب المماثل لإصابة العصب (B ، Ipsi). (ج) أكد تحليل البيانات المجمعة من الخلايا العصبية المستجيبة من ستة فئران (البيانات المرسومة لكل فئران) أن الفرق في حجم الاستجابة الأولى للفرشاة كان كبيرا (اختبار t المزدوج). (د) عندما تم تحليل استجابة الذروة لتطبيق التحفيز الأول والثاني كنسبة (R2 / R1) ، أكد تحليل البيانات المجمعة أن الزيادة في نسبة الاستجابة على الجانب المصاب بالأعصاب كانت كبيرة. ** ع < 0.01 الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: كتلة النشاط المستثار في الخلايا العصبية TG مع السموم الرباعية (TTX). (أ) بيانات مضان من الخلايا العصبية TG المماثلة لإصابة العصب بعد حقن TTX (200 ميكرولتر ، 1 ميكرومتر) بجوار العصب تحت الحجاج بعد تطبيق محفز الفرشاة (الشريط الأزرق). (ب) بيانات استجابة الذروة المجمعة من ثلاثة فئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، نوضح طريقة سريعة وغير جراحية لتوليد فأر GECI لتصوير TG. اخترنا محفز CAG لدفع والحفاظ على مستويات عالية من التعبير الجيني. بينما تشير الدراسات السابقة إلى أن الأنماط المصلية الأخرى AAV قد تدفع بكفاءة التعبير الجيني في الخلايا العصبية DRG39 ، فإن نتائجنا تتفق مع دراسة حديثة تتضمن الحقن داخل الصفاق ل AAV في حديثي الولادة32 ، مما يشير إلى أن النمط المصلي AAV9 فعال للغاية في إصابة الخلايا العصبية الحسية الوليدية للفئران.

من خلال استكشاف هذه التقنية وإصلاحها ، تجدر الإشارة إلى بعض المزالق التي قد تمنع العدوى المثلى. المتغير الرئيسي الذي يجب مراعاته هو عمر الجراء. يتطور الجهاز العصبي للفئران بسرعة خلال أول 7 أيام بعدالولادة 40. حاولنا العدوى في نقاط زمنية لاحقة (على سبيل المثال ، p4-7) ، مما أدى إلى كفاءة متغيرة وضعيفة. تنتج النقاط الزمنية السابقة (p1-4) كفاءة أكثر قوة واتساقا ، حيث ينتج p1-2 أعلى معدلات الإصابة. المتغير الثاني هو حجم الحقن. بغض النظر عن العمر ، كان مطلوبا ما لا يقل عن 15 ميكرولتر لإنتاج كفاءة أكبر من 70٪ في TG أو DRG بعيار 2.5 × 1014. وجدنا أنه حتى في p2 ، فإن الحقن داخل الصفاق أقل من 10 ميكرولتر تنتج تعبيرا قليلا جدا لدى البالغين. من الممكن أن تؤدي الحقن الموضعية ، أي مباشرة في مجال الاهتمام المستقبلي ، بكميات أقل إلى تأثيرات مماثلة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يتطلب تخدير الجراء بالكامل وقد يسبب صدمة للأنسجة محل الاهتمام. أخيرا ، من الممكن استخدام أحجام أصغر مع عيارات أعلى.

تم إجراء تعريض TG لتصوير GECI سابقا في الفئران16. ومع ذلك ، كشفت ترجمة هذا النهج إلى الفئران عن العديد من القضايا التي تستحق الدراسة. أولا ، سمك الجمجمة والجافية في الفئران أكبر بكثير من الماوس. لذلك ، قد تشكل إزالة غطاء الجمجمة تحديات. وجدنا أن المثقاب الصغير هو وسيلة فعالة لتثقيب غطاء الجمجمة ، والذي يمكن إزالته بعد ذلك باستخدام rongeurs. المشكلة الثانية هي النزيف بمجرد إزالة الدماغ. قد تكون هذه مشكلة مستمرة لكل من طول عمر التحضير وكذلك وضوح التصوير ، إن لم يكن خصائص الخلايا العصبية. يمكن وضع الشاش المغموس في السائل الدماغي الشوكي البارد على السطح المكشوف للدماغ للمساعدة في إغلاق الشرايين الرئيسية. قد يكون استخدام قلم كي صغير فعالا أيضا في وقف المزيد من النزيف. أخيرا ، قد يساعد Gelfoam الموجود على الجانب المقابل من نافذة التصوير أيضا في منع الدم والسائل الدماغي الشوكي من التسبب في مشاكل التصوير. الاعتبار الثالث هو كمية الدماغ المراد إزالتها. وجدنا أن إزالة الدماغ الذيلية إلى ~ Bregma -3.80 سيؤدي إلى الوفاة في غضون ساعة من الإزالة. وبالتالي ، يجب إزالة الدماغ في أقسام صغيرة ، مع الاحتفاظ بأكبر قدر ممكن أثناء تعريض أكبر قدر ممكن من TG.

كما هو مذكور في المقدمة ، [Ca2+] i هو مقياس غير مباشر للنشاط العصبي ، وبالتالي ، فإن الزيادة في [Ca2+] i لا تعني بالضرورة أن هناك زيادة في النشاط العصبي. وبالتالي ، فإن تجارب التحكم ضرورية لتأكيد أن ما يعتبر نشاطا مستثارا هو في الواقع نشاط في حد ذاته. على سبيل المثال ، يجب أن تنتج المحفزات المستحثة كهربائيا زيادة مقفلة زمنيا في [Ca2+] i ، والتي تكون على نطاق مماثل لتلك الخاصة بالمحفزات المستحثة بشكل طبيعي. الأهم من ذلك ، يجب القضاء على هذا النشاط مع كتلة العصب (أي TTX). ومع ذلك ، من المهم أيضا ملاحظة أنه على الرغم من هذه الضوابط المهمة ، لا يزال من الممكن أن تكون بعض الزيادات التي تم استثارتها على ما يبدو في [Ca2+] i ناتجة عن الإشارة داخل العقد ، على سبيل المثال ، بسبب إطلاق جهاز الإرسال داخل العقد41 ، وليس بسبب جهد الفعل الذي بدأ في المحيط الذي غزا سوما الخلية.

بينما تؤكد نتائجنا أن الباحثين السابقين16،42،43 مما يشير إلى أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء المرتبطة بالتغيرات في مضان GCaMP في السوماتا الحسية كافية للاستخدام مع مجهر التألق القياسي ، قد تترافق التلاعب مثل إصابة الأعصاب المستخدمة في الدراسة الحالية مع مثل هذه التغييرات الدراماتيكية في النشاط العصبي وإشارات Ca2+ 34، أن الاستجابات في جميع أنحاء العقد قد تكون مرتبطة بمثل هذه الزيادة الكبيرة في الخلفية الظاهرة ، بحيث يمكن تخفيف استجابات الخلايا العصبية الفردية بشكل مصطنع. بينما تم تطوير مناهج معالجة التصوير التي قد تساعد في معالجة هذا القيد44 ، قد تكون هناك حاجة إلى التصوير البؤري أو متعدد الفوتونات لحل هذه المشكلة بشكل أكثر فعالية.

مجتمعة ، توفر هذه التقنية نهجا للتحقيق في خصائص استجابة التحفيز للخلايا العصبية TG في الفئران على مستوى السكان. تؤكد نتائجنا مع CCI للأيون جدوى اكتشاف التغييرات في خصائص الاستجابة للتحفيز. في حين تم استخدام المحفزات الميكانيكية والحرارية فقط في الدراسة الحالية ، يجب أن يكون هذا التحضير قابلا لتطبيق المحفزات الكيميائية لتحديد خصائص استجابة التحفيز للخلايا العصبية TG بشكل كامل. وبالمثل ، بينما ركزنا على خصائص استجابة التحفيز للوارد الجلدي ، بسبب ظهور ظواهر مثل الألم الميكانيكي الديناميكي بعد إصابة مؤلمة للعصب الجلدي ، يجب أن يكون من الممكن أيضا اكتشاف التغيرات في خصائص الواردات التي تعصب الهياكل القحفية الوجهية الأخرى مثل المفصل الصدغي الفكي (استجابة لحركات الفك غير الضارة مقابل الضارة) ، القرنية أو اللسان. يسمح الحقن المحيطي للنمط المصلي AAV9 بالحث الخاص بالخلايا العصبية ل GCaMP الخاص بالجهاز العصبي الطرفي. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لهذه الاستراتيجية في أن وضع العلامات الفيروسية يوفر تعبيرا قويا ومستمرا في خلايا ما بعد الانقسام (أي الخلايا العصبية) ولكن ليس في الخلايا الانقسامية (مثل الخلايا الظهارية). بالإضافة إلى ذلك ، يشير الفحص الأولي لأنسجة الجهاز العصبي الطرفي المختلفة إلى أنه يمكن استخدام هذه الاستراتيجية الفيروسية للتحقيق في العقد شبه المتعاطفة / الودية ، و DRG ، والجهاز العصبي المعوي ، أيضا (البيانات غير معروضة).

يوفر هذا الإعداد في الجسم الحي أيضا الأساس لاستكشاف العديد من المقارنات التي تفتقر إليها الأدبيات الحالية. في الجسم الحي لم يتم بعد إجراء دراسات سكانية بين الفئران TG و DRG ، الفئران مقابل الفأر TG. توضح البيانات المقدمة هنا الجدوى الجديدة لهذه التجارب المهمة التي سيتم إجراؤها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

كان الدكتور جولد يتلقى دعما للمنح من Grunenthal أثناء تطوير هذا الإعداد. لم يكن هناك تداخل في تركيز دراسة جروننتال والإعداد الموصوف في هذه المخطوطة. ليس لدى أي من المؤلفين الآخرين أي تضارب محتمل آخر في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتورة كاثي ألبرز وبريان ديفيس على استخدام برنامج Leica Microscope and Metamorph ، وتشارلز وارويك للمساعدة في بناء جهاز بلتيير الحراري الخاص بنا ، والدكتور ريموند سيكولا للمساعدة في استكشاف أخطاء التحضير الجراحي وإصلاحها. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة: F31NS125993 (JYG) و T32NS073548 (JYG) و R01NS122784 (MSG و RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 204 ،
<em>في الجسم الحي</em> تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الحسية في العقدة الثلاثية التوائم للفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter