Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECI) מאפשרים ניתוח חזק ברמת האוכלוסייה של איתות נוירונים חושי. כאן, פיתחנו גישה חדשנית המאפשרת הדמיית GECI in vivo של פעילות גרעיני גרעינים של חולדות.

Abstract

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs) מאפשרים טכניקות הדמיה לניטור שינויים בסידן תוך-תאי באוכלוסיות תאים ממוקדות. יחס האות לרעש הגדול שלהם הופך את GECIs לכלי רב עוצמה לזיהוי פעילות מעוררת גירוי בנוירונים חושיים. GECIs מאפשרים ניתוח ברמת האוכלוסייה של גירוי המקודד למספר הנוירונים שניתן לחקור בו זמנית. קידוד אוכלוסייה זה נעשה בצורה המתאימה ביותר in vivo. גרעיני שורש דורסלי (DRG), המאכלסים את הסומה של נוירונים חושיים המעצבבים מבנים סומטיים וקרביים מתחת לצוואר, נמצאים בשימוש נרחב ביותר עבור דימות in vivo מכיוון שמבנים אלה נגישים בקלות יחסית. לאחרונה, טכניקה זו שימשה בעכברים לחקר נוירונים חושיים בגנגליון הטריגמינלי (TG) המעצבב מבנים אוראליים וגולגולתיים. ישנן סיבות רבות לחקור TG בנוסף ל- DRG, כולל רשימה ארוכה של תסמונות כאב ספציפיות למבני הפה והגולגולת שנראה כי הן משקפות שינויים בפעילות הנוירונים התחושתיים, כגון trigeminal neuralgia. עכברים נמצאים בשימוש נרחב ביותר במחקר של נוירונים DRG ו- TG בגלל הזמינות של כלים גנטיים. עם זאת, עם הבדלים בגודל, קלות הטיפול והבדלי מינים שעשויים להיות חשובים, יש סיבות לחקור נוירונים TG של חולדות ולא עכברים. לכן, פיתחנו גישה להדמיית תאי עצב TG של חולדות in vivo. הזרקנו לגורים ילודים (p2) תוך צפקית AAV המקודד GCaMP6s, וכתוצאה מכך נגרם זיהום של >90% הן בתאי עצב TG והן בתאי עצב DRG. TG הודגמה במבוגר לאחר קרניוטומיה ודקורציה, ושינויים בפלואורסצנטיות GCaMP6s נוטרו בנוירונים TG בעקבות גירוי של אזורים מנדיבולריים ומקסילריים של הפנים. אישרנו כי עליות פלואורסצנטיות היו מעוררות גירוי עם בלוק עצבי היקפי. בעוד שלגישה זו יש שימושים פוטנציאליים רבים, אנו משתמשים בה כדי לאפיין את תת-האוכלוסיות של נוירוני TG שהשתנו בעקבות פגיעה עצבית היקפית.

Introduction

Somatosensation, הקידוד העצבי של גירויים מכניים, תרמיים וכימיים הפוגעים בעור או במבנים גופניים אחרים, כולל שרירים, עצמות וקרביים, מתחיל בפעילות בתאי עצב ראשוניים המעצבבים מבנים אלה1. גישות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות יחידה אחת סיפקו שפע של מידע על תת-הסוגים המשפיעים המעורבים בתהליך זה, כמו גם כיצד תכונות הגירוי-תגובות שלהם עשויות להשתנות עם הזמן 1,2,3. עם זאת, בעוד שנותרו ראיות חזקות התומכות בתיאוריית הקו המסומן, אשר מציעה כי שיטות חושיות ספציפיות מועברות על-ידי תת-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים, היכולת של תת-אוכלוסיות רבות של תאי עצב להגיב לאותם סוגים של גירויים מכניים, תרמיים וכימיים מצביעה על כך שרוב הגירויים הסומטוסנסוריים מקודדים על-ידי תת-אוכלוסיות מרובות של תאי עצב4, 5. לכן, הבנה טובה יותר של somatosensation תגיע רק עם היכולת לחקור את הפעילות של 10, אם לא מאות, של נוירונים בו זמנית.

ההתקדמות בגישות אופטיות עם הופעתן לאחרונה יחסית של טכניקות הדמיה קונפוקליות, ולאחר מכן, מולטיפוטונים ודיגיטליים אפשרו את היכולת לבצע ניתוחים לא פולשניים יחסית ברמת האוכלוסייה של פעילות עצבית 6,7. אחד המכשולים האחרונים ביישום טכנולוגיה זו היה פיתוח כלים המאפשרים הערכה אופטית של פעילות עצבית. בהתחשב במהירות של פוטנציאל פעולה שיכול להתחיל ולהסתיים בפחות מאלפית השנייה, צבע רגיש למתח עם היכולת לעקוב אחר שינויים בפוטנציאל הממברנה במהירות של פוטנציאל פעולה יהיה הכלי האידיאלי למטרה זו. אולם בעוד שחלה התקדמות עצומה בתחום זה 7,8,9,10, יחס האות לרעש עבור רבים מהצבעים האלה עדיין אינו גבוה מספיק כדי לאפשר ניתוח אוכלוסייה של מאות תאי עצב ברמת התא הבודד. כגישה חלופית, החוקרים פנו לניטור שינויים בריכוז Ca2+ תוך תאי ([Ca2+]i). המגבלות באסטרטגיה זו היו ברורות מלכתחילה וכוללות את העובדה שעלייה ב-[Ca2+]i היא מדד עקיף לפעילות עצבית11; שעלייה ב-[Ca2+]i עשויה להתרחש ללא תלות בזרם Ca2+ הקשור להפעלת ערוצי Ca2+ מגודרים במתח (VGCCs)12,13; שהגודל ומשך הזמן של ארעי Ca2+ ניתנים לשליטה על ידי תהליכים שאינם תלויים בפעילות VGCC 11,12,14; וכי מהלך הזמן של Ca2+ transients עולה בהרבה על זה של פוטנציאל פעולה15. עם זאת, ישנם מספר יתרונות משמעותיים הקשורים לשימוש Ca2+ כמדד עקיף של פעילות עצבית. לא פחות מהם הוא יחס האות לרעש הקשור לרוב מחווני Ca2+, המשקף הן את גודל השינוי ב- Ca2+ תוך תאי והן את העובדה שהאות נובע מהמרחב התלת-ממדי של הציטוזול ולא מהמרחב הדו-ממדי של קרום התא. יתר על כן, עם הפיתוח של אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECI's), ניתן לנצל אסטרטגיות גנטיות כדי להניע את הביטוי של אינדיקטורים Ca2+ בתת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים, להקל על ניתוח ברמת האוכלוסייה בהכנות שלמות (למשל, ראה16).

בהתחשב במספר הכלים הגנטיים הזמינים כיום בעכברים, אין זה מפתיע ש- GECI נמצא בשימוש נרחב ביותר במין זה. קווי עכבר עם ביטוי GECI מכונן בתת-אוכלוסיות של נוירונים חושיים פותחו 7,16,17. עם התפתחות קווי עכבר המבטאים רקומבינאזות בסוגי תאים ספציפיים, ניתן להשתמש באסטרטגיות מתוחכמות עוד יותר כדי לשלוט בביטוי GECI15. עם זאת, בעוד שהכלים האלה חזקים יותר מאי פעם, ישנן מספר סיבות לכך שמינים אחרים, כמו חולדות, עשויים להתאים יותר לשאלות ניסוייות מסוימות. אלה כוללים את הגודל הגדול יותר, המאפשר מספר מניפולציות ניסיוניות שקשות, אם לא בלתי אפשריות, בעכבר הקטן יותר; קלות אילוף חולדות במשימות התנהגותיות מורכבות יחסית; ולפחות כמה ראיות לכך שתכונות ביופיזיות ודפוסי ביטוי של כמה תעלות יונים בנוירונים חושיים של חולדות עשויים להיות דומים יותר לאלה שנצפו בנוירונים חושיים אנושיים מאשר אותם ערוצים בעכבר ביחס לבני אדם18.

בעוד שהטרנסדוקציה של גירויים סומטוסנסוריים מתרחשת בדרך כלל במסופים ההיקפיים של האפרנטים הראשוניים, פוטנציאל הפעולה המתחיל בפריפריה חייב לעבור דרך המבנה המאכלס סומאטה אפרנטית ראשונית, המכונה גרעיני שורש גבי (DRG) או טריגמינל (TG) לפני שהוא מגיע למערכת העצבים המרכזית19. בעוד שישנן ראיות לכך שלא כל פוטנציאל פעולה המתפשט לאורך אקסון אפירנט ראשוני יפלוש לגוף התא20, תוצאה של העובדה שהסומטה האפרנטית הראשונית מחוברת לאקסון האמפרנט הראשי דרך צומת T19, נראה שרוב פוטנציאלי הפעולה המופעלים בפריפריה פולשים לסומה21. זה מעניק שלושה יתרונות ניסיוניים בעת שימוש ב- GECIs כדי להעריך קידוד אוכלוסייה ב- afferents ראשוניים: הגודל הגדול של גוף התא ביחס לאקסונים מגדיל עוד יותר את האות לרעש בעת שימוש ב- [Ca2+]i כמדד עקיף לפעילות afferent; DRG הם בדרך כלל קל לגישה; והערכת הפעילות באתר המרוחק מרחבית מהטרמינלים האפרנטיים ממזערת את ההשפעה הפוטנציאלית של הניתוח הדרוש לחשיפת הגרעינים על תכונות הגירוי-תגובה של הטרמינלים האפרנטיים. עם זאת, מאחר שTG ממוקמים מתחת למוח (או מעל לוח הצבעים), הם הרבה יותר קשים לגישה מאשר DRG. יתר על כן, בעוד שיש קווי דמיון רבים בין נוירונים DRG ונוירונים TG, יש רשימה הולכת וגדלה של הבדלים גם כן. זה כולל את הארגון הסומטוטופי בערך של תאי עצב ב- TG22, מבנים ייחודיים עצביים, דפוסי סיום מסוף מרכזי שונים 23,24,25,26, וכעת רשימה הולכת וגדלה של הבדלים הן בביטוי גנים 27,28 והן בביטוי קולטן פונקציונלי29. בנוסף, מכיוון שאנו מתעניינים בזיהוי מנגנונים היקפיים של כאב, המספר הגדול יחסית של תסמונות כאב שנראות ייחודיות למערכת הטריגמינלית (למשל, מיגרנה, נוירלגיה טריגמינלית, תסמונת הפה השורף) שנראות כמערבות פעילות חריגה בגורמים ראשוניים 30,31,32, מצביע על כך שיש לחקור את TG ישירות.

לכן, בעוד תכונות גירוי-תגובה של נוירונים TG נחקרו עם GECIs בעכבר16, מאחר שהסיבות המפורטות לעיל מצביעות על כך שהחולדה עשויה להיות מין מתאים יותר לענות על מגוון שאלות ניסוייות, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח גישה לשימוש ב-GECIs לחקר נוירוני TG בחולדה. כדי להשיג זאת, השתמשנו בגישה ויראלית כדי להניע את הביטוי של GECI GCaMP6s במערכת העצבים ההיקפית. לאחר מכן הסרנו את המוח הקדמי כדי לאפשר גישה ל-TG. לבסוף, גירויים מכניים ותרמיים הוחלו על הפנים בעוד תגובות עצביות הוערכו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יחד, נתונים אלה תומכים בתפקיד של ניצול החולדה לחקר שינויים בTG במצבים רבים, ומרחיבים את ארגז הכלים לחוקרים המעוניינים בקידוד חושי במערכת הטריגמינלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים במחקר בוצעו בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות והאגודה הבינלאומית לחקר הכאב ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג (פרוטוקול #22051100). בסוף כל ניסוי, חולדות הומתו באמצעות הרדמה עם זילוח לב של מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS), גישה שאושרה על ידי האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית ואוניברסיטת פיטסבורג IACUC.

1. אינדוקציה GCaMP

  1. הזמינו חולדות Sprague Dawley בהריון בזמן כדי שניתן יהיה להזריק גורים בזמן המתאים לאחר ההמלטה.
  2. רססו את הכפפות ב-70% EtOH לפני הטיפול בכל גור חולדה. זה ירתיע את הסכר מקניבליזציה של הצעירים.
  3. גורים של חולדות מטושות (P1-2) עם 70% EtOH ומרדימים על קרח למשך 3 דקות.
  4. יש להזריק 15 μL של AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) תוך צפקית באמצעות מזרק המילטון סטרילי אטום לגז בגודל 25 μL.

2. ניתוח חשיפה לגנגליון טריגמינלי

  1. יש לתת קוקטייל הרדמה (55 מ"ג/ק"ג קטמין, 5.5 מ"ג/ק"ג קסילזין, 1 מ"ג/ק"ג אצפרומזין) תוך צפקית על בסיס משקל הגוף לחולדות בנות 6-8 שבועות (כ-150-200 גרם).
    הערה: זה בדרך כלל מספיק כדי לשמור על מישור כירורגי של הרדמה כפי שמוערך על ידי היעדר רפלקס נסיגה לצביטה מזיקה של כף אחורית. עם זאת, להשלים עם isoflurane דרך חרוט האף אם החיות הופכות לאור.
  2. לאחר הרדמה מלאה, לגלח את השיער ואת שפם הראש והפנים.
  3. הרכיבו את החולדה על מסגרת סטריאוטקסית עם מוטות אוזניים והניחו כרית חימום (~ 37 oC) מתחתיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
  4. עקוב אחר סימנים חיוניים (קצב לב, קצב נשימה, רוויית חמצן בדם) באמצעות מד חמצן עכברי או דומה.
    הערה: טמפרטורת הגוף מנוטרת על ידי בדיקה רקטלית ומתוחזקת על ידי הנחת חולדות על שמיכת מים במחזור מבוקרת משוב.
  5. מניחים גזה טבולה במי מלח קרים כקרח על הראש כדי לכווץ את כלי הדם כדי למזער דימום. בעזרת אזמל בגודל 15, יש לבצע חתך בקו האמצע של העור והשריר מעל הגולגולת.
  6. השתמש בדיסקציה קהה של העור והשריר כדי לחשוף את הגולגולת.
  7. בעזרת מקדח עגול של 1/4, נקבו בזהירות את כובע הגולגולת כדי לחשוף את המוח הקדמי. לאחר מכן, השתמש rongeurs (2.5 מ"מ) כדי לחתוך בזהירות דרך הגולגולת.
  8. בעזרת אזמל בגודל 15 מבצעים חתך במוח (ברגמה: 3.80-) ובפקעת הריח.
    הערה: חיתוך זהיר יותר מעבר לנקודה זו יגרום למוות של חולדות
  9. השתמש במרית כדי לנתק בזהירות את הדורה מהגולגולת והרים בעדינות את המוח הכרות כדי לחשוף את TG ואת בסיס הגולגולת.
    הערה: שימוש נוסף בזילוח מי מלח קרים כקרח לאורך כל המיצוי ימזער דימום וימטב את שדה הדיסקציה הבא.
  10. באמצעות עט צריבה, לעצור כל דימום כתוצאה מהשאיבה.
    הערה: חיתוך הדורה יגרום לדימום בלתי נמנע. עדיף להכין aCSF קר כקרח (119 mM NaCl, 26.2 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1.3 mM MgCl2, 10 mM גלוקוז, 2.5 mM CaCl2) כדי לרחוץ את חלל הגולגולת כדי לעזור לכווץ את כלי הדם תוך שמירה על בריאות עצבית.

3. הדמיה GCaMP6s

הערה: בהתחשב בגודל ובצפיפות של נוירונים אלה, מערכת ההדמיה ורכישת הנתונים המשמשת (אובייקטיבית, מיקרוסקופ, מקור אור, מצלמה) תקבע את מספר תאי GECI+ המוצגים באופן חזותי. מקור האור, המטרה והמצלמה יקבעו גם את הפרמטרים המשמשים לרכישת תמונה, כולל זמן חשיפה וקצב לכידת תמונה. בעוד שניתן להשתמש בטכניקות מולטיפוטון וקונפוקליות בהתאם לפרמטרים של הניסוי, מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עשוי להספיק כדי לפתור תאים רבים. ניתן להשתמש בכל חבילת רכישת תמונות. באופן אידיאלי, יישום הגירוי נעול בזמן עם חבילת התוכנה לרכישת תמונות.

  1. מקמו את חלל הגולגולת מתחת למטרה והביאו את TG למיקוד באמצעות אור נראה.
  2. אורך גל העירור של GCaMP6s הוא 496 ננומטר, ואורך גל הפליטה שלו הוא 513 ננומטר; לכן, השתמש בקוביות הדיכרואיות והסינון המתאימות כדי לאתר תאי GCaMP+ . התאימו את המיקוד כדי לאתר ולפתור את אזור הגרעינים שבו תאי עצב מגיבים לגירויים המופעלים על שדה הקלט של העניין.
  3. השתמש במטרה של 10x כדי לאפשר הדמיות של רוב תאי העצב בTG המגיבים לגירויים מכניים המופעלים על אזור 1 ס"מ2 של הפנים16. השתמש במטרה יבשה פי 20 עם מרחק עבודה ארוך (10.8 מ"מ) כדי להגדיל את הרזולוציה.
  4. השתמש בתוכנת רכישה (למשל, Metamorph) כדי לאסוף נתונים פלואורסצנטיים לאורך זמן ובתגובה ליישום גירוי.
    1. כדי למזער את הלבנת האור של הנוירונים, השתמש בזמן חשיפה קצר ככל האפשר כדי לזהות את קו הבסיס ואת העלייה המעוררת פלואורסצנטיות. עם מטרת אוויר של 20x, 0.40 NA, מקור אור כספית הליד של 120 ואט ומצלמת מוליכים למחצה משלימה של תחמוצת מתכת (CMOS) ששימשה במחקר הנוכחי, זמן חשיפה של 300 אלפיות השנייה, וקצב קליטת תמונה של 3 הרץ, משיגים הקלטות בסיסיות יציבות במשך >90 דקות.
      הערה: 1) פרמטרים אלה של רכישת תמונה חייבים להיקבע באופן אמפירי. 2) מכני (מברשת, ניקוב, רטט, צביטה), תרמי (חום וקור), וכימי (קפסאיצין, מנטול, מתווכי דלקת) ניתן ליישם על שדה הקלט. גישה סובייקטיבית זולה יחסית היא ליישם את הגירויים ביד. עם זאת, מומלץ להשתמש בגישות אובייקטיביות וניתנות לשחזור יותר, שבהן ניתן להשתמש במפעילים מבוקרי משוב ליישום חוזר ונשנה בכוח ידוע. בעוד שהתקני פלטייה מבוקרי משוב שימושיים לחימום וקירור מבוקרים, הם אינם אידיאליים לגירוי תרמי של פנים מעוקלות. מקורות אור אינפרא אדום מבוקרי משוב הם חלופה לחימום, וספריי קר הוא חלופה פחות מאידיאלית לקירור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מאחר שבעבר הייתה לנו הצלחה עם סרוטיפ AAV9 לזיהום של נוירונים חושיים15 של חולדות, השתמשנו בסרוטיפ הזה לביטוי של GCaMP6s בתאי עצב TG של חולדות. לכן ביקשנו תחילה להעריך את יעילות הזיהום של תאי עצב חושיים של AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) כאשר הנגיף הזה ניתן לגורי חולדות בילודים20. וירוס זה משתמש במקדם CAG, המניע ושומר על רמות גבוהות של ביטוי גנים. יתר על כן, AAV9 הוכח כמדביק ביעילות נוירונים חושיים כאשר הוא ניתן לחולדות יילודים33. הזריקות הראשונות השתמשו ב-5 μL בגורי יום 5 (p5) לאחר הלידה, והתוצאה הייתה יעילות של כ-51.66% ±-14.33% (איור 1A). כדי להגביר את קצב ההדבקה, בסופו של דבר השתמשנו בנפח גדול יותר של וירוס (15 μL) בחולדות צעירות יותר (p2), ושמרנו על טיטר הנגיף של 2.4 x10 14 זהה. אסטרטגיה זו הביאה לכך ש-91.84% ±-3.18% (n = 8) מתאי העצב שנדבקו (איור 1B).

כדי לדמיין את תאי העצב של TG המעצבבים את כרית הוויברסל, פיתחנו אסטרטגיה כירורגית לחשיפת TG in-vivo. כ-60% מהמוח הקדמי ניתן להסרה מבלי להשפיע על מרכזי הנשימה העיקריים. זה מתאים לרקמת המוח רוסטרל לברגמה -3.80. סכמה של TG החשוף (משמאל) ושל טריטוריית העצבוב של העצב האינפרא-אורביטלי (ION, מימין) מוצגים באיור 2. האזור של TG המעורר את העצבוב של כרית הוויבריסל נקבע עם יישום של גירוי מכני קל (מברשת) על כרית הוויבריסל תוך ניטור שינויים פלואורסצנטיים פי 20. כצפוי, אזור V2 של TG, אשר מעצבב את החלוקה המקסימלית של הפנים, היה האזור היחיד שהופעל. כלומר, בעוד שלא נחקר באופן שיטתי, לא היו שינויים פלואורסצנטיים שזוהו בתגובה לגירויים שהופעלו על אזורי V1 (עור על המצח) או V3 (עור על הלסת התחתונה) כאשר הנוירונים הנחקרים יכלו להיות מופעלים עם גירויים שהוחלו על כרית הוויברסל. לאחר מכן בוצע מעקב אחר שינויים בפלואורסצנטיות בנקודת ההתחלה ובתגובה לגירויים שהופעלו על כרית הוויברסל. אזור העניין (V2) מסומן באיור 3A. בהתאם לדיווחים קודמים על רמות נמוכות יחסית של פעילות במנוחה בתאי עצב חושיים34, פלואורסצנטיות במנוחה הייתה נמוכה יחסית ברוב תאי העצב, ולא היו עדויות רבות לעלייה ספונטנית בפלואורסצנטיות (איור 3B). הקריטריונים המשמשים לזיהוי פעילות מעוררת גירוי בנוירונים בפריפריה 6,16,21 ובמערכת העצבים המרכזית 12,35,36 הוא תחום מתפתח עם מספר חבילות זרימת עבודה מתוחכמות שהפכו לזמינות באופן חופשי37,38. דיון מלא בחוזקות ובחולשות של הגישות השונות חורג מתחום כתב היד הנוכחי. מכיוון שזה לא היה מוקד המחקר הנוכחי, השתמשנו בקריטריונים שרירותיים וסובייקטיביים יחסית המבוססים על תגובת השיא שנצפתה באזורים של הגרעינים שבהם לא היו נוירונים הניתנים לזיהוי בבירור (בהתבסס על היכולת לראות את הגרעין), כך שתא עצב נחשב מגיב לגירוי אם העלייה בפלואורסצנטיות הייתה נעולה בזמן ליישום הגירוי (עלייה בפלואורסצנטיות זוהתה תוך שנייה אחת מיישום הגירוי ( בהתבסס על ההנחה שפוטנציאל פעולה שהתחיל באקסונים המוליכים האיטיים ביותר (0.2 מטר לשנייה) שהתחיל באתר במרחק של לא יותר מ-3 ס"מ מגוף התא אמור להגיע לגוף התא תוך פחות משנייה), והיה פי >פי 6 מסטיית התקן של תגובת השיא (ΔF/F) שזוהתה באתר בקרה (איור 3C). לאחר מכן, אפיינו את תכונות התגובה של תאי העצב האלה לגירויים טבעיים: מברשת, ניקוב, חום וקור. דוגמאות לתגובות לכל אחד מהגירויים האלה מוצגות באיור 4. יש לציין כי התגובה לגירוי ניקוב, אשר משמשת לרוב במחקרים הקשורים לכאב, היא בעלת התגובה החזקה ביותר (איור 4B,F).

מטרתנו בפיתוח טכניקה זו הייתה להיות מסוגלים להעריך שינויים בקידוד האוכלוסייה בנוירונים TG. לפיכך, התאמנו את פגיעת ההתכווצות הכרונית ל-ION (CCI-ION), כפי שהועסק בעבר29, כדי לחקור חולדות שבועיים לאחר פגיעה עצבית. בעקבות השראת המודל, חשפנו את ה-TG והערכנו מנוחה ופעילות מעוררת ב-TG ipsilateral וcontralateral לאתר הפגיעה. באופן מעניין, עוצמת התגובה המעוררת למברשת גדלה ~פי 2 בצד הפגוע עצבית ביחס לתגובת השיא לאותו גירוי שהופעל על הצד הנגדי (איור 5A-C). יתר על כן, כאשר שני גירויי מברשת יושמו בסדרות (עם מרווח גירוי פנימי של 10 שניות), הייתה הגברה משמעותית של עוצמת התגובה לגירוי השני בצד הפגוע אך לא הפצוע (איור 5D).

לבסוף, כניסוי בקרה ראשוני כדי לאשר שהעלייה בפלואורסצנטיות המעוררת גירוי נבעה מפוטנציאלי פעולה שיזמנו בפריפריה, הערכנו את ההשפעה של טטרודוטוקסין (1 מיקרומטר) על תגובות מעוררות גירוי. TTX הוזרק בנפח של 200 μL באופן מלעורי כפי שתואר קודם לכן28 כדי לכוון לעצב האינפרא-אורביטלי. כפי שניתן לראות באיור 6, הפעילות המעוררת חוסלה כמעט לחלוטין. יחד, תוצאות אלה מדגימות את התועלת של שימוש ב- AAV9-GCaMP כדי לחקור תגובות אוכלוסיית TG in vivo.

Figure 1
איור 1: יעילות גבוהה של זיהום GCaMP6s בתאי עצב TG עם הזרקת AAV בילוד. (A) לגורי חולדות P5 הוזרקו 5 μL של נגיף pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (titer: 2.4 x10 14) תוך צפקית: ביטוי GCaMP6s זוהה ב-51.7 ±-14.3% מתאי העצב TG (n = 3 פרוסות לכל חיה, 7 חולדות). (B) הגדלת נפח ההזרקה ל-15 μL בחיות צעירות יותר (p2) שיפרה את יעילות הזיהום: ביטוי GCaMP6s זוהה ב-91.8 ±-3.2% מתאי העצב TG (n = 3 פרוסות לכל חיה, 8 חולדות). לוחות בצד שמאל היו מוכתמים עבור GCaMP6s. לוחות באמצע היו מוכתמים עם NeuN, סמן ספציפי לנוירון. פאנלים מימין הם תמונה ממוזגת של לוחות GCaMP6s ו- NeuN. סרגל קנה המידה בחלונית הראשונה זהה לכל החלוניות הבאות. הגרף מימין הוא תרשים של ביטוי GCaMP6s (ממוצע ± SEM) כאחוז מכלל תאי העצב לפרוסה לכל חיה, כאשר הנקודות הבודדות הן הנתונים עבור כל חיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מיקום של גנגליון טריגמינלי (TG), עצב אינפרא-אורביטלי (ION) ואזור הפנים (כרית ויבריסלית) מגורים. (A) המוח הקדמי הוסר כדי לאפשר גישה ל-TG. (B) אזור הפנים שבו הופעלו גירויים טבעיים ביחס ל-ION ול-TG. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עלייה המעוררת גירוי בפלואורסצנטיות GCaMP6s. (A) שדה ראייה כולל מתחת להגדלה של פי 20. חלוקות עיניים (V1) ומקסילרי (V2) של TG מסומנים. (ב,ג) האזור בתיבה מוצג בלוחות B ו-C, שהם תמונות פלואורסצנטיות לפני ואחרי גירוי המברשת של כרית הוויברסל, בהתאמה. עיגולים לבנים הם אזורי עניין השוואתיים. תאי עצב נחשבו כמגיבים לגירוי בהתבסס על שיא השינוי בפלואורסצנטיות שנצפה באזורי עניין משווים כפי שמתואר בטקסט. סרגל קנה המידה בחלונית הראשונה זהה בשתי החלוניות. (D) שינויים מייצגים בפלואורסצנטיות של תאי עצב המוצגים ב-B וב-C בתגובה לגירוי מברשת שהופעל על הפנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: סיווג תאי עצב בהתבסס על תגובתם לגירויים המופעלים על הפנים. תמונות מייצגות של נוירוני TG לפני (פאנלים עליונים - בסיסי) ואחרי (פאנל אמצעי - גירוי) של תגובות למברשת שיער גמל בגודל 1 ס"מ (A - מברשת), 1 ס"מ2 רשת של מונופילמנטים (B - ניקוב), חימום (C - חום) וקירור (D - קר) המופעלים על אותו אזור בפנים. סרגל קנה המידה בחלונית הראשונה זהה לכל החלוניות הבאות. עיגולים כתומים מציינים דוגמה לתא עצב מגיב. עיגולים לבנים הם אזורי עניין השוואתיים. (ה-ה) עקבות מייצגים של כל תגובה לכל גירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: פגיעה עצבית מגבירה תגובות מעוררות מברשת בתאי עצב TG. תגובות אופייניות של נוירוני TG למברשת נמרחו פעמיים על פני החולדה בצד הנגדי לפגיעה כרונית בהתכווצות של העצב האינפרא-אורביטלי (A, Contra) או בצד האיפסילטרלי לפגיעה העצבית (B, Ipsi). (C) ניתוח של נתונים שנאספו מתאי עצב מגיבים משש חולדות (הנתונים ששורטטו הם לכל חולדה) אישר שההבדל בגודל התגובה הראשונה למברשת היה משמעותי (מבחן t זוגי). (D) כאשר תגובת השיא ליישום הגירוי הראשון והשני נותחה כיחס (R2/R1), ניתוח הנתונים המצטברים אישר כי העלייה ביחס התגובה בצד הפגוע עצבית, הייתה משמעותית. ** עמ' < 0.01 לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: בלוק של פעילות מעוררת בתאי עצב TG עם טטרודוטוקסין (TTX). (A) נתוני פלואורסצנטיות מנוירוני TG איפסילטרליים לפגיעה עצבית בעקבות הזרקה של TTX (200 μL, 1 μM) בסמוך לעצב האינפרא-אורביטלי בעקבות הפעלת גירוי מברשת (פס כחול). (B) איסוף נתוני תגובת שיא משלוש חולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מדגימים דרך מהירה ולא פולשנית ליצירת חולדת GECI לצורך הדמיה של TG. בחרנו בפרומוטור CAG כדי להניע ולשמור על רמות גבוהות של ביטוי גנים. בעוד שמחקרים קודמים מצביעים על כך שסרוטיפים אחרים של AAV עשויים להניע ביעילות ביטוי גנים בנוירוני DRG39, התוצאות שלנו עולות בקנה אחד עם מחקר שנערך לאחרונה שכלל הזרקה תוך צפקית של AAV בילודים32, מה שמצביע על כך שסרוטיפ AAV9 יעיל מאוד בזיהום של נוירונים חושיים בילודים של חולדות.

באמצעות פתרון בעיות בטכניקה זו, ראוי לציין כמה מלכודות שעשויות למנוע זיהום אופטימלי. המשתנה העיקרי שיש לזכור הוא גיל הגורים. מערכת העצבים של החולדה מתפתחת במהירות במהלך 7 הימים הראשונים לאחר הלידה40. ניסינו זיהומים בנקודות זמן מאוחרות יותר (למשל, עמ' 4-7), מה שהביא ליעילות משתנה וירודה. נקודות זמן מוקדמות יותר (p1-4) מייצרות יעילות חזקה ועקבית יותר, כאשר p1-2 מייצר את שיעורי ההדבקה הגבוהים ביותר. המשתנה השני הוא נפח ההזרקה. ללא קשר לגיל, מינימום של 15 μL נדרש לייצר יעילות של יותר מ -70% ב- TG או DRG עם טיטר של 2.5 x 1014. מצאנו שאפילו ב-p2, זריקות תוך-פריטוניאליות של פחות מ-10 מיקרוליטר מייצרות מעט מאוד ביטוי אצל מבוגר. ייתכן שזריקות מקומיות יותר, כלומר ישירות לשדה הקולט, בהיקפים נמוכים יותר ייצרו השפעות דומות. עם זאת, גישה זו תדרוש מהגורים להיות מורדמים באופן מלא ועלולה לגרום טראומה לרקמה המעניינת. לבסוף, ייתכן שניתן להשתמש בנפחים קטנים יותר עם טיטרים גבוהים יותר.

חשיפת TG להדמיית GECI בוצעה בעבר בעכברים16. עם זאת, תרגום גישה זו לחולדה גילה כמה נושאים שכדאי לקחת בחשבון. ראשית, עובי הגולגולת והדורה בחולדה גדול בהרבה מאשר בעכבר. לכן, הסרת כובע הגולגולת עלולה להציב אתגרים. מצאנו כי מקדחה קטנה היא דרך יעילה לנקב את כובע הגולגולת, אשר לאחר מכן ניתן להסיר עם רונגורים. בעיה שנייה היא דימום לאחר הסרת המוח. זה עשוי להיות נושא מתמשך הן עבור תוחלת החיים של התכשיר כמו גם את בהירות ההדמיה, אם לא את התכונות של הנוירונים. גזה טבולה ב- CSF קר כקרח יכולה להיות מיושמת על פני השטח החשופים של המוח כדי לעזור לסגור את העורקים הראשיים. השימוש בעט קטן עשוי להיות יעיל גם במניעת דימום נוסף. לבסוף, גלזום הממוקם בצד הנגדי של חלון ההדמיה עשוי גם לסייע במניעת דם ו- CSF מלגרום לבעיות הדמיה. שיקול שלישי הוא כמות המוח שיש להסיר. מצאנו כי הסרת המוח caudal ל ~ Bregma -3.80 תגרום למוות בתוך שעה של הסרה. לכן, המוח צריך להיות מוסר בחלקים קטנים, שמירה על כמה שיותר תוך חשיפת כמה שיותר TG ככל האפשר.

כפי שצוין במבוא, [Ca2+]i הוא מדד עקיף של פעילות עצבית, וכתוצאה מכך, עלייה ב [Ca2+]i לא בהכרח אומר שיש עלייה בפעילות העצבית. לכן, ניסויי בקרה הם קריטיים כדי לאשר שמה שנחשב לפעילות מעוררת הוא למעשה פעילות כשלעצמה. לדוגמה, גירויים המעוררים חשמלית אמורים לייצר עלייה נעולה בזמן ב-[Ca2+]i, שהיא בקנה מידה דומה לזה של גירויים המתעוררים באופן טבעי. חשוב לציין, פעילות זו צריכה להיות מסולקת עם בלוק של העצב (כלומר, TTX). עם זאת, חשוב גם לציין כי למרות בקרות חשובות אלה, עדיין ייתכן שחלק מהעליות המתעוררות לכאורה ב- [Ca2+]i נובעות מאיתות בתוך הגרעינים, למשל, עקב שחרור משדר בתוך הגרעינים41, ולא בשל פוטנציאל פעולה שהחל בפריפריה שפלש לתא סומה.

בעוד שהתוצאות שלנו מאשרות כי של חוקרים קודמים 16,42,43 המצביעים על יחס אות לרעש הקשור לשינויים בפלואורסצנטיות GCaMP בסומטה חושית מספיקים לשימוש עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי סטנדרטי, מניפולציות כגון הפגיעה העצבית ששימשה במחקר הנוכחי עשויות להיות קשורות לשינויים דרמטיים כאלה בפעילות העצבית ובאיתות Ca 2+ 34שתגובות ברחבי הגרעינים עשויות להיות קשורות לעלייה כה גדולה ברקע הנראה לעין, שהתגובות של נוירונים בודדים עשויות להיות מוחלשות באופן מלאכותי., בעוד שפותחו גישות לעיבוד הדמיה שעשויות לסייע בהתמודדות עם מגבלה זו44, ייתכן שיהיה צורך בדימות קונפוקלי או מולטיפוטון כדי לפתור בעיה זו בצורה היעילה ביותר.

יחד, טכניקה זו מספקת גישה לחקר תכונות הגירוי-תגובה של נוירוני TG בחולדה ברמת האוכלוסייה. התוצאות שלנו עם CCI של ION מאשרות את ההיתכנות של זיהוי שינויים בתכונות גירוי-תגובה אלה. בעוד שרק גירויים מכניים ותרמיים שימשו במחקר הנוכחי, הכנה זו צריכה להיות מקובלת על היישום של גירויים כימיים כדי להגדיר באופן מלא את תכונות הגירוי-תגובה של נוירונים TG. באופן דומה, בעוד שהתמקדנו בתכונות גירוי-תגובה של אפרנטים עוריים, בגלל הופעתן של תופעות כגון אלודיניה מכנית דינמית בעקבות פגיעה טראומטית בעצב עורי, יש לאפשר גם לזהות שינויים בתכונות של afferents innervating מבנים קרניופלציאליים אחרים כגון המפרק הרקתי-רומנדיבולרי (בתגובה לתנועות לסת מזיקות לעומת מזיקות), קרנית או לשון. הזרקה היקפית של סרוטיפ AAV9 מאפשרת אינדוקציה ספציפית לנוירון של GCaMP שהיא ספציפית ל-PNS. היתרון העיקרי של אסטרטגיה זו הוא שתיוג נגיפי מספק ביטוי חזק ומתמשך בתאים פוסט-מיטוטיים (כלומר, נוירונים), אך לא בתאים מיטוטיים (למשל, תאי אפיתל). בנוסף, סינון ראשוני של רקמות PNS שונות מצביע על כך שניתן להשתמש באסטרטגיה נגיפית זו כדי לחקור גם גרעינים פארא/סימפתטיים, DRG ומערכות עצבים אנטריות (הנתונים אינם מוצגים).

הכנה זו in vivo מספקת גם את הבסיס לחקור השוואות רבות שחסרות בספרות הנוכחית. מחקרי אוכלוסיית In vivo בין TG חולדה ו-DRG, חולדה לעומת עכבר TG, טרם נערכו. הנתונים המוצגים כאן ממחישים את ההיתכנות החדשה של ניסויים חשובים אלה להתבצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד"ר גולד קיבל תמיכה ממענקים מגרוננטל במהלך פיתוח תכשיר זה. לא הייתה חפיפה בין מוקד המחקר של גריננטל לבין ההכנה המתוארת בכתב יד זה. לאף אחד מהמחברים האחרים אין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים אחרים לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר קתי אלברס וד"ר בריאן דייוויס על השימוש בתוכנית המיקרוסקופ והמטמורף של Leica שלהם, לצ'ארלס וורוויק על עזרתם בבניית מכשיר פלטייה תרמי שלנו, ולד"ר ריימונד סקולה על עזרתו בפתרון בעיות בהכנה הניתוחית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) ו- R01NS122784 (MSG ו- RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Tags

מדעי המוח גיליון 204
<em>In-Vivo</em> הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter