Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)는 감각 뉴런 신호에 대한 강력한 집단 수준 분석을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 쥐의 삼차신경절 뉴런 활동의 생체 내 GECI 시각화를 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다.

Abstract

유전자 인코딩 칼슘 지표(GECI)를 사용하면 이미징 기술을 통해 표적 세포 집단에서 세포 내 칼슘의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 신호 대 잡음비가 크기 때문에 GECI는 감각 뉴런에서 자극 유발 활동을 감지하는 강력한 도구입니다. GECI는 동시에 연구할 수 있는 뉴런의 수로 자극 인코딩의 집단 수준 분석을 용이하게 합니다. 이 모집단 인코딩은 생체 내에서 가장 적절하게 수행됩니다. 목 아래의 체세포 및 내장 구조를 신경 자극하는 감각 뉴런의 소마를 수용하는 등근 신경절(DRG)은 이러한 구조에 비교적 쉽게 접근할 수 있기 때문에 생체 내 이미징에 가장 광범위하게 사용됩니다. 최근에는 생쥐를 대상으로 구강 및 두개안면 구조를 자극하는 삼차신경절(TG)의 감각 뉴런을 연구하는 데 사용되었습니다. 삼차신경통과 같은 감각 뉴런 활동의 변화를 반영하는 것으로 보이는 구강 및 두개안면 구조에 특이적인 통증 증후군의 긴 목록을 포함하여 DRG 외에도 TG를 연구해야 하는 많은 이유가 있습니다. 생쥐는 유전 도구의 가용성 때문에 DRG 및 TG 뉴런 연구에서 가장 광범위하게 사용됩니다. 그러나 크기의 차이, 취급의 용이성, 잠재적으로 중요한 종의 차이로 인해 쥐 TG 뉴런이 아닌 쥐를 연구해야 하는 이유가 있습니다. 따라서 우리는 생체 내에서 쥐 TG 뉴런을 이미징하는 접근 방식을 개발했습니다. 신생아 새끼(p2)에 GCaMP6를 인코딩하는 AAV를 복강내로 주입한 결과, TG 및 DRG 뉴런이 >90% 감염되었습니다. TG는 개두술 및 탈피술 후 성인에서 시각화되었으며, 얼굴의 하악 및 상악 부위를 자극한 후 TG 뉴런에서 GCaMP6s 형광의 변화를 모니터링했습니다. 형광의 증가는 말초 신경 차단에 의한 자극에 의한 것임을 확인했습니다. 이 접근법은 많은 잠재적 용도를 가지고 있지만, 우리는 말초 신경 손상 후 변화된 TG 뉴런의 하위 집단을 특성화하는 데 사용하고 있습니다.

Introduction

피부나 근육, 뼈, 내장을 포함한 다른 신체 구조에 영향을 미치는 기계적, 열적, 화학적 자극의 신경 인코딩인 체성 감각은 이러한 구조를 신경 자극하는 일차 구심성 뉴런의 활동으로 시작됩니다1. 단일 단위 기반 전기 생리학적 접근법은 이 과정에 관련된 구심성 아형에 대한 풍부한 정보와 자극-반응 특성이 시간이 지남에 따라 어떻게 변할 수 있는지에 대한 풍부한 정보를 제공했습니다 1,2,3. 그러나, 특정 감각 양식이 뉴런의 특정 하위 집단(들)에 의해 전달된다는 것을 시사하는 표지된 선 이론을 지지하는 강력한 증거가 남아 있지만, 동일한 유형의 기계적, 열적, 화학적 자극에 반응하는 많은 뉴런 하위 집단의 능력은 체성 감각 자극의 대부분이 뉴런의 여러 하위 집단에 의해 암호화된다는 것을 시사한다4, 5. 따라서 체성 감각에 대한 더 나은 이해는 수백 개는 아니더라도 10개의 뉴런의 활동을 동시에 연구할 수 있는 능력과 함께 이루어질 것입니다.

비교적 최근의 공초점 및 다광자 및 디지털 이미징 기술의 출현과 함께 광학 접근법의 발전은 신경 활동에 대한 상대적으로 비침습적인 인구 수준 분석을 수행할 수 있는 능력을 촉진했습니다 6,7. 이 기술 적용의 마지막 장애물 중 하나는 신경 활동의 광학적 평가를 가능하게 하는 도구의 개발이었습니다. 밀리초 이내에 시작하고 끝날 수 있는 활동 전위의 속도를 감안할 때, 활동 전위의 속도로 막 전위의 변화를 추적할 수 있는 전압에 민감한 염료가 이러한 목적에 이상적인 도구가 될 것입니다. 그러나 이 영역7,8,9,10에서 엄청난 진전이 있었지만 이러한 염료 중 많은 부분에 대한 신호 대 잡음비는 여전히 단일 세포 수준에서 수백 개의 뉴런 집단 분석을 가능하게 할 만큼 충분히 높지 않습니다. 대안으로 연구자들은 세포 내 Ca2+ 농도([Ca2+]i)의 변화를 모니터링하는 것으로 전환했습니다. 이 전략의 한계는 처음부터 분명했으며, [Ca2+]i의 증가가 신경 활동의 간접적인 척도라는 사실을 포함한다11; [Ca2+]i의 증가는 전압 개폐 Ca2+ 채널(VGCC)의 활성화와 관련된 Ca2+ 유입과 독립적으로 발생할 수 있습니다.12,13; Ca2+ 과도 현상의 크기 및 지속 시간은 VGCC 활성(11,12,14)과 무관한 프로세스에 의해 제어될 수 있습니다. 그리고 Ca2+ 과도 현상의 시간 경과는 활동 전위15의 시간 경과를 훨씬 초과합니다. 그럼에도 불구하고 신경 활동의 간접 측정으로 Ca2+를 사용하는 것과 관련된 여러 가지 중요한 이점이 있습니다. 이들 중 가장 중요한 것은 대부분의 Ca2+ 지표와 관련된 신호 대 잡음비로, 세포 내 Ca2+의 변화 크기와 신호가 세포막의 2차원 공간이 아닌 세포질의 3차원 공간에서 발생한다는 사실을 모두 반영합니다. 또한, 유전적으로 인코딩된 Ca2+ 지표(GECI)의 개발로 세포의 특정 하위 집단에서 Ca2+ 지표의 발현을 유도하는 유전 전략을 활용할 수 있으며, 온전한 제제에서 집단 수준 분석을 용이하게 할 수 있습니다(예:16 참조).

현재 생쥐에서 사용할 수 있는 유전 도구의 수를 감안할 때 GECI가 이 종에서 가장 광범위하게 사용되었다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 감각 뉴런의 하위 집단에서 구성적 GECI 발현을 갖는 마우스 라인이 개발되었습니다 7,16,17. 특정 세포 유형에서 재조합 효소를 발현하는 마우스 라인의 개발로 GECI 발현을 제어하기 위해 훨씬 더 정교한 전략을 사용할 수 있습니다15. 그러나 이러한 도구가 그 어느 때보다 강력하지만 쥐와 같은 다른 종이 일부 실험 질문에 더 적합할 수 있는 여러 가지 이유가 있습니다. 여기에는 더 큰 크기가 포함되어있어 더 작은 마우스에서 불가능하지는 않더라도 어려운 여러 가지 실험적 조작을 용이하게합니다. 비교적 복잡한 행동 작업에서 쥐를 훈련시키는 용이성; 그리고 쥐의 감각 뉴런에서 여러 이온 채널의 생물물리학적 특성과 발현 패턴이 인간에 비해 마우스에서 동일한 채널보다 인간 감각 뉴런에서 관찰되는 것과 더 유사할 수 있다는 적어도 일부 증거가있다 18.

체성 감각 자극의 전달은 일반적으로 일차 구심성의 말초 말단에서 발생하지만, 말초에서 시작된 활동 전위는 중추 신경계에 도달하기 전에 등쪽 뿌리(DRG) 또는 삼차신경절(TG)이라고 하는 일차 구심성 소마타를 수용하는 구조를 통과해야 한다19. 일차 구심성 축삭돌기를 따라 전파되는 모든 활동 전위가 세포체(20)를 침범하는 것은 아니라는 증거가 있는 반면, 일차 구심성 소마타가 T-접합(19)을 통해 주 구심성 축삭돌기에 연결된다는 사실의 결과로서, 주변부에서 개시된 대부분의 활동 전위는 소마(21)를 침범하는 것으로 나타난다. 이것은 GECI를 사용하여 일차 구심성에서 집단 코딩을 평가할 때 세 가지 실험적 이점을 제공합니다 : 축삭에 비해 세포체의 크기가 크면 [Ca2 +] i를 구심성 활성의 간접 측정으로 사용할 때 신호 대 잡음이 더욱 증가합니다. DRG는 일반적으로 쉽게 액세스할 수 있습니다. 그리고 구심성 말단에서 공간적으로 멀리 떨어진 부위에서의 활동을 평가하면 신경절을 노출시키는 데 필요한 수술이 구심성 말단의 자극-반응 특성에 미치는 잠재적 영향을 최소화할 수 있습니다. 그러나 TG는 뇌 아래(또는 팔레트 위)에 위치하기 때문에 DRG보다 접근하기가 훨씬 더 어렵습니다. 또한 DRG와 TG 뉴런 사이에는 많은 유사점이 있지만 차이점도 점점 더 많아지고 있습니다. 여기에는 TG22의 뉴런의 대략적인 체성 조직, 신경 분포된 독특한 구조, 상이한 중심 말단 종결 패턴(23,24,25,26), 그리고 이제 유전자 발현(27,28)과 기능적 수용체 발현(29)의 차이점이 증가하고 있다. 또한, 통증의 말초 기전을 규명하는 데 관심이 있기 때문에, 삼차계에 고유한 것으로 보이는 통증 증후군(예: 편두통, 삼차신경통, 구강 작열감 증후군)이 1차 구심성30,31,32에서 비정상적인 활동을 수반하는 것으로 보이는 비교적 많은 수의 통증 증후군은 중성지방을 직접 연구할 필요가 있음을 시사한다.

따라서, 쥐16에서 TG 뉴런의 자극-반응 특성이 GECI로 연구되었지만, 위에 열거된 이유들은 쥐가 다양한 실험적 질문들을 다루기에 더 적합한 종일 수 있음을 시사하기 때문에, 본 연구의 목적은 쥐에서 TG 뉴런을 연구하기 위해 GECI를 사용하는 접근법을 개발하는 것이었다. 이를 달성하기 위해 바이러스 접근법을 활용하여 말초 신경계에서 GECI GCaMP6의 발현을 유도했습니다. 그런 다음 TG에 접근할 수 있도록 전뇌를 제거했습니다. 마지막으로, 기계적 및 열적 자극을 얼굴에 가하는 동안 형광 현미경으로 신경 반응을 평가했습니다. 이러한 데이터는 여러 상태에서 TG의 변화를 조사하기 위해 쥐를 활용하는 역할을 지원하며, 삼차계의 감각 코딩에 관심이 있는 연구자를 위한 툴킷을 확장합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

연구에 동물을 사용하는 것과 관련된 모든 실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)과 국제 통증 연구 협회(International Association for the Study of Pain)가 제시한 기준에 따라 수행되었으며 피츠버그 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 #22051100)의 승인을 받았습니다. 각 실험이 끝날 때마다, 쥐는 미국 수의학 협회(American Veterinary Medical Association)와 피츠버그 대학 IACUC가 승인한 접근법인 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)의 심장 관류를 통한 출혈을 통해 안락사되었습니다.

1. GCaMP 유도

  1. 임신 기간 동안 새끼가 출생 후 적절한 시간에 주사를 맞을 수 있도록 Sprague Dawley 쥐를 주문하십시오.
  2. 각 새끼 쥐를 다루기 전에 장갑에 70% EtOH를 뿌립니다. 이것은 댐이 새끼를 잡아먹는 것을 막을 것입니다.
  3. 새끼 쥐(P1-2)에 70% EtOH를 면봉으로 닦고 얼음 위에서 3분 동안 마취합니다.
  4. 25μL 멸균 기밀 Hamilton 주사기를 사용하여 15μL의 AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40(Addgene)을 복강내로 주입합니다.

2. 삼차신경절 노출 수술

  1. 6-8주 된 쥐(약 150-200g)에게 체중에 따라 마취 칵테일(케타민 55mg/kg, 자일라진 5.5mg/kg, 아세프로마진 1mg/kg)을 복강내로 투여합니다.
    참고: 이것은 일반적으로 뒷발의 유독한 꼬집음에 대한 금단 반사의 부재로 평가되는 수술 마취면을 유지하기에 충분합니다. 그러나 동물이 가벼워지면 코뿔을 통해 이소플루란을 보충하십시오.
  2. 완전히 마취되면 머리와 얼굴의 머리카락과 수염을 면도합니다.
  3. 이어 바가 있는 입체 프레임에 쥐를 장착하고 체온을 유지하기 위해 아래에 가열 패드(~37 oC)를 놓습니다.
  4. 생체 신호(심박수, 호흡수, 혈중 산소 포화도)를 마우스 산소 농도계 또는 이와 유사한 것으로 모니터링합니다.
    알림: 체온은 직장 프로브로 모니터링되며 피드백 제어 순환 물 담요에 쥐를 올려 놓아 유지됩니다.
  5. 얼음처럼 차가운 식염수에 적신 거즈를 머리에 대고 혈관을 수축시켜 출혈을 최소화합니다. 크기 15 메스를 사용하여 두개골 위의 피부와 근육을 정중선으로 절개합니다.
  6. 두개골을 노출시키기 위해 피부와 근육을 둔하게 해부합니다.
  7. 1/4 원형 드릴 비트를 사용하여 두개골 캡을 조심스럽게 천공하여 전뇌를 노출시킵니다. 그런 다음 롱거(2.5mm 컵)를 사용하여 두개골을 조심스럽게 자릅니다.
  8. 크기 15 메스를 사용하여 뇌(브레그마: -3.80)와 후각구를 절개합니다.
    알림: 이 지점을 지나 꼬리 방향으로 더 많이 자르면 쥐가 죽습니다
  9. 주걱을 사용하여 두개골에서 경막을 조심스럽게 분리하고 절단된 뇌를 부드럽게 들어 올려 TG와 두개골 기저부를 드러냅니다.
    알림: 추출 전반에 걸쳐 얼음처럼 차가운 식염수 관류를 추가로 사용하면 출혈을 최소화하고 다음 해부 필드를 최적화할 수 있습니다.
  10. 소작 펜을 사용하여 발치로 인한 출혈을 막습니다.
    알림: 경막을 자르면 피할 수 없는 출혈이 발생합니다. 얼음처럼 차가운 aCSF(119mM NaCl, 26.2mM NaHCO3, 2.5mM KCl, 1mMNaH2PO4, 1.3mM MgCl2, 10mM 포도당, 2.5mMCaCl2)를 준비하여 두개강을 목욕시켜 신경 건강을 유지하면서 혈관을 수축시키는 것이 가장 좋습니다.

3. GCaMP6s 이미징

참고: 이러한 뉴런의 크기와 밀도를 감안할 때 사용된 이미징 및 데이터 수집 시스템(대물렌즈, 현미경, 광원, 카메라)에 따라 시각화된 GECI+ 세포의 수가 결정됩니다. 광원, 대물렌즈 및 카메라는 노출 시간 및 이미지 캡처 속도를 포함하여 이미지 획득에 사용되는 매개변수도 결정합니다. 실험의 매개변수에 따라 다광자 및 공초점 기술을 사용할 수 있지만 에피형광 현미경은 많은 세포를 분해하는 데 충분할 수 있습니다. 모든 이미지 수집 패키지를 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 자극 어플리케이션은 이미지 획득 소프트웨어 패키지로 시간 고정됩니다.

  1. 대물렌즈 아래에 두개골을 놓고 가시광선을 사용하여 TG에 초점을 맞춥니다.
  2. GCaMP6s의 여기 파장은 496nm이고 방출 파장은 513nm입니다. 따라서 적절한 이색성 및 필터 큐브를 사용하여 GCaMP+ 세포를 찾습니다. 초점을 조정하여 뉴런이 관심 수용 영역에 적용된 자극에 반응하는 신경절 영역을 찾고 해결합니다.
  3. 10x 대물렌즈를 사용하여 얼굴16의 1cm2 영역에 가해진 기계적 자극에 반응하는 TG의 대부분의 뉴런을 시각화할 수 있습니다. 작동 거리(10.8mm)가 긴 20x 건식 대물렌즈를 사용하여 해상도를 높이십시오.
  4. 수집 소프트웨어(예: Metamorph)를 사용하여 시간 경과에 따른 형광 데이터를 수집하고 자극 적용에 대응합니다.
    1. 뉴런의 광표백을 최소화하려면 가능한 한 짧은 노출 시간을 사용하여 형광의 기준선 및 유발 증가를 감지합니다. 본 연구에 사용된 20x, 0.40NA 에어 대물렌즈, 120W 할로겐화 수은 광원 및 CMOS(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) 카메라를 사용하여 300ms의 노출 시간과 3Hz의 이미지 획득 속도로 >90분 동안 안정적인 베이스라인 레코딩을 얻을 수 있습니다.
      참고: 1) 이러한 이미지 획득 매개변수는 경험적으로 결정되어야 합니다. 2) 수용장에 기계적(브러시, 천점, 진동, 핀치), 열적(열, 냉기), 화학물질(캡사이신, 멘톨, 염증 매개체)을 적용할 수 있다. 비교적 저렴한 주관적 접근 방식은 손으로 자극을 적용하는 것입니다. 그러나 보다 객관적이고 재현 가능한 접근 방식이 권장되며, 피드백 제어 액추에이터는 알려진 힘에서 반복적으로 적용할 수 있습니다. 피드백 제어 펠티에 장치는 가열 및 냉각 제어에 유용하지만 곡선면의 열 자극에는 적합하지 않습니다. 피드백 제어 적외선 광원은 가열을 위한 대안이며 콜드 스프레이는 냉각을 위한 이상적인 대안이 아닙니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이전에 쥐 감각 뉴런15의 감염에 대한 AAV9 혈청형에 대한 성공을 거두었기 때문에, 우리는 쥐 TG 뉴런에서 GCaMP6의 발현에 이 혈청형을 사용했다. 따라서 우리는 먼저 AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP)을 신생아 쥐 새끼에게 투여했을 때 감각 뉴런 감염 효율을 평가하고자 했다20. 이 바이러스는 높은 수준의 유전자 발현을 유도하고 유지하는 CAG promoter를 이용합니다. 또한, AAV9은 신생아 쥐에게 투여될 때 감각 뉴런을 효율적으로 감염시키는 것으로 나타났다33. 첫 번째 주사는 출생 후 5일(p5) 새끼에서 5μL를 사용하여 약 51.66% ± 14.33%의 효율을 보였습니다(그림 1A). 감염률을 높이기 위해 우리는 결국 더 어린 쥐(p2)에 더 많은 양의 바이러스(15μL)를 사용하여 바이러스 역가를 2.4 x 1014 로 동일하게 유지했습니다. 이 전략은 뉴런의 91.84%± 3.18%(n=8)가 감염된 결과를 낳았습니다(그림 1B).

진동 패드를 자극하는 TG 뉴런을 시각화하기 위해 다음으로 TG를 생체 내에서 노출시키는 수술 전략을 개발했습니다. 전뇌의 약 60%는 주요 호흡기 중추에 영향을 주지 않고 제거할 수 있습니다. 이것은 브레그마 -3.80에 대한 뇌 조직 로스트랄에 해당합니다. 노출된 TG(왼쪽)와 안와하 신경(ION, 오른쪽)의 신경 분포 영역의 개략도는 그림 2에 나와 있습니다. 진동 패드의 신경 분포를 일으키는 TG 영역은 20x에서 형광 변화를 모니터링하면서 진동 패드에 가벼운 기계적 자극(브러시)을 가하여 측정했습니다. 예측한 대로, 얼굴의 상악 부분을 신경 자극하는 TG의 V2 영역이 유일하게 활성화된 영역이었습니다. 즉, 체계적으로 연구되지는 않았지만 연구 중인 뉴런이 진동 패드에 가해진 자극으로 활성화될 수 있을 때 V1(이마의 피부) 또는 V3(하악의 피부) 영역에 가해진 자극에 대한 반응으로 형광의 변화가 감지되지 않았습니다. 그런 다음 기준선에서 형광의 변화와 진동 패드에 가해진 자극에 대한 반응을 모니터링했습니다. 관심 영역(V2)은 그림 3A에 표시되어 있습니다. 감각 뉴런(sensory neuron)에서 상대적으로 낮은 수준의 휴지 활성(resting activity)에 대한 이전의 보고와 일치하게(34), 휴지 형광은 대부분의 뉴런에서 상대적으로 낮았고, 형광의 자발적인 증가에 대한 증거는 거의 없었다(그림 3B). 주변부(periphery)의 뉴런(6,16,21)과 중추신경계(CNS)12,35,36에서 자극 유발 활동을 식별하는 데 사용되는 기준은 자유롭게 이용할 수 있는 몇 가지 정교한 워크플로우 패키지(37,38)와 함께 진화하는 분야이다. 사용된 다양한 접근 방식의 강점과 약점에 대한 완전한 논의는 본 원고의 범위를 벗어납니다. 이것이 본 연구의 초점이 아니었기 때문에, 우리는 명확하게 검출할 수 있는 뉴런이 없는 신경절 영역에서 관찰된 피크 반응(핵을 볼 수 있는 능력에 기반하여)을 기반으로 상대적으로 임의적이고 주관적인 기준을 사용했으며, 형광의 증가가 자극 적용에 시간 고정된 경우(자극 적용 후 1초 이내에 감지된 형광 증가( 세포체에서 3cm 이내의 위치에서 시작된 가장 느린 전도성 축삭돌기(0.2m/s)에서 시작된 활동 전위가 1초 이내에 세포체에 도달해야 한다는 가정에 기반하여) >피크 응답(ΔF/F)의 표준 편차의 6배인 대조 부위를 감지했습니다(그림 3C). 다음으로, 우리는 자연적인 자극에 대한 이러한 뉴런의 반응 특성을 특성화했습니다: 브러시, 펑크, 열 및 추위. 이러한 각 자극에 대한 반응의 예는 그림 4에 나와 있습니다. 특히, 통증 관련 연구에서 가장 자주 사용되는 천점 자극에 대한 반응이 가장 강력한 반응을 보입니다(그림 4B,F).

이 기술을 개발하는 우리의 목표는 TG 뉴런의 집단 코딩 변화를 평가할 수 있도록 하는 것이었습니다. 따라서, 우리는 신경 손상 후 2 주 후에 쥐를 연구하기 위해 이전에 사용했던것처럼 ION (CCI-ION)에 만성 수축 손상을 적응시켰다. 모델 유도 후, 우리는 TG를 노출시키고 부상 부위의 동측 및 반대측 TG에서 휴식 및 유발 활동을 평가했습니다. 흥미롭게도, 칫솔질에 대한 피크 유발 반응의 크기는 반대쪽에 가해진 동일한 자극에 대한 피크 반응에 비해 신경 손상 쪽에서 ~2배 증가했습니다(그림 5A-C). 더욱이, 두 개의 브러시 자극이 직렬로 적용되었을 때(자극 간 간격 10초), 부상을 입었지만 손상되지 않은 쪽에서 두 번째 자극에 대한 반응의 크기가 크게 증폭되었습니다(그림 5D).

마지막으로, 자극에 의한 형광의 증가가 주변부에서 시작된 활동 전위에 의한 것임을 확인하기 위한 초기 대조 실험으로 자극 유발 반응에 대한 테트로도톡신(1μM)의 영향을 평가했습니다. TTX는 안와하신경을 표적화하기 위해 앞서 설명한바와 같이 200μL 의 부피를 경피적으로 주입하였다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 유발된 활동은 거의 완전히 제거되었습니다. 종합하면, 이러한 결과는 AAV9-GCaMP를 사용하여 생체 내에서 TG 집단 반응을 조사하는 것의 유용성을 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 신생아 AAV 주입을 사용한 TG 뉴런의 GCaMP6s 감염 효율 높음. (A) P5 새끼 쥐에게 5μL의 pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40(역가: 2.4 x 1014) 바이러스를 복강내로 주입했습니다: TG 뉴런의 51.7 ± 14.3%에서 GCaMP6s 발현이 검출되었습니다(n=동물당 3개 절편, 7마리 랫트). (B) 더 어린 동물(p2)에서 주입량을 15μL로 증가시키면 감염 효율이 향상됨: TG 뉴런의 91.8 ± 3.2%에서 GCaMP6s 발현이 검출되었습니다(n=동물당 3개 절편, 8마리의 쥐). 왼쪽 패널은 GCaMP6용으로 염색되었습니다. 중간에 있는 패널은 뉴런 특이적 마커인 NeuN으로 염색되었습니다. 오른쪽 패널은 GCaMP6 및 NeuN 패널의 병합 이미지입니다. 첫 번째 패널의 축척 막대는 모든 후속 패널에 대해 동일합니다. 오른쪽 그래프는 동물당 슬라이스당 총 뉴런 수의 백분율로 나타낸 GCaMP6s 발현(평균 ± SEM)의 플롯이며, 여기서 개별 점은 각 동물에 대한 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 삼차신경절(TG), 안와하신경(ION) 및 자극된 얼굴 부위(진동 패드)의 위치. (A) TG에 접근할 수 있도록 전뇌를 제거했습니다. (B) ION 및 TG에 대해 자연 자극이 가해진 얼굴 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: GCaMP6 형광의 자극 유발 증가. (A) 20배 배율 이하의 전체 시야. TG의 안과(V1) 및 상악(V2) 부분이 표시됩니다. (나,씨) 상자의 영역은 패널 B 와 C에 표시되어 있으며, 이는 각각 진동 패드의 브러시 자극 전과 후의 형광 이미지입니다. 흰색 원은 비교 관심 영역입니다. 뉴런은 본문에 설명된 대로 비교기 관심 영역에서 관찰된 형광의 피크 변화를 기반으로 자극에 반응하는 것으로 간주되었습니다. 첫 번째 패널의 축척 막대는 두 패널 모두 동일합니다. (D) 얼굴에 가해진 브러시 자극에 대한 반응으로 B와 C에 나타난 뉴런의 형광 변화를 대표적으로 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 얼굴에 가해진 자극에 대한 반응에 따른 뉴런 분류. TG 뉴런의 대표적인 이미지: 1cm 낙타털 브러시(A - 브러시), 1cm2 그리드의 모노필라멘트(B - 반점), 가열(C - 가열) 및 냉각(D - 냉기)에 대한 반응 전(상단 패널 - 기준선) 및 후(중간 패널 - 자극) 얼굴의 동일한 영역에 적용. 첫 번째 패널의 축척 막대는 모든 후속 패널에 대해 동일합니다. 주황색 원은 반응하는 뉴런의 예를 나타냅니다. 흰색 원은 비교 관심 영역입니다. (E-H) 자극당 각 반응의 대표 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 신경 손상은 TG 뉴런의 브러시 유발 반응을 증가시킵니다. 칫솔질에 대한 TG 뉴런의 전형적인 반응은 안와하 신경의 만성 수축 손상(A, Contra) 또는 신경 손상의 동측 측면(B, Ipsi)에 두 번 적용된 쥐 얼굴에 두 번 적용되었습니다. (C) 6마리의 쥐의 반응성 뉴런에서 얻은 통합 데이터를 분석한 결과(그래프로 표시된 데이터는 쥐당) 브러시에 대한 첫 번째 반응의 크기 차이가 유의하다는 것을 확인했습니다(쌍체 t-검정). (D) 제1 및 제2 자극 적용에 대한 피크 반응을 비율(R2/R1)로 분석했을 때, 통합 데이터를 분석한 결과 신경 손상 쪽의 반응 비율이 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었습니다. ** p < 0.01 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 테트로도톡신(tetrodotoxin, TTX)을 사용한 TG 뉴런의 유발된 활성 블록. (A) 브러시 자극(파란색 막대)을 가한 후 안와하 신경에 인접한 TTX(200μL, 1μM) 주입 후 신경 손상에 대한 동측성 TG 뉴런의 형광 데이터. (B) 세 마리의 쥐로부터 풀링된 피크 반응 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

여기에서는 TG를 이미징하기 위해 GECI 쥐를 생성하는 빠르고 비침습적인 방법을 보여줍니다. 우리는 높은 수준의 유전자 발현을 유도하고 유지하기 위해 CAG 프로모터를 선택했습니다. 이전 연구들은 다른 AAV 혈청형이 DRG 뉴런에서 유전자 발현을 효율적으로 유도할 수 있음을 시사하지만39, 우리의 결과는 AAV9 혈청형이 쥐의 신생아 감각 뉴런의 감염에 매우 효율적임을 나타내는 신생아32에서 AAV의 복강내 주입과 관련된 최근 연구와 일치한다.

이 기술의 문제 해결을 통해 최적의 감염을 방지할 수 있는 몇 가지 함정에 주목할 가치가 있습니다. 명심해야 할 주요 변수는 새끼의 나이입니다. 쥐의 신경계는 출생 후 첫 7일 동안빠르게 발달한다 40. 이후 시점(예: p4-7)에서 감염을 시도했는데, 그 결과 가변적이고 효율성이 떨어졌습니다. 초기 시점(p1-4)은 더 강력하고 일관된 효율성을 생성하며, p1-2는 가장 높은 감염률을 생성합니다. 두 번째 변수는 주입량입니다. 연령에 관계없이 2.5 x 1014의 역가로 TG 또는 DRG에서 70% 이상의 효율을 생성하려면 최소 15μL가 필요했습니다. p2에서도 10μL 미만의 복강내 주사는 성인에서 발현이 거의 이루어지지 않는다는 것을 발견했습니다. 더 적은 부피로 더 국소적인 주입, 즉 관심 수용 영역으로 직접 주입하면 유사한 효과를 낼 수 있습니다. 그러나 이 접근 방식은 새끼를 완전히 마취해야 하며 관심 조직에 외상을 유발할 수 있습니다. 마지막으로, 더 작은 부피를 더 높은 역가와 함께 사용할 수 있습니다.

GECI 이미징을 위한 TG를 노출시키는 것은 이전에 마우스(16)에서 수행되었다. 그러나 이 접근법을 쥐에게 적용하자 고려할 가치가 있는 몇 가지 문제가 드러났습니다. 첫째, 쥐의 두개골과 경막의 두께는 쥐보다 훨씬 큽니다. 따라서 두개골 뚜껑을 제거하는 것은 문제가 될 수 있습니다. 우리는 작은 드릴이 두개골 뚜껑을 뚫는 효과적인 방법이라는 것을 발견했으며, 그런 다음 롱거로 제거할 수 있습니다. 두 번째 문제는 뇌를 제거한 후 출혈이 발생하는 것입니다. 이것은 뉴런의 특성이 아니라면 준비의 수명과 이미징의 명확성 모두에 대한 지속적인 문제일 수 있습니다. 얼음처럼 차가운 뇌척수액에 적신 거즈를 뇌의 노출된 표면에 바르면 주요 동맥을 닫는 데 도움이 될 수 있습니다. 작은 소작 펜을 사용하는 것도 추가 출혈을 막는 데 효과적일 수 있습니다. 마지막으로, 이미징 창의 반대쪽에 위치한 젤폼은 혈액과 CSF가 이미징 문제를 일으키는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세 번째 고려 사항은 제거할 뇌의 양입니다. 뇌 꼬리를 ~브레그마 -3.80으로 제거하면 제거 후 한 시간 이내에 사망하는 것으로 나타났습니다. 따라서 뇌는 작은 부분으로 나뉘어 제거되어야 하며, 가능한 한 많은 TG를 노출시키면서 가능한 한 많이 유지해야 합니다.

서론에서 언급했듯이 [Ca2+]i 는 신경 활동의 간접적인 척도이며, 결과적으로 [Ca2+]i 의 증가가 반드시 신경 활동의 증가를 의미하지는 않습니다. 따라서 대조 실험은 유발된 활동으로 간주되는 것이 실제로 활동 그 자체인지 확인하는 데 중요합니다. 예를 들어, 전기적으로 유발된 자극은 자연적으로 유발된 자극과 유사한 규모인 [Ca2+]i 의 시간 고정 증가를 생성해야 합니다. 중요한 것은 이 활동이 신경 차단(즉, TTX)으로 제거되어야 한다는 것입니다. 그러나, 이러한 중요한 대조군들에도 불구하고, 명백하게 유발된 [Ca2+]i 의 증가들 중 일부는 여전히 세포 소마를 침범한 말초에서 개시된 활동 전위 때문이라기보다는, 예를 들어, 신경절(41) 내의 전달체 방출에 기인하는 것일 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다.

본 연구의 결과는 감각 체세포에서 GCaMP 형광의 변화와 관련된 신호 대 잡음비를 나타내는 이전 연구자(16,42,43)의 경우 표준 형광 현미경과 함께 사용하기에 충분하다는 것을 확인하지만, 본 연구에서 사용된 신경 손상과 같은 조작은 신경 활성 및 Ca 2+ 신호전달의 극적인 변화와 관련될 수 있습니다34, 신경절 전체의 반응은 겉보기 배경의 큰 증가와 관련이 있을 수 있으며, 개별 뉴런의 반응이 인위적으로 약화될 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하는데 도움이 될 수 있는 이미징 처리 접근법이 개발되었지만(44), 이 문제를 가장 효과적으로 해결하기 위해서는 공초점 또는 다광자 이미징이 필요할 수 있다.

종합하면, 이 기술은 집단 수준에서 쥐의 TG 뉴런의 자극-반응 특성을 조사하기 위한 접근 방식을 제공합니다. ION의 CCI를 사용한 결과는 이러한 자극-반응 특성의 변화를 감지하는 타당성을 확인합니다. 본 연구에서는 기계적 및 열적 자극만 사용되었지만, 이 준비는 TG 뉴런의 자극-반응 특성을 완전히 정의하기 위해 화학적 자극을 적용할 수 있어야 합니다. 마찬가지로, 피부 구심성의 자극-반응 특성에 초점을 맞추었지만, 피부 신경에 대한 외상성 손상에 따른 동적 기계적 이질증과 같은 현상의 출현으로 인해 턱관절과 같은 다른 두개안면 구조를 신경 자극하는 구심성의 특성 변화도 감지할 수 있어야 합니다(무해한 턱 움직임과 유해한 턱 움직임에 대한 반응). 각막 또는 혀. AAV9 혈청형의 말초 주입은 PNS 특이적인 GCaMP의 뉴런 특이적 유도를 가능하게 합니다. 이 전략의 주요 이점은 바이러스 라벨링이 유사분열 후 세포(즉, 뉴런)에서는 견고하고 지속적인 발현을 제공하지만 유사분열 세포(예: 상피 세포)에서는 제공하지 않는다는 것입니다. 또한 다양한 PNS 조직의 예비 스크리닝은 이 바이러스 전략이 부교감신경절, DRG 및 장 신경계를 조사하는 데에도 사용될 수 있음을 나타냅니다(데이터 표시 안 됨).

이러한 in vivo 준비는 또한 현재 문헌에 부족한 많은 비교를 탐색할 수 있는 기초를 제공합니다. 쥐 TG와 DRG, 쥐 대 쥐 TG 사이의 생체 내 집단 연구는 아직 수행되지 않았습니다. 여기에 제시된 데이터는 수행될 이러한 중요한 실험의 새로운 타당성을 보여줍니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

골드 박사는 이 제제를 개발하는 동안 그루넨탈로부터 보조금 지원을 받고 있었다. 그루넨탈 연구의 초점과 이 원고에 기술된 준비에는 겹치는 부분이 없었다. 다른 저자 중 누구도 공개할 다른 잠재적인 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

라이카 현미경 및 변태 프로그램을 사용해 주신 Kathy Albers 박사님과 Brian Davis 박사님, 열 펠티에 장치 제작에 도움을 주신 Charles Warwick 박사님, 수술 준비 문제 해결에 도움을 주신 Raymond Sekula 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health: F31NS125993, JYG), T32NS073548(JYG), R01NS122784(MSG 및 RS)의 보조금으로 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Tags

신경 과학 204 호
<em>생체 내</em> 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter