Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In-vivo Calciumbilleddannelse af sensoriske neuroner i rotte trigeminusganglion

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI) muliggør en robust analyse på populationsniveau af sensorisk neuronsignalering. Her har vi udviklet en ny tilgang, der giver mulighed for in vivo GECI-visualisering af rottetrigeminusganglier neuronaktivitet.

Abstract

Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI'er) muliggør billeddannelsesteknikker til overvågning af ændringer i intracellulært calcium i målrettede cellepopulationer. Deres store signal-støj-forhold gør GECI'er til et kraftfuldt værktøj til at detektere stimulusfremkaldt aktivitet i sensoriske neuroner. GECI'er letter analyse på populationsniveau af stimuluskodning med antallet af neuroner, der kan studeres samtidigt. Denne populationskodning udføres mest hensigtsmæssigt in vivo. Dorsalrodsganglier (DRG), som huser soma af sensoriske neuroner, der inderverer somatiske og viscerale strukturer under nakken, bruges mest til in vivo-billeddannelse , fordi disse strukturer er relativt let tilgængelige. For nylig blev denne teknik brugt i mus til at studere sensoriske neuroner i trigeminusganglion (TG), der inderverer orale og kraniofaciale strukturer. Der er mange grunde til at studere TG ud over DRG, herunder den lange liste over smertesyndromer, der er specifikke for orale og kraniofaciale strukturer, der synes at afspejle ændringer i sensorisk neuronaktivitet, såsom trigeminusneuralgi. Mus bruges mest i undersøgelsen af DRG- og TG-neuroner på grund af tilgængeligheden af genetiske værktøjer. Men med forskelle i størrelse, nem håndtering og potentielt vigtige artsforskelle er der grund til at studere rotter frem for muse-TG-neuroner. Således udviklede vi en tilgang til billeddannelse af rotte-TG-neuroner in vivo. Vi injicerede neonatale hvalpe (p2) intraperitonealt med en AAV-kodning GCaMP6'er, hvilket resulterede i >90% infektion af både TG- og DRG-neuroner. TG blev visualiseret hos den voksne efter kraniotomi og dekortikation, og ændringer i GCaMP6s fluorescens blev overvåget i TG-neuroner efter stimulering af mandibulære og maksillære områder i ansigtet. Vi bekræftede, at stigninger i fluorescens blev stimulusfremkaldt med perifer nerveblok. Selvom denne tilgang har mange potentielle anvendelser, bruger vi den til at karakterisere underpopulationen (e) af TG-neuroner, der er ændret efter perifer nerveskade.

Introduction

Somatosensation, den neurale kodning af mekaniske, termiske og kemiske stimuli, der påvirker huden eller andre kropslige strukturer, herunder muskler, knogler og indvolde, starter med aktivitet i primære afferente neuroner, der inderverer disse strukturer1. Enkeltenhedsbaserede elektrofysiologiske tilgange har givet et væld af oplysninger om de afferente undertyper, der er involveret i denne proces, samt hvordan deres stimulus-responsegenskaber kan ændre sig over tid 1,2,3. Mens der stadig er stærke beviser til støtte for den mærkede linjeteori, hvilket tyder på, at specifikke sensoriske modaliteter formidles af specifikke subpopulationer af neuroner, antyder mange underpopulationers evne til at reagere på de samme typer mekaniske, termiske og kemiske stimuli, at størstedelen af somatosensoriske stimuli er kodet af flere underpopulationer af neuroner4, 5. Således vil en bedre forståelse af somatosensation kun komme med evnen til at studere aktiviteten af 10'erne, hvis ikke hundredvis, af neuroner samtidigt.

Fremskridt inden for optiske tilgange med den relativt nylige fremkomst af konfokale og efterfølgende multifoton- og digitale billeddannelsesteknikker har lettet evnen til at udføre relativt ikke-invasive analyser på populationsniveau af neuronal aktivitet 6,7. En af de sidste forhindringer i anvendelsen af denne teknologi har været udviklingen af værktøjer til at muliggøre optisk vurdering af neural aktivitet. I betragtning af hastigheden af et handlingspotentiale, der kan starte og slutte på mindre end et millisekund, ville et spændingsfølsomt farvestof med kapacitet til at følge ændringer i membranpotentiale med hastigheden af et handlingspotentiale være det ideelle værktøj til dette formål. Men mens der har været enorme fremskridt på dette område 7,8,9,10, er signal-støj-forholdet for mange af disse farvestoffer stadig ikke helt højt nok til at muliggøre en befolkningsanalyse af hundredvis af neuroner på enkeltcelleniveau. Som en alternativ tilgang har efterforskere vendt sig til at overvåge ændringer i intracellulær Ca2+ koncentration ([Ca2+]i). Begrænsningerne med denne strategi har været klare fra starten og inkluderer det faktum, at en stigning i [Ca2+]i er et indirekte mål for neural aktivitet11; at en stigning i [Ca2+]i kan forekomme uafhængigt af Ca2+ tilstrømning i forbindelse med aktivering af spændingsstyrede Ca2+ kanaler (VGCC'er)12,13; at størrelsen og varigheden af enCa2+-transient kan styres ved processer, der er uafhængige af VGCC-aktivitet 11,12,14; og at tidsforløbet for Ca2+ transienter langt overstiger tidsforløbet for et aktionspotentiale15. Ikke desto mindre er der en række væsentlige fordele forbundet med brugen af Ca2+ som et indirekte mål for neural aktivitet. Ikke mindst signal-støj-forholdet forbundet med de fleste Ca2+ indikatorer, hvilket afspejler både størrelsen af ændringen i intracellulær Ca2+ og det faktum, at signalet stammer fra cytosolens tredimensionelle rum snarere end cellemembranens todimensionelle rum. Med udviklingen af genetisk kodede Ca2+-indikatorer (GECI'er) er det desuden muligt at drage fordel af genetiske strategier til at drive ekspressionen af Ca2+-indikatorerne i specifikke subpopulationer af celler, hvilket letter analyser på populationsniveau i intakte præparater (f.eks. se16).

I betragtning af antallet af genetiske værktøjer, der nu er tilgængelige i mus, bør det ikke være nogen overraskelse, at GECI'er er blevet brugt mest i denne art. Muselinjer med konstitutiv GECI-ekspression i subpopulationer af sensoriske neuroner er blevet udviklet 7,16,17. Med udviklingen af muselinjer, der udtrykker rekombinaser i specifikke celletyper, er det muligt at bruge endnu mere sofistikerede strategier til at kontrollere GECI-ekspression15. Men selvom disse værktøjer er stadig mere kraftfulde, er der en række grunde til, at andre arter, såsom rotter, kan være mere passende til nogle eksperimentelle spørgsmål. Disse omfatter den større størrelse, hvilket letter en række eksperimentelle manipulationer, der er vanskelige, hvis ikke umulige, i den mindre mus; den lette træning af rotter i relativt komplekse adfærdsmæssige opgaver; og i det mindste nogle tegn på, at biofysiske egenskaber og ekspressionsmønstre for flere ionkanaler i rottesensoriske neuroner kan være mere lig den, der observeres i humane sensoriske neuroner, end de samme kanaler i mus i forhold til den menneskelige18.

Mens transduktionen af somatosensoriske stimuli generelt forekommer i de perifere terminaler af primære afferenter, skal handlingspotentialet initieret i periferien passere gennem strukturen, der huser primær afferent somata, kaldet dorsal rod (DRG) eller trigeminale (TG) ganglier, inden de når centralnervesystemet19. Mens der er tegn på, at ikke alle handlingspotentialer, der formerer sig langs en primær afferent axon, vil invadere cellelegemet20, en konsekvens af det faktum, at den primære afferente somata er forbundet med den vigtigste afferente axon via et T-kryds19, synes størstedelen af handlingspotentialer initieret i periferien at invadere soma21. Dette giver tre eksperimentelle fordele ved anvendelse af GECI'er til at vurdere populationskodning i primære afferenter: den store størrelse af cellelegemet i forhold til axonerne øger signalet til støj yderligere, når [Ca2+]i anvendes som et indirekte mål for afferent aktivitet; DRG er generelt let tilgængelige; Og vurdering af aktivitet på et sted, der er rumligt fjernt fra de afferente terminaler, minimerer den potentielle virkning af operationen, der er nødvendig for at udsætte ganglierne på stimulus-responsegenskaberne hos de afferente terminaler. Men fordi TG er placeret under hjernen (eller over paletten), er de langt vanskeligere at få adgang til end DRG. Selvom der er mange ligheder mellem DRG- og TG-neuroner, er der også en voksende liste over forskelle. Dette inkluderer den omtrent somatotopiske organisering af neuroner i TG22, unikke strukturer innerveret, forskellige centrale terminale termineringsmønstre 23,24,25,26 og nu en voksende liste over forskelle i både genekspression27,28 og funktionel receptorekspression29. Derudover, fordi vi er interesserede i identifikation af perifere smertemekanismer, antyder det relativt store antal smertesyndromer, der synes at være unikke for trigeminussystemet (fx migræne, trigeminusneuralgi, brændende mundsyndrom), der synes at involvere afvigende aktivitet i primære afferenter 30,31,32, at TG skal undersøges direkte.

Mens stimulus-respons-egenskaber af TG-neuroner er blevet undersøgt med GECI'er i mus16, fordi årsagerne ovenfor tyder på, at rotten kan være en mere passende art til at løse en række eksperimentelle spørgsmål, var formålet med denne undersøgelse at udvikle en tilgang til at bruge GECI'er til at studere TG-neuroner hos rotten. For at opnå dette brugte vi en viral tilgang til at drive ekspressionen af GECI GCaMP6'erne i det perifere nervesystem. Vi fjernede derefter forhjernen for at give adgang til TG. Endelig blev mekaniske og termiske stimuli påført ansigtet, mens neuronale reaktioner blev vurderet under fluorescerende mikroskopi. Sammen understøtter disse data en rolle for at bruge rotten til at undersøge ændringer i TG under mange stater og udvide værktøjssættet til efterforskere, der er interesseret i sensorisk kodning i trigeminussystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter, der involverer brug af dyr i forskning, blev udført i overensstemmelse med standarder fremsat af National Institutes of Health og International Association for Study of Pain og blev godkendt af University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protokol # 22051100). Ved afslutningen af hvert forsøg blev rotter aflivet via eksanguinering med hjerteperfusion af iskold fosfatbufret saltvand (PBS), en tilgang godkendt af American Veterinary Medical Association og University of Pittsburgh IACUC.

1. GCaMP induktion

  1. Bestil tidsdrægtige Sprague Dawley-rotter, så hvalpene kan injiceres på det rette tidspunkt efter fødslen.
  2. Spray handskerne med 70% EtOH inden håndtering af hver rottehvalp. Dette vil afskrække dæmningen fra at kannibalisere de unge.
  3. Svab rotteunger (P1-2) med 70% EtOH og bedøvelse på is i 3 min.
  4. 15 μL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) injiceres intraperitonealt ved hjælp af en 25 μL steril, gastæt Hamilton-sprøjte.

2. Trigeminal ganglion eksponering kirurgi

  1. Administrer anæstetisk cocktail (55 mg/kg ketamin, 5,5 mg/kg xylazin, 1 mg/kg acepromazin) intraperitonealt baseret på kropsvægt til 6-8 uger gamle rotter (ca. 150-200 g).
    BEMÆRK: Dette er generelt tilstrækkeligt til at opretholde et kirurgisk anæstesiplan vurderet ved fraværet af en tilbagetrækningsrefleks til skadelig knivspids af en bagpote. Suppler dog med isofluran via en næsekegle, hvis dyrene bliver lyse.
  2. Når du er fuldt bedøvet, barberer du hår og knurhår i hoved og ansigt.
  3. Monter rotten på en stereotaksisk ramme med ørestænger og placer en varmepude (~ 37 oC) nedenunder for at opretholde kropstemperaturen.
  4. Overvåg vitale tegn (puls, respirationsfrekvens, iltmætning i blodet) med et museoximeter eller sammenligneligt.
    BEMÆRK: Kropstemperaturen overvåges af en rektal sonde og opretholdes ved at placere rotter på et feedbackkontrolleret cirkulerende vandtæppe.
  5. Placer gaze dyppet i iskold saltvand på hovedet for at indsnævre blodkar for at minimere blødning. Brug en skalpel i størrelse 15 til at lave et midterlinjesnit i huden og musklen over kraniet.
  6. Brug stump dissektion af hud og muskler til at udsætte kraniet.
  7. Brug et 1/4 rundt bor til forsigtigt at perforere kraniehætten for at udsætte forhjernen. Brug derefter rongeurs (2,5 mm kop) til forsigtigt at skære gennem kraniet.
  8. Brug en skalpel i størrelse 15 til at lave et snit i hjernen (Bregma: -3,80) og den olfaktoriske pære.
    BEMÆRK: At skære mere kausalt forbi dette punkt vil resultere i rottedød
  9. Brug en spatel til forsigtigt at afbryde dura fra kraniet og løft forsigtigt den afskårne hjerne for at afsløre TG og bunden af kraniet.
    BEMÆRK: Yderligere brug af iskold saltvandsperfusion under hele ekstraktionen minimerer blødning og optimerer følgende dissektionsfelt.
  10. Brug en cautery pen, stamme enhver blødning som følge af ekstraktionen.
    BEMÆRK: Skæring af dura vil resultere i uundgåelig blødning. Det er bedst at forberede iskold aCSF (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glucose, 2,5 mM CaCl2) for at bade kraniehulen for at hjælpe med at indsnævre blodkar og samtidig opretholde neuronal sundhed.

3. GCaMP6s-billeddannelse

BEMÆRK: I betragtning af størrelsen og tætheden af disse neuroner vil det anvendte billeddannelses- og dataindsamlingssystem (objektiv, mikroskop, lyskilde, kamera) bestemme antallet af GECI + celler, der visualiseres. Lyskilden, målet og kameraet bestemmer også de parametre, der bruges til billedoptagelse, herunder eksponeringstid og billedoptagelseshastighed. Mens multifoton og konfokale teknikker kan anvendes afhængigt af eksperimentets parametre, kan epifluorescensmikroskopi være tilstrækkelig til at løse mange celler. Enhver billedoptagelsespakke kan bruges. Ideelt set er stimulusapplikationen tidslåst med softwarepakken til billedoptagelse.

  1. Placer kraniehulrummet under målet, og bring TG i fokus ved hjælp af synligt lys.
  2. GCaMP6s excitationsbølgelængde er 496 nm, og dens emissionsbølgelængde er 513 nm; Brug derfor de passende dikroiske og filterkuber til at lokalisere GCaMP+ celler. Juster fokus for at lokalisere og løse det område af ganglierne, hvor neuroner reagerer på stimuli, der anvendes på det modtagelige interesseområde.
  3. Brug et 10x mål til at muliggøre visualiseringer af de fleste neuroner i TG, der reagerer på mekaniske stimuli anvendt på en 1 cm2 region af ansigtet16. Brug et 20x tørt mål med en lang arbejdsafstand (10,8 mm) for at øge opløsningen.
  4. Brug anskaffelsessoftware (f.eks. Metamorph) til at indsamle fluorescensdata over tid og som reaktion på stimulusapplikation.
    1. For at minimere fotoblegning af neuronerne skal du bruge så kort eksponeringstid som muligt til at detektere baseline og fremkaldte stigninger i fluorescens. Med 20x, 0,40 NA luftmålet, en 120 W kviksølvhalogenid lyskilde og et komplementært metaloxid-halvleder (CMOS) kamera, der anvendes i denne undersøgelse, en eksponeringstid på 300 ms og en billedoptagelseshastighed på 3 Hz, opnås stabile baseline-optagelser i >90 min.
      BEMÆRK: 1) Disse billedoptagelsesparametre skal bestemmes empirisk. 2) Mekanisk (børste, punkteret, vibration, knivspids), termisk (varme og kulde) og kemisk (capsaicin, mentol, inflammatoriske mediatorer) kan påføres det modtagelige felt. En relativt billig subjektiv tilgang er at anvende stimuli manuelt. Mere objektive og reproducerbare tilgange anbefales dog, hvor feedbackstyrede aktuatorer kan anvendes til gentagen anvendelse med en kendt kraft. Mens feedback-kontrollerede Peltier-enheder er nyttige til kontrolleret opvarmning og afkøling, er de ikke ideelle til termisk stimulering af et buet ansigt. Feedback-kontrollerede infrarøde lyskilder er et alternativ til opvarmning, og kold spray er et mindre end ideelt alternativ til køling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fordi vi tidligere har haft succes med AAV9-serotypen til infektion af rottesensoriske neuroner15, brugte vi denne serotype til ekspression af GCaMP6'er i rotte-TG-neuroner. Vi søgte derfor først at vurdere effektiviteten af sensorisk neuroninfektion af AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP), da denne virus blev administreret til neonatale rotteunger20. Denne virus bruger CAG-promotoren, som driver og opretholder høje niveauer af genekspression. Desuden har AAV9 vist sig effektivt at inficere sensoriske neuroner, når de administreres til neonatale rotter33. De første injektioner udnyttede 5 μL i hvalpe efter fødslen dag 5 (p5), hvilket resulterede i ca. 51,66% ± 14,33% effektivitet (figur 1A). For at øge infektionshastigheden brugte vi til sidst en større mængde virus (15 μL) hos yngre rotter (p2) og holdt virustiteren på 2,4 x 1014 den samme. Denne strategi resulterede i 91,84% ± 3,18% (n = 8) af neuroner inficeret (figur 1B).

For at visualisere TG-neuronerne, der inderverer vibrissalpuden, udviklede vi derefter en kirurgisk strategi for at udsætte TG in vivo. Ca. 60% af forhjernen kan fjernes uden at påvirke større åndedrætscentre. Dette svarer til hjernevæv rostral til Bregma -3,80. Figur 2 viser et skema over den eksponerede TG (venstre) og innerveringsområdet for infraorbitalnerven (ION, højre). Det område af TG, der gav anledning til innervering af vibrissalpuden, blev bestemt ved anvendelse af let mekanisk stimulering (børste) på vibrissalpuden under overvågning af ændringer i fluorescens ved 20x. Som forudsagt var V2-regionen i TG, som inderverer den maksillære opdeling af ansigtet, det eneste aktiverede område. Det vil sige, selvom det ikke blev undersøgt systematisk, var der ingen ændringer i fluorescens detekteret som reaktion på stimuli anvendt på V1 (hud på panden) eller V3 (hud på underkæben) regioner, når neuronerne under undersøgelse kunne aktiveres med stimuli påført vibrissalpuden. Ændringer i fluorescens ved baseline og som reaktion på stimuli påført vibrissalpuden blev derefter overvåget. Interesseområdet (V2) er afgrænset i figur 3A. I overensstemmelse med tidligere rapporter om relativt lave niveauer af hvileaktivitet i sensoriske neuroner34 var hvilefluorescens relativt lav i de fleste neuroner, og der var få tegn på spontane stigninger i fluorescens (figur 3B). Kriterierne, der bruges til at identificere stimulusfremkaldt aktivitet i neuroner i periferien 6,16,21 og CNS 12,35,36, er et udviklende felt med flere sofistikerede workflow-pakker, der er gjort frit tilgængelige37,38. En fuldstændig diskussion af styrker og svagheder ved de forskellige anvendte fremgangsmåder ligger uden for rammerne af nærværende manuskript. Da dette ikke var fokus for denne undersøgelse, brugte vi relativt vilkårlige og subjektive kriterier baseret på topresponset observeret i områder af ganglierne, hvor der ikke var nogen klart påviselige neuroner (baseret på evnen til at se kernen), således at en neuron blev betragtet som lydhør over for en stimulus, hvis stigningen i fluorescens var tidslåst til stimulusapplikationen (stigning i fluorescens detekteret inden for 1 s efter stimulusapplikation ( baseret på antagelsen om, at et aktionspotentiale initieret i de langsomst ledende axoner (0,2 m/s) initieret på et sted højst 3 cm fra cellelegemet skulle nå cellelegemet på mindre end et sekund) og var >6 gange standardafvigelsen for topresponsen (ΔF/F) detekteret et kontrolsted (figur 3C). Dernæst karakteriserede vi responsegenskaberne for disse neuroner til naturlige stimuli: børste, punkteret, varme og kulde. Eksempler på reaktioner på hver af disse stimuli er vist i figur 4. Især responsen på punktstimulering, som oftest bruges i smerterelaterede undersøgelser, har det mest robuste respons (figur 4B, F).

Vores mål med at udvikle denne teknik var at være i stand til at vurdere ændringer i populationskodning i TG-neuroner. Således tilpassede vi den kroniske indsnævringsskade til ION (CCI-ION), som tidligere ansat29, til at studere rotter 2 uger efter nerveskade. Efter induktionen af modellen eksponerede vi TG og vurderede hvile og fremkaldte aktivitet i TG ipsilateral og kontralateral til skadestedet. Interessant nok blev størrelsen af det topfremkaldte respons på børste øget ~ 2 gange på den nerveskadede side i forhold til topresponset på den samme stimulus anvendt på den kontralaterale side (figur 5A-C). Når to børstestimuli blev anvendt i serie (med et interstimulusinterval på 10 s), var der desuden en signifikant forstærkning af størrelsen af responsen på den anden stimulus på den skadede, men ikke uskadte side (figur 5D).

Endelig vurderede vi som et indledende kontroleksperiment for at bekræfte, at den stimulusfremkaldte stigning i fluorescens skyldtes handlingspotentialer initieret i periferien, virkningen af tetrodotoxin (1 μM) på stimulusfremkaldte reaktioner. TTX blev injiceret i et volumen på 200 μL perkutant som beskrevet tidligere28 for at målrette den infraorbitale nerve. Som vist i figur 6 blev fremkaldt aktivitet næsten fuldstændig elimineret. Samlet set viser disse resultater nytten af at bruge AAV9-GCaMP til at forhøre TG-populationsresponser in vivo.

Figure 1
Figur 1: Høj effektivitet af GCaMP6s-infektion i TG-neuroner med neonatal AAV-injektion. (A) P5 rotteunger blev injiceret med 5 μL pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (titer: 2,4 x 1014) virus intraperitonealt: GCaMP6s-ekspression blev påvist hos 51,7 ± 14,3% af TG-neuroner (n = 3 skiver pr. dyr, 7 rotter). (B) Øget injektionsvolumen til 15 μL hos yngre dyr (p2) forbedrede infektionseffektiviteten: GCaMP6s-ekspression blev påvist hos 91,8 ± 3,2% af TG-neuroner (n = 3 skiver pr. dyr, 8 rotter). Paneler til venstre blev farvet til GCaMP6'er. Paneler i midten blev farvet med NeuN, en neuronspecifik markør. Paneler til højre er et fusioneret billede af GCaMP6s- og NeuN-panelerne. Skalabjælken i det første panel er den samme for alle efterfølgende paneler. Grafen til højre er et plot af GCaMP6s-ekspression (gennemsnit ± SEM) som en procentdel af det samlede antal neuroner pr. skive pr. dyr, hvor de enkelte punkter er dataene for hvert dyr. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Placering af trigeminusganglion (TG), infraorbital nerve (ION) og område af ansigtet (vibrissal pad) stimuleret. (A) Forhjernen blev fjernet for at muliggøre adgang til TG. (B) Område af ansigtet, hvor naturlige stimuli blev påført i forhold til ION og TG. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Stimulus-fremkaldt stigning i GCaMP6s fluorescens. (A) Samlet synsfelt under 20x forstørrelse. Oftalmiske (V1) og maksillære (V2) divisioner af TG er angivet. (B,C) Området i kassen er vist i panelerne B og C, som er fluorescensbilleder før og efter børstestimulering af vibrissalpuden. Hvide cirkler er komparatorregioner af interesse. Neuroner blev betragtet som lydhøre over for en stimulus baseret på den maksimale ændring i fluorescens observeret i komparatorområder af interesse som beskrevet i teksten. Skalalinjen i det første panel er den samme for begge paneler. (D) Repræsentative ændringer i fluorescens af neuroner vist i B og C som reaktion på en børstestimulus påført ansigtet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Klassificering af neuroner baseret på deres respons på stimuli anvendt på ansigtet. Repræsentative billeder af TG-neuroner før (toppaneler - Baseline) og efter (midterpanel - stimulering) af reaktioner på en 1 cm kamelhårbørste (A - børste), 1 cm2 gitter monofilamenter (B - punkteret), opvarmning (C - varme) og afkøling (D - kold) påført det samme område af ansigtet. Skalabjælken i det første panel er den samme for alle efterfølgende paneler. Orange cirkler angiver et eksempel på en lydhør neuron. Hvide cirkler er komparatorregioner af interesse. (E-H) Repræsentative spor af hvert respons pr. stimulus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Nerveskade øger børstefremkaldte reaktioner i TG-neuroner. Typiske reaktioner fra TG-neuroner til børste påføres to gange på rottefladen på siden kontralateralt til en kronisk indsnævringsskade på den infraorbitale nerve (A, Contra) eller til siden ipsilateral til nerveskaden (B, Ipsi). (C) Analyse af poolede data fra responsive neuroner fra seks rotter (data plottet er pr. rotte) bekræftede, at forskellen i størrelsen af det første respons på børsten var signifikant (parret t-test). (D) Da topresponset på den første og anden stimulusapplikation blev analyseret som et forhold (R2/R1), bekræftede analysen af de samlede data, at stigningen i responsforholdet på den nerveskadede side var signifikant. ** p < 0,01 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Blok af fremkaldt aktivitet i TG-neuroner med tetrodotoxin (TTX). (A) Fluorescensdata fra TG-neuroner ipsilaterale til en nerveskade efter injektion af TTX (200 μL, 1 μM) ved siden af infraorbitalnerven efter påføring af en børstestimulus (blå bjælke). (B) Samlede peak response data fra tre rotter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her demonstrerer vi en hurtig, ikke-invasiv måde at generere en GECI-rotte til billeddannelse af TG. Vi valgte en CAG-promotor til at drive og opretholde høje niveauer af genekspression. Mens tidligere undersøgelser tyder på, at andre AAV-serotyper effektivt kan drive genekspression i DRG-neuroner39, er vores resultater i overensstemmelse med en nylig undersøgelse, der involverer intraperitoneal injektion af AAV hos nyfødte32, hvilket indikerer, at AAV9-serotypen er yderst effektiv til infektion af rotte neonatale sensoriske neuroner.

Gennem fejlfinding af denne teknik er det værd at bemærke nogle faldgruber, der kan forhindre optimal infektion. Den vigtigste variabel, du skal huske på, er hvalpenes alder. Rottens nervesystem udvikler sig hurtigt i løbet af de første 7 dage efter fødslen40. Vi forsøgte infektioner på senere tidspunkter (f.eks. P4-7), hvilket resulterede i variabel og dårlig effektivitet. Tidligere tidspunkter (p1-4) giver mere robust og ensartet effektivitet, hvor p1-2 producerer de højeste infektionsrater. Den anden variabel er injektionsvolumenet. Uanset alder kræves der mindst 15 μL for at producere mere end 70% effektivitet i TG eller DRG med en titer på 2,5 x 1014. Vi fandt, at selv ved p2 giver intraperitoneale injektioner på mindre end 10 μL meget lidt ekspression hos voksne. Det er muligt, at mere lokaliserede injektioner, dvs. direkte ind i det modtagelige interesseområde, ved lavere mængder ville producere lignende virkninger. Denne tilgang vil dog kræve, at hvalpe bedøves fuldt ud og kan forårsage traumer i vævet af interesse. Endelig er det muligt, at mindre volumener kan bruges med højere titere.

Eksponering af TG for GECI-billeddannelse er tidligere blevet udført i mus16. Oversættelsen af denne tilgang til rotten afslørede imidlertid flere problemer, der var værd at overveje. For det første er tykkelsen af kraniet og dura i rotten meget større end i en mus. Derfor kan fjernelse af kraniehætten udgøre udfordringer. Vi fandt ud af, at en lille boremaskine er en effektiv måde at perforere kraniehætten på, som derefter kan fjernes med rongeurs. Et andet problem er blødning, når hjernen er blevet fjernet. Dette kan være et fortsat problem for både præparatets levetid såvel som klarheden af billeddannelsen, hvis ikke neuronernes egenskaber. Gaze dyppet i iskold CSF kan påføres den udsatte overflade af hjernen for at hjælpe med at lukke hovedarterierne. Brugen af en lille cautery pen kan også være effektiv til at dæmme op for yderligere blødning. Endelig kan gelfoam placeret på den kontralaterale side af billeddannelsesvinduet også hjælpe med at forhindre blod og CSF i at forårsage billeddannelsesproblemer. En tredje overvejelse er mængden af hjerne, der skal fjernes. Vi fandt ud af, at fjernelse af hjernekaudal til ~ Bregma -3.80 vil resultere i død inden for en time efter fjernelse. Således skal hjernen fjernes i små sektioner og holde så meget som muligt, mens du udsætter så meget af TG som muligt.

Som nævnt i indledningen er [Ca2+]i et indirekte mål for neuronal aktivitet, og derfor betyder en stigning i [Ca2+]i ikke nødvendigvis, at der er en stigning i neural aktivitet. Således er kontroleksperimenter afgørende for at bekræfte, at det, der betragtes som fremkaldt aktivitet, faktisk er aktivitet i sig selv. For eksempel bør elektrisk fremkaldte stimuli producere en tidslåst stigning i [Ca2+]i, som er på samme skala som naturligt fremkaldte stimuli. Det er vigtigt, at denne aktivitet elimineres med nerveblokken (dvs. TTX). Det er dog også vigtigt at bemærke, at på trods af disse vigtige kontroller er det stadig muligt, at nogle af de tilsyneladende fremkaldte stigninger i [Ca2+]i skyldes signalering inden for ganglierne, for eksempel på grund af senderfrigivelse inden for ganglierne41, snarere end på grund af et handlingspotentiale initieret i periferien, der har invaderet cellesomaen.

Mens vores resultater bekræfter, at af tidligere forskere 16,42,43, der indikerer signal-støj-forholdet forbundet med ændringer i GCaMP-fluorescens i sensorisk somata, er tilstrækkeligt til brug med et standard epifluorescensmikroskop, kan manipulationer som nerveskaden, der anvendes i denne undersøgelse, være forbundet med sådanne dramatiske ændringer i neuronal aktivitet og Ca 2+ signalering34, at reaktioner i ganglierne kan være forbundet med en så stor stigning i tilsyneladende baggrund, at responserne fra individuelle neuroner kan svækkes kunstigt. Mens billedbehandlingsmetoder er blevet udviklet, der kan hjælpe med at løse denne begrænsning44, kan konfokal eller multifotonbilleddannelse være nødvendig for mest effektivt at løse dette problem.

Samlet set giver denne teknik en tilgang til undersøgelse af stimulus-respons-egenskaberne af TG-neuroner hos rotter på befolkningsniveau. Vores resultater med CCI af ION bekræfter muligheden for at detektere ændringer i disse stimulus-respons egenskaber. Mens kun mekaniske og termiske stimuli blev anvendt i denne undersøgelse, bør dette præparat være egnet til anvendelse af kemiske stimuli for fuldt ud at definere stimulus-responsegenskaberne af TG-neuroner. Tilsvarende, mens vi fokuserede på stimulus-responsegenskaber hos kutane afferenter, på grund af fremkomsten af sådanne fænomener som dynamisk mekanisk allodyni efter traumatisk skade på en kutan nerve, bør det også være muligt at opdage ændringer i egenskaberne hos afferenter, der inderverer andre kraniofaciale strukturer såsom det temporomandibulære led (som reaktion på uskadelige vs. skadelige kæbebevægelser), hornhinde eller tunge. Perifer injektion af AAV9-serotypen muliggør neuronspecifik induktion af GCaMP, der er PNS-specifik. En stor fordel ved denne strategi er, at viral mærkning giver et robust, vedvarende udtryk i postmitotiske celler (dvs. neuroner), men ikke i mitotiske celler (f.eks. Epitelceller). Derudover indikerer foreløbig screening af forskellige PNS-væv, at denne virale strategi også kan bruges til at undersøge para / sympatiske ganglier, DRG og enteriske nervesystemer (data ikke vist).

Dette in vivo-præparat giver også grundlaget for at udforske mange sammenligninger, der mangler i den nuværende litteratur. In vivo populationsundersøgelser mellem rotter TG og DRG, rotte vs. mus TG, er endnu ikke udført. De data, der præsenteres her, illustrerer den nye gennemførlighed af disse vigtige eksperimenter, der skal udføres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Gold modtog tilskud fra Grunenthal under udviklingen af dette præparat. Der var ingen overlapning i fokus for Grunenthal-studiet og forberedelsen beskrevet i dette manuskript. Ingen af de andre forfattere har andre potentielle interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dr. Kathy Albers og Brian Davis for brugen af deres Leica Microscope and Metamorph-program, Charles Warwick for at hjælpe med at bygge vores termiske Peltier-enhed og Dr. Raymond Sekula for at hjælpe med fejlfinding af den kirurgiske forberedelse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) og R01NS122784 (MSG og RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Tags

Neurovidenskab udgave 204
<em>In-vivo</em> Calciumbilleddannelse af sensoriske neuroner i rotte trigeminusganglion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter