Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI) maken een robuuste analyse op populatieniveau van sensorische neuronsignalering mogelijk. Hier hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld die in vivo GECI-visualisatie van de activiteit van trigeminusganglia-neuronen bij ratten mogelijk maakt.

Abstract

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) maken beeldvormingstechnieken mogelijk om veranderingen in intracellulair calcium in gerichte celpopulaties te volgen. Hun grote signaal-ruisverhouding maakt GECI's een krachtig hulpmiddel voor het detecteren van stimulus-opgewekte activiteit in sensorische neuronen. GECI's vergemakkelijken analyse op populatieniveau van stimuluscodering met het aantal neuronen dat tegelijkertijd kan worden bestudeerd. Deze populatiecodering wordt het meest geschikt in vivo gedaan. Dorsale wortelganglia (DRG), die de soma van sensorische neuronen huisvesten die somatische en viscerale structuren onder de nek innerveren, worden het meest gebruikt voor in vivo beeldvorming omdat deze structuren relatief gemakkelijk toegankelijk zijn. Meer recentelijk werd deze techniek bij muizen gebruikt om sensorische neuronen in het trigeminusganglion (TG) te bestuderen die orale en craniofaciale structuren innerveren. Er zijn veel redenen om TG naast DRG te bestuderen, waaronder de lange lijst van pijnsyndromen die specifiek zijn voor orale en craniofaciale structuren en die veranderingen in sensorische neuronactiviteit lijken te weerspiegelen, zoals trigeminusneuralgie. Muizen worden het meest gebruikt in de studie van DRG- en TG-neuronen vanwege de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Echter, met verschillen in grootte, gebruiksgemak en potentieel belangrijke soortverschillen, zijn er redenen om TG-neuronen bij ratten te bestuderen in plaats van bij muizen. Zo ontwikkelden we een aanpak voor het in vivo in beeld brengen van TG-neuronen van ratten. We injecteerden neonatale pups (p2) intraperitoneaal met een AAV die codeert voor GCaMP6s, wat resulteerde in >90% infectie van zowel TG- als DRG-neuronen. TG werd gevisualiseerd bij de volwassene na craniotomie en decorticatie, en veranderingen in GCaMP6s-fluorescentie werden gecontroleerd in TG-neuronen na stimulatie van mandibulaire en maxillaire gebieden van het gezicht. We bevestigden dat verhogingen van fluorescentie door stimulus werden opgeroepen met perifere zenuwblokkade. Hoewel deze benadering veel potentiële toepassingen heeft, gebruiken we het om de subpopulatie(s) van TG-neuronen te karakteriseren die zijn veranderd na perifere zenuwbeschadiging.

Introduction

Somatosensatie, de neurale codering van mechanische, thermische en chemische stimuli die inwerken op de huid of andere lichaamsstructuren, waaronder spieren, botten en ingewanden, begint met activiteit in primaire afferente neuronen die deze structuren innerveren1. Elektrofysiologische benaderingen op basis van één eenheid hebben een schat aan informatie opgeleverd over de afferente subtypes die bij dit proces betrokken zijn, evenals hoe hun stimulus-responseigenschappen in de loop van de tijd kunnen veranderen 1,2,3. Hoewel er sterk bewijs blijft ter ondersteuning van de gelabelde lijntheorie, die suggereert dat specifieke sensorische modaliteiten worden overgebracht door specifieke subpopulatie(s) van neuronen, suggereert het vermogen van veel subpopulaties van neuronen om te reageren op dezelfde soorten mechanische, thermische en chemische stimuli dat de meerderheid van de somatosensorische stimuli wordt gecodeerd door meerdere subpopulaties van neuronen4, 5. okt. Een beter begrip van somatosensatie zal dus alleen komen met de mogelijkheid om de activiteit van 10's, zo niet honderden neuronen tegelijkertijd te bestuderen.

Vooruitgang in optische benaderingen met de relatief recente komst van confocale en vervolgens multifoton- en digitale beeldvormingstechnieken hebben de mogelijkheid vergemakkelijkt om relatief niet-invasieve analyses op populatieniveau van neuronale activiteit uit te voeren 6,7. Een van de laatste hindernissen bij de toepassing van deze technologie is de ontwikkeling van hulpmiddelen om de optische beoordeling van neurale activiteit mogelijk te maken. Gezien de snelheid van een actiepotentiaal die in minder dan een milliseconde kan beginnen en eindigen, zou een spanningsgevoelige kleurstof met het vermogen om veranderingen in membraanpotentiaal te volgen met de snelheid van een actiepotentiaal het ideale hulpmiddel voor dit doel zijn. Maar hoewel er enorme vooruitgang is geboekt op dit gebied 7,8,9,10, is de signaal-ruisverhouding voor veel van deze kleurstoffen nog steeds niet hoog genoeg om een populatieanalyse van honderden neuronen op celniveau mogelijk te maken. Als alternatieve benadering hebben onderzoekers zich gericht op het monitoren van veranderingen in de intracellulaire Ca2+-concentratie ([Ca2+]i). De beperkingen van deze strategie zijn vanaf het begin duidelijk geweest en omvatten het feit dat een toename van [Ca2+]i een indirecte maat is voor neurale activiteit11; dat een toename van [Ca2+]i kan optreden onafhankelijk van de instroom van Ca2+ die gepaard gaat met de activering van spanningsafhankelijke Ca2+-kanalen (VGCC's)12,13; dat de omvang en de duur van een Ca2+ transiënt kunnen worden gecontroleerd door processen die onafhankelijk zijn van VGCC-activiteit 11,12,14; en dat het tijdsverloop van Ca2+ transiënten veel groter is dan dat van een actiepotentiaal15. Desalniettemin zijn er een aantal belangrijke voordelen verbonden aan het gebruik van Ca2+ als indirecte maat voor neurale activiteit. Niet de minste hiervan is de signaal-ruisverhouding die wordt geassocieerd met de meeste Ca2+-indicatoren, die zowel de omvang van de verandering in intracellulaire Ca2+ weerspiegelt als het feit dat het signaal voortkomt uit de driedimensionale ruimte van het cytosol in plaats van de tweedimensionale ruimte van het celmembraan. Bovendien is het met de ontwikkeling van genetisch gecodeerde Ca2+-indicatoren (GECI's) mogelijk om te profiteren van genetische strategieën om de expressie van de Ca2+-indicatoren in specifieke subpopulaties van cellen te stimuleren, waardoor analyses op populatieniveau in intacte preparaten worden vergemakkelijkt (bijv.zie 16).

Gezien het aantal genetische hulpmiddelen dat nu beschikbaar is in muizen, zou het geen verrassing moeten zijn dat GECI's het meest op grote schaal zijn gebruikt bij deze soort. Muislijnen met constitutieve GECI-expressie in subpopulaties van sensorische neuronen zijn ontwikkeld 7,16,17. Met de ontwikkeling van muislijnen die recombinasen tot expressie brengen in specifieke celtypen, is het mogelijk om nog geavanceerdere strategieën te gebruiken om GECI-expressie te beheersen15. Hoewel deze instrumenten steeds krachtiger worden, zijn er een aantal redenen waarom andere soorten, zoals ratten, geschikter zouden kunnen zijn voor sommige experimentele vragen. Deze omvatten het grotere formaat, waardoor een aantal experimentele manipulaties mogelijk zijn die moeilijk, zo niet onmogelijk zijn bij de kleinere muis; het gemak waarmee ratten kunnen worden getraind in relatief complexe gedragstaken; en op zijn minst enig bewijs dat biofysische eigenschappen en expressiepatronen van verschillende ionkanalen in sensorische neuronen van ratten meer lijken op die waargenomen in menselijke sensorische neuronen dan dezelfde kanalen in muizen ten opzichte van de mens.

Hoewel de transductie van somatosensorische stimuli over het algemeen plaatsvindt in de perifere uiteinden van primaire afferenten, moet het actiepotentiaal dat in de periferie wordt geïnitieerd, door de structuur gaan die primaire afferente somata herbergt, ook wel dorsale wortel (DRG) of trigeminus (TG) ganglia genoemd voordat het het centrale zenuwstelsel bereikt19. Hoewel er aanwijzingen zijn dat niet elke actiepotentiaal die zich voortplant langs een primair afferent axon het cellichaamzal binnendringen 20, een gevolg van het feit dat de primaire afferente somata verbonden zijn met het belangrijkste afferente axon via een T-splitsing19, lijken de meeste actiepotentialen die in de periferie worden geïnitieerd de soma21 binnen te dringen. Dit levert drie experimentele voordelen op bij het gebruik van GECI's om populatiecodering in primaire afferenten te beoordelen: de grote omvang van het cellichaam ten opzichte van de axonen verhoogt het signaal tot ruis verder bij gebruik van [Ca2+]i als een indirecte maat voor afferente activiteit; de DRG zijn over het algemeen gemakkelijk toegankelijk; En het beoordelen van activiteit op een plaats die ruimtelijk ver verwijderd is van de afferente terminals, minimaliseert de potentiële impact van de operatie die nodig is om de ganglia bloot te leggen op de stimulus-responseigenschappen van de afferente terminals. Omdat TG zich echter onder de hersenen (of boven het palet) bevindt, zijn ze veel moeilijker toegankelijk dan DRG. Bovendien, hoewel er veel overeenkomsten zijn tussen DRG- en TG-neuronen, is er ook een groeiende lijst met verschillen. Dit omvat de ruwweg somatotopische organisatie van neuronen in de TG22, unieke geïnnerveerde structuren, verschillende centrale terminale beëindigingspatronen 23,24,25,26, en nu een groeiende lijst van verschillen in zowel genexpressie27,28 als functionele receptorexpressie29. Bovendien, omdat we geïnteresseerd zijn in de identificatie van perifere mechanismen van pijn, suggereert het relatief grote aantal pijnsyndromen die uniek lijken te zijn voor het trigeminussysteem (bijv. migraine, trigeminusneuralgie, brandende mondsyndroom) die afwijkende activiteit in primaire afferenten lijken te omvatten 30,31,32, dat de TG rechtstreeks moet worden bestudeerd.

Dus, terwijl stimulus-respons eigenschappen van TG-neuronen zijn bestudeerd met GECI's in de muis16, omdat de hierboven genoemde redenen suggereren dat de rat een geschiktere soort kan zijn om een verscheidenheid aan experimentele vragen te beantwoorden, was het doel van de huidige studie om een benadering te ontwikkelen om GECI's te gebruiken om TG-neuronen in de rat te bestuderen. Om dit te bereiken, gebruikten we een virale benadering om de expressie van de GECI GCaMP6's in het perifere zenuwstelsel te stimuleren. Vervolgens hebben we de voorhersenen verwijderd om toegang te krijgen tot de TG. Ten slotte werden mechanische en thermische stimuli op het gezicht aangebracht, terwijl neuronale reacties werden beoordeeld onder fluorescerende microscopie. Samen ondersteunen deze gegevens een rol voor het gebruik van de rat om veranderingen in de TG onder veel staten te onderzoeken, waardoor de toolkit wordt uitgebreid voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in sensorische codering in het trigeminussysteem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten met het gebruik van dieren in onderzoek werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen die zijn opgesteld door de National Institutes of Health en de International Association for the Study of Pain en zijn goedgekeurd door de University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protocol #22051100). Aan het einde van elk experiment werden ratten geëuthanaseerd via exanguinatie met hartperfusie van ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), een benadering die is goedgekeurd door de American Veterinary Medical Association en de Universiteit van Pittsburgh IACUC.

1. GCaMP-inductie

  1. Bestel tijdzwangere Sprague Dawley-ratten zodat pups op het juiste moment na de geboorte kunnen worden geïnjecteerd.
  2. Spuit de handschoenen in met 70% EtOH voordat u elke rattenpup aanraakt. Dit zal de moeder ervan weerhouden de jongen te kannibaliseren.
  3. Wattenstaafje rattenpups (P1-2) met 70% EtOH en verdoven op ijs gedurende 3 min.
  4. Injecteer 15 μL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) intraperitoneaal met behulp van een 25 μL steriele, gasdichte Hamilton-spuit.

2. Blootstellingschirurgie aan trigeminusganglion

  1. Intraperitonese cocktail (55 mg/kg ketamine, 5,5 mg/kg xylazine, 1 mg/kg acepromazine) op basis van lichaamsgewicht toedienen aan ratten van 6-8 weken oud (ongeveer 150-200 g).
    OPMERKING: Dit is over het algemeen voldoende om een chirurgisch anesthesievlak te behouden, zoals beoordeeld door de afwezigheid van een terugtrekkingsreflex op schadelijke kneep van een achterpoot. Vul echter aan met isofluraan via een neuskegel als de dieren licht worden.
  2. Eenmaal volledig verdoofd, scheert u het haar en de snorharen van het hoofd en gezicht.
  3. Monteer de rat op een stereotaxisch frame met oorbalken en plaats er een verwarmingskussen (~37 oC) onder om de lichaamstemperatuur op peil te houden.
  4. Bewaak vitale functies (hartslag, ademhalingsfrequentie, zuurstofverzadiging in het bloed) met een muisoximeter of vergelijkbaar.
    OPMERKING: De lichaamstemperatuur wordt gecontroleerd door een rectale sonde en op peil gehouden door ratten op een feedbackgestuurde circulerende waterdeken te plaatsen.
  5. Plaats gaas gedrenkt in ijskoude zoutoplossing op het hoofd om de bloedvaten te vernauwen om bloedingen te minimaliseren. Maak met een scalpel maat 15 een incisie in de middellijn van de huid en spier over de schedel.
  6. Gebruik stompe dissectie van de huid en spieren om de schedel bloot te leggen.
  7. Gebruik een 1/4 ronde boor om de schedelkap voorzichtig te perforeren om de voorhersenen bloot te leggen. Gebruik vervolgens rongeurs (2,5 mm cup) om voorzichtig door de schedel te snijden.
  8. Maak met een scalpel maat 15 een incisie in de hersenen (Bregma: -3,80) en de bulbus olfactorius.
    OPMERKING: Als u meer caudaal voorbij dit punt snijdt, zal dit leiden tot de dood van ratten
  9. Gebruik een spatel om de dura voorzichtig los te koppelen van de schedel en til voorzichtig de afgehakte hersenen op om de TG en de basis van de schedel te onthullen.
    OPMERKING: Aanvullend gebruik van ijskoude zoutoplossing perfusie tijdens de extractie zal het bloeden minimaliseren en het volgende dissectieveld optimaliseren.
  10. Gebruik een cauterisatiepen om eventuele bloedingen als gevolg van de extractie te stelpen.
    OPMERKING: Het doorsnijden van de dura zal resulteren in onvermijdelijke bloedingen. Het is het beste om ijskoude aCSF (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glucose, 2,5 mM CaCl2) te bereiden om de schedelholte te baden om de bloedvaten te helpen vernauwen met behoud van de neuronale gezondheid.

3. GCaMP6s-beeldvorming

OPMERKING: Gezien de grootte en dichtheid van deze neuronen, zal het gebruikte beeldvormings- en data-acquisitiesysteem (objectief, microscoop, lichtbron, camera) het aantal gevisualiseerde GECI+ -cellen bepalen. De lichtbron, het objectief en de camera bepalen ook de parameters die worden gebruikt voor beeldacquisitie, waaronder de belichtingstijd en de beeldopnamesnelheid. Hoewel multifoton- en confocale technieken kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de parameters van het experiment, kan epifluorescentiemicroscopie voldoende zijn om veel cellen op te lossen. Elk beeldacquisitiepakket kan worden gebruikt. Idealiter is de stimulustoepassing tijdslot met het softwarepakket voor beeldacquisitie.

  1. Plaats de schedelholte onder het objectief en breng de TG scherp in beeld met behulp van zichtbaar licht.
  2. De excitatiegolflengte van GCaMP6s is 496 nm en de emissiegolflengte is 513 nm; gebruik dus de juiste dichroïsche en filterkubussen om GCaMP+- cellen te lokaliseren. Pas de focus aan om het gebied van de ganglia te lokaliseren en op te lossen waarin neuronen reageren op stimuli die worden toegepast op het receptieve interessegebied.
  3. Gebruik een 10x objectief om visualisaties mogelijk te maken van de meeste neuronen in de TG die reageren op mechanische stimuli die worden toegepast op een gebied van 1cm2 van het gezicht16. Gebruik een 20x droog objectief met een lange werkafstand (10,8 mm) om de resolutie te verhogen.
  4. Gebruik acquisitiesoftware (bijv. Metamorph) om fluorescentiegegevens te verzamelen in de loop van de tijd en als reactie op stimulustoepassing.
    1. Om fotobleking van de neuronen tot een minimum te beperken, moet u een zo kort mogelijke belichtingstijd gebruiken om de basislijn en de opgewekte toename van de fluorescentie te detecteren. Met het 20x, 0,40 NA-luchtobjectief, een 120 W kwikhalogenidelichtbron en een complementaire metaaloxide-halfgeleidercamera (CMOS) die in de huidige studie wordt gebruikt, wordt een belichtingstijd van 300 ms en een beeldacquisitiesnelheid van 3 Hz stabiele basislijnopnamen verkregen gedurende >90 minuten.
      OPMERKING: 1) Deze parameters voor beeldacquisitie moeten empirisch worden bepaald. 2) Mechanisch (borstel, punctaat, trilling, knijpen), thermisch (warmte en koude) en chemisch (capsaïcine, menthol, ontstekingsmediatoren) kunnen op het receptieve veld worden aangebracht. Een relatief goedkope subjectieve benadering is om de stimuli met de hand toe te passen. Er worden echter objectievere en reproduceerbare benaderingen aanbevolen, waarbij feedbackgestuurde actuatoren kunnen worden gebruikt voor herhaalde toepassing bij een bekende kracht. Hoewel Peltier-apparaten met feedbackregeling nuttig zijn voor gecontroleerde verwarming en koeling, zijn ze niet ideaal voor de thermische stimulatie van een gebogen gezicht. Feedbackgestuurde infraroodlichtbronnen zijn een alternatief voor verwarming, en koude spray is een minder dan ideaal alternatief voor koeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Omdat we eerder succes hebben gehad met het AAV9-serotype voor de infectie van sensorische neuronen van ratten15, gebruikten we dit serotype voor de expressie van GCaMP6's in TG-neuronen van ratten. Daarom hebben we eerst geprobeerd de sensorische neuroninfectie-efficiëntie van AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) te beoordelen toen dit virus werd toegediend aan neonatale rattenpups20. Dit virus maakt gebruik van de CAG-promotor, die een hoge mate van genexpressie stimuleert en handhaaft. Bovendien is aangetoond dat AAV9 sensorische neuronen efficiënt infecteert wanneer het wordt toegediend aan neonatale ratten33. De eerste injecties gebruikten 5 μL bij postnatale dag 5 (p5) pups, wat resulteerde in ongeveer 51,66% ± 14,33% efficiëntie (Figuur 1A). Om de infectiegraad te verhogen, gebruikten we uiteindelijk een groter volume virus (15 μL) bij jongere ratten (p2), waarbij de virustiter van 2,4 x 1014 gelijk bleef. Deze strategie resulteerde in 91,84% ± 3,18% (n = 8) van de geïnfecteerde neuronen (Figuur 1B).

Om te visualiseren dat de TG-neuronen het vibrissale kussen innerveren, ontwikkelden we vervolgens een chirurgische strategie om de TG in vivo bloot te leggen. Ongeveer 60% van de voorhersenen kan worden verwijderd zonder de belangrijkste ademhalingscentra aan te tasten. Dit komt overeen met hersenweefsel rostraal aan Bregma -3.80. Een schema van de blootgestelde TG (links) en het innervatiegebied van de infraorbitale zenuw (ION, rechts) zijn weergegeven in figuur 2. Het gebied van de TG dat aanleiding geeft tot de innervatie van het vibrissale kussen werd bepaald door de toepassing van lichte mechanische stimulatie (borstel) op het vibrissale kussen terwijl veranderingen in fluorescentie bij 20x werden gevolgd. Zoals voorspeld, was het V2-gebied van de TG, dat de maxillaire verdeling van het gezicht innerveert, het enige geactiveerde gebied. Dat wil zeggen, hoewel niet systematisch bestudeerd, werden er geen veranderingen in fluorescentie gedetecteerd als reactie op stimuli die werden toegepast op V1 (huid op het voorhoofd) of V3 (huid op de onderkaak) regio's wanneer de onderzochte neuronen konden worden geactiveerd met stimuli die op het vibrissale kussen werden toegepast. Veranderingen in fluorescentie bij baseline en in reactie op stimuli die op het vibrissale kussen werden toegepast, werden vervolgens gecontroleerd. Het interessegebied (V2) is afgebakend in figuur 3A. In overeenstemming met eerdere rapporten van relatief lage niveaus van rustactiviteit in sensorische neuronen34, was de fluorescentie in rust relatief laag in de meeste neuronen en was er weinig bewijs van spontane toename van fluorescentie (Figuur 3B). De criteria die worden gebruikt om stimulus-opgewekte activiteit in neuronen in de periferie 6,16,21 en CNS 12,35,36 te identificeren, is een evoluerend veld met verschillende geavanceerde workflowpakketten die vrij beschikbaar zijn gesteld 37,38. Een volledige bespreking van de sterke en zwakke punten van de verschillende benaderingen die worden gebruikt, valt buiten het bestek van dit manuscript. Aangezien dit niet de focus van de huidige studie was, gebruikten we relatief willekeurige en subjectieve criteria op basis van de piekrespons die werd waargenomen in regio's van de ganglia waarin er geen duidelijk detecteerbare neuronen waren (op basis van het vermogen om de kern te zien), zodat een neuron werd beschouwd als responsief op een stimulus als de toename van de fluorescentie was gekoppeld aan de stimulustoepassing (toename van fluorescentie gedetecteerd binnen 1 s na stimulustoepassing ( gebaseerd op de veronderstelling dat een actiepotentiaal geïnitieerd in de langzaamst geleidende axonen (0,2 m/s) geïnitieerd op een plaats niet meer dan 3 cm van het cellichaam het cellichaam in minder dan een seconde zou moeten bereiken), en was >6 keer de standaarddeviatie van de piekrespons (ΔF/F) gedetecteerd op een controleplaats (Figuur 3C). Vervolgens karakteriseerden we de reactie-eigenschappen van deze neuronen op natuurlijke stimuli: borstelen, punteren, warmte en kou. Voorbeelden van reacties op elk van deze stimuli zijn weergegeven in figuur 4. Met name de respons op punctaatstimulatie, die het vaakst wordt gebruikt in pijngerelateerde onderzoeken, heeft de meest robuuste respons (Figuur 4B,F).

Ons doel bij het ontwikkelen van deze techniek was om veranderingen in populatiecodering in TG-neuronen te kunnen beoordelen. Daarom hebben we de chronische vernauwingsschade aangepast aan de ION (CCI-ION), zoals eerder gebruikt29, om ratten 2 weken na zenuwbeschadiging te bestuderen. Na de inductie van het model hebben we de TG blootgelegd en de rust- en opgewekte activiteit in TG ipsilateraal en contralateraal van de plaats van het letsel beoordeeld. Interessant is dat de grootte van de piek opgewekte respons op borstel ~2-voudig was toegenomen aan de zenuwgewonde kant ten opzichte van de piekrespons op dezelfde stimulus die werd toegepast op de contralaterale kant (Figuur 5A-C). Bovendien, wanneer twee penseelstimuli in serie werden toegepast (met een interstimulus-interval van 10 s), was er een significante versterking van de grootte van de respons op de tweede stimulus aan de gewonde maar niet niet-gewonde kant (Figuur 5D).

Ten slotte, als een eerste controle-experiment om te bevestigen dat de stimulus-opgewekte toename van fluorescentie te wijten was aan actiepotentialen die in de periferie werden geïnitieerd, beoordeelden we de impact van tetrodotoxine (1 μM) op stimulus-opgewekte responsen. TTX werd percutaan geïnjecteerd in een volume van 200 μL zoals eerder beschreven28 om de infraorbitale zenuw aan te vallen. Zoals te zien is in figuur 6, werd de opgewekte activiteit bijna volledig geëlimineerd. Alles bij elkaar genomen tonen deze resultaten het nut aan van het gebruik van AAV9-GCaMP om de respons van TG-populaties in vivo te ondervragen.

Figure 1
Figuur 1: Hoge efficiëntie van GCaMP6s-infectie in TG-neuronen met neonatale AAV-injectie. (A) P5-rattenpups werden geïnjecteerd met 5 μL pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (titer: 2,4 x 1014) virus intraperitoneaal: GCaMP6s-expressie werd gedetecteerd in 51,7 ± 14,3% van de TG-neuronen (n = 3 plakjes per dier, 7 ratten). (B) Het verhogen van het injectievolume tot 15 μL bij jongere dieren (p2) verbeterde de infectie-efficiëntie: GCaMP6s-expressie werd gedetecteerd in 91,8 ± 3,2% van de TG-neuronen (n = 3 plakjes per dier, 8 ratten). Panelen aan de linkerkant zijn gekleurd voor GCaMP6's. Panelen in het midden waren gekleurd met NeuN, een neuron-specifieke marker. Panelen aan de rechterkant zijn een samengevoegde afbeelding van de GCaMP6s- en NeuN-panelen. De schaalbalk in het eerste paneel is hetzelfde voor alle volgende panelen. De grafiek aan de rechterkant is een grafiek van GCaMP6s-expressie (gemiddelde ± SEM) als percentage van het totale aantal neuronen per plak per dier, waarbij de individuele punten de gegevens voor elk dier zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Locatie van het trigeminusganglion (TG), de infraorbitale zenuw (ION) en het gebied van het gezicht (vibrissal pad) gestimuleerd. (A) De voorhersenen werden verwijderd om toegang tot de TG mogelijk te maken. (B) Gebied van het gezicht waarin natuurlijke stimuli werden toegepast ten opzichte van de ION en TG. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Door stimulus opgewekte toename van GCaMP6s-fluorescentie. (A) Totaal gezichtsveld bij een vergroting van 20x. Oogheelkundige (V1) en maxillaire (V2) afdelingen van de TG zijn geïndiceerd. (B,C) Het gebied in de doos wordt weergegeven in panelen B en C, die respectievelijk fluorescentiebeelden zijn voor en na borstelstimulatie van het vibrissale kussen. Witte cirkels zijn vergelijkingsgebieden die van belang zijn. Neuronen werden geacht te reageren op een stimulus op basis van de piekverandering in fluorescentie die werd waargenomen in vergelijkende interessegebieden zoals beschreven in de tekst. De schaalbalk in het eerste paneel is voor beide panelen hetzelfde. (D) Representatieve veranderingen in fluorescentie van neuronen getoond in B en C als reactie op een borstelstimulus die op het gezicht wordt toegepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Classificatie van neuronen op basis van hun reactie op stimuli die op het gezicht worden toegepast. Representatieve beelden van TG-neuronen voor (bovenste panelen - Baseline) en na (middelste paneel - Stimulatie) van reacties op een kamelenhaarborstel van 1 cm (A - Borstel), 1 cm2 raster van monofilamenten (B - Punctaat), verwarming (C - Warmte) en koeling (D - Koud) toegepast op hetzelfde deel van het gezicht. De schaalbalk in het eerste paneel is hetzelfde voor alle volgende panelen. Oranje cirkels geven een voorbeeld aan van een responsief neuron. Witte cirkels zijn vergelijkingsgebieden die van belang zijn. (E-H) Representatieve sporen van elke respons per stimulus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Zenuwbeschadiging verhoogt de door borstels opgewekte reacties in TG-neuronen. Typische reacties van TG-neuronen op borstelen die twee keer worden toegepast op het gezicht van de rat aan de kant contralateraal op een chronische vernauwingsverwonding van de infraorbitale zenuw (A, Contra) of aan de kant ipsilateraal op de zenuwbeschadiging (B, Ipsi). (C) Analyse van gepoolde gegevens van responsieve neuronen van zes ratten (de gegevens zijn per rat) bevestigden dat het verschil in de grootte van de eerste reactie op borstelen significant was (gepaarde t-toets). (D) Toen de piekrespons op de eerste en tweede stimulustoepassing werd geanalyseerd als een ratio (R2/R1), bevestigde analyse van de gepoolde gegevens dat de toename van de responsratio aan de zenuwgewonde kant significant was. ** p < 0,01 Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Blok van opgewekte activiteit in TG-neuronen met tetrodotoxine (TTX). (A) Fluorescentiegegevens van TG-neuronen ipsilateraal op een zenuwbeschadiging na injectie van TTX (200 μL, 1 μM) grenzend aan de infraorbitale zenuw na toepassing van een borstelstimulus (blauwe balk). (B) Gepoolde piekresponsgegevens van drie ratten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier demonstreren we een snelle, niet-invasieve manier om een GECI-rat te genereren voor beeldvorming van de TG. We kozen voor een CAG-promotor om hoge niveaus van genexpressie te stimuleren en te behouden. Hoewel eerdere studies suggereren dat andere AAV-serotypen de genexpressie in DRG-neuronen efficiënt kunnen stimuleren39, zijn onze resultaten consistent met een recente studie met intraperitoneale injectie van AAV bij pasgeborenen32, wat aangeeft dat het AAV9-serotype zeer efficiënt is in de infectie van neonatale sensorische neuronen bij ratten.

Door het oplossen van problemen met deze techniek is het de moeite waard om enkele valkuilen op te merken die een optimale infectie kunnen voorkomen. De belangrijkste variabele om in gedachten te houden is de leeftijd van de pups. Het zenuwstelsel van de rat ontwikkelt zich snel gedurende de eerste 7 dagen na denataal 40. We probeerden infecties op latere tijdstippen (bijv. p4-7), wat resulteerde in variabele en slechte efficiëntie. Eerdere tijdstippen (p1-4) produceren een robuustere en consistentere efficiëntie, waarbij p1-2 de hoogste infectiepercentages oplevert. De tweede variabele is het injectievolume. Ongeacht de leeftijd was een minimum van 15 μL nodig om een efficiëntie van meer dan 70% te produceren in de TG of DRG met een titer van 2,5 x 1014. We ontdekten dat, zelfs bij p2, intraperitoneale injecties van minder dan 10 μL zeer weinig expressie veroorzaken bij de volwassene. Het is mogelijk dat meer gelokaliseerde injecties, d.w.z. rechtstreeks in het receptieve interessegebied, bij lagere volumes vergelijkbare effecten zouden hebben. Deze aanpak vereist echter dat pups volledig worden verdoofd en kan trauma veroorzaken aan het weefsel van belang. Ten slotte is het mogelijk dat kleinere volumes kunnen worden gebruikt met hogere titers.

Het blootleggen van de TG voor GECI-beeldvorming is eerder uitgevoerd bij muizen16. Het vertalen van deze benadering naar de rat bracht echter verschillende problemen aan het licht die het overwegen waard waren. Ten eerste is de dikte van de schedel en dura bij de rat veel groter dan bij een muis. Daarom kan het verwijderen van de schedelkap een uitdaging vormen. We ontdekten dat een kleine boor een effectieve manier is om de schedelkap te perforeren, die vervolgens kan worden verwijderd met rongeurs. Een tweede probleem is het bloeden nadat de hersenen zijn verwijderd. Dit kan een blijvend probleem zijn voor zowel de levensduur van het preparaat als de helderheid van de beeldvorming, zo niet de eigenschappen van de neuronen. Gaas gedrenkt in ijskoud CSF kan op het blootgestelde oppervlak van de hersenen worden aangebracht om de hoofdslagaders te helpen sluiten. Het gebruik van een kleine cauterisatiepen kan ook effectief zijn bij het stelpen van verdere bloedingen. Ten slotte kan Gelfoam aan de contralaterale zijde van het beeldvormingsvenster ook helpen voorkomen dat bloed en CSF beeldvormingsproblemen veroorzaken. Een derde overweging is de hoeveelheid hersenen die moet worden verwijderd. We ontdekten dat het verwijderen van hersencaudaal tot ~Bregma -3.80 binnen een uur na verwijdering de dood tot gevolg heeft. De hersenen moeten dus in kleine stukjes worden verwijderd, waarbij zoveel mogelijk wordt behouden en zoveel mogelijk TG wordt blootgelegd.

Zoals in de inleiding is opgemerkt, is [Ca2+]i een indirecte maat voor neuronale activiteit, en bijgevolg betekent een toename van [Ca2+]i niet noodzakelijkerwijs dat er een toename van neurale activiteit is. Controle-experimenten zijn dus van cruciaal belang om te bevestigen dat wat als opgewekte activiteit wordt beschouwd, eigenlijk activiteit op zich is. Elektrisch opgewekte stimuli zouden bijvoorbeeld een tijdgebonden toename van [Ca2+]i moeten veroorzaken, die op een vergelijkbare schaal ligt als die van natuurlijk opgewekte stimuli. Belangrijk is dat deze activiteit moet worden geëlimineerd met de blokkade van de zenuw (d.w.z. TTX). Het is echter ook belangrijk op te merken dat ondanks deze belangrijke controles, het nog steeds mogelijk is dat sommige van de schijnbaar opgewekte verhogingen van [Ca2+]i te wijten zijn aan signalering in de ganglia, bijvoorbeeld als gevolg van het vrijkomen van de zender in de ganglia41, in plaats van aan een actiepotentiaal dat is geïnitieerd in de periferie die de celsoma is binnengedrongen.

Hoewel onze resultaten bevestigen dat van eerdere onderzoekers 16,42,43 die aangeven dat de signaal-ruisverhouding geassocieerd met veranderingen in GCaMP-fluorescentie in sensorische somata voldoende is voor gebruik met een standaard epifluorescentiemicroscoop, manipulaties zoals de zenuwbeschadiging die in de huidige studie wordt gebruikt, kunnen in verband worden gebracht met dergelijke dramatische veranderingen in neuronale activiteit en Ca 2+-signalering34, dat reacties in de ganglia geassocieerd kunnen zijn met zo'n grote toename van de schijnbare achtergrond, dat de reacties van individuele neuronen kunstmatig kunnen worden verzwakt. Hoewel er benaderingen voor beeldverwerking zijn ontwikkeld die kunnen helpen deze beperking aan te pakken44, kan confocale of multifotonenbeeldvorming nodig zijn om dit probleem zo effectief mogelijk op te lossen.

Alles bij elkaar biedt deze techniek een benadering voor het onderzoeken van de stimulus-respons eigenschappen van TG-neuronen in de rat op populatieniveau. Onze resultaten met de CCI van de ION bevestigen de haalbaarheid van het detecteren van veranderingen in deze stimulus-responseigenschappen. Hoewel in de huidige studie alleen mechanische en thermische stimuli werden gebruikt, zou dit preparaat vatbaar moeten zijn voor de toepassing van chemische stimuli om de stimulus-responseigenschappen van TG-neuronen volledig te definiëren. Evenzo, terwijl we ons concentreerden op stimulus-respons eigenschappen van cutane afferenten, vanwege de opkomst van fenomenen als dynamische mechanische allodynie na traumatisch letsel aan een huidzenuw, zou het ook mogelijk moeten zijn om veranderingen te detecteren in de eigenschappen van afferenten die andere craniofaciale structuren zoals het kaakgewricht innerveren (als reactie op onschadelijke versus schadelijke kaakbewegingen), hoornvlies of tong. Perifere injectie van het AAV9-serotype maakt neuronspecifieke inductie van GCaMP mogelijk die PNS-specifiek is. Een groot voordeel van deze strategie is dat virale labeling zorgt voor een robuuste, aanhoudende expressie in post-mitotische cellen (d.w.z. neuronen), maar niet in mitotische cellen (bijv. epitheelcellen). Bovendien geeft voorlopige screening van verschillende PNS-weefsels aan dat deze virale strategie ook kan worden gebruikt om para/sympathische ganglia, de DRG en het enterische zenuwstelsel te onderzoeken (gegevens niet getoond).

Deze in vivo voorbereiding biedt ook de basis om veel vergelijkingen te onderzoeken die in de huidige literatuur ontbreken. In vivo populatiestudies tussen TG bij ratten en DRG, TG bij ratten versus muizen, moeten nog worden uitgevoerd. De hier gepresenteerde gegevens illustreren de nieuwe haalbaarheid van deze belangrijke experimenten die moeten worden uitgevoerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Gold ontving subsidie van Grunenthal tijdens de ontwikkeling van dit preparaat. Er was geen overlap in de focus van de Grunenthal-studie en de voorbereiding die in dit manuscript wordt beschreven. Geen van de andere auteurs heeft andere potentiële belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgments

We willen Drs. Kathy Albers en Brian Davis bedanken voor het gebruik van hun Leica Microscope and Metamorph programma, Charles Warwick voor zijn hulp bij het bouwen van ons thermische Peltier-apparaat, en Dr. Raymond Sekula voor zijn hulp bij het oplossen van problemen met de chirurgische voorbereiding. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) en R01NS122784 (MSG en RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Tags

Neurowetenschap nummer 204
<em>In-vivo</em> Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter