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Neuroscience

En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten un análisis robusto a nivel poblacional de la señalización de las neuronas sensoriales. Aquí, hemos desarrollado un enfoque novedoso que permite la visualización in vivo de GECI de la actividad de las neuronas de los ganglios trigéminos de rata.

Abstract

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten que las técnicas de imagen monitoricen los cambios en el calcio intracelular en las poblaciones celulares objetivo. Su gran relación señal-ruido hace que los GECI sean una poderosa herramienta para detectar la actividad evocada por estímulos en las neuronas sensoriales. Los GECI facilitan el análisis a nivel poblacional de la codificación de estímulos con el número de neuronas que se pueden estudiar simultáneamente. Esta codificación poblacional se realiza de forma más apropiada in vivo. Los ganglios de la raíz dorsal (DRG), que albergan el soma de las neuronas sensoriales que inervan las estructuras somáticas y viscerales debajo del cuello, se utilizan más ampliamente para la obtención de imágenes in vivo porque se accede a estas estructuras con relativa facilidad. Más recientemente, esta técnica se utilizó en ratones para estudiar las neuronas sensoriales del ganglio trigémino (TG) que inervan las estructuras orales y craneofaciales. Hay muchas razones para estudiar la TG además de la GRD, incluida la larga lista de síndromes de dolor específicos de las estructuras orales y craneofaciales que parecen reflejar cambios en la actividad de las neuronas sensoriales, como la neuralgia del trigémino. Los ratones se utilizan más ampliamente en el estudio de las neuronas DRG y TG debido a la disponibilidad de herramientas genéticas. Sin embargo, con las diferencias en el tamaño, la facilidad de manejo y las diferencias de especies potencialmente importantes, hay razones para estudiar neuronas TG de rata en lugar de ratón. Por lo tanto, desarrollamos un enfoque para obtener imágenes de neuronas TG de rata in vivo. Inyectamos crías neonatales (p2) por vía intraperitoneal con un AAV que codifica GCaMP6s, lo que resultó en una infección del >90% de las neuronas TG y DRG. La TG se visualizó en el adulto después de la craneotomía y la decorticación, y los cambios en la fluorescencia de GCaMP6s se monitorizaron en las neuronas TG después de la estimulación de las regiones mandibular y maxilar de la cara. Confirmamos que los aumentos de fluorescencia fueron evocados por estímulos con el bloqueo de nervios periféricos. Si bien este enfoque tiene muchos usos potenciales, lo estamos utilizando para caracterizar la(s) subpoblación(es) de neuronas TG cambiadas después de una lesión de los nervios periféricos.

Introduction

La somatosensación, la codificación neuronal de estímulos mecánicos, térmicos y químicos que inciden en la piel u otras estructuras corporales, incluidos los músculos, los huesos y las vísceras, comienza con la actividad de las neuronas aferentes primarias que inervanestas estructuras. Los enfoques electrofisiológicos basados en una sola unidad han proporcionado una gran cantidad de información sobre los subtipos aferentes involucrados en este proceso, así como sobre cómo sus propiedades de estímulo-respuesta pueden cambiar con el tiempo 1,2,3. Sin embargo, aunque sigue habiendo pruebas sólidas que apoyan la teoría de las líneas marcadas, que sugiere que las modalidades sensoriales específicas son transmitidas por subpoblaciones específicas de neuronas, la capacidad de muchas subpoblaciones de neuronas para responder a los mismos tipos de estímulos mecánicos, térmicos y químicos sugiere que la mayoría de los estímulos somatosensoriales están codificados por múltiples subpoblaciones deneuronas. 5. Por lo tanto, una mejor comprensión de la somatosensación solo vendrá con la capacidad de estudiar la actividad de 10, si no cientos, de neuronas simultáneamente.

Los avances en los enfoques ópticos con el advenimiento relativamente reciente de las técnicas de imagen confocal y, posteriormente, multifotónica y digital, han facilitado la capacidad de realizar análisis dela actividad neuronal a nivel poblacional relativamente no invasivos 6,7. Uno de los últimos obstáculos en la aplicación de esta tecnología ha sido el desarrollo de herramientas que permitan la evaluación óptica de la actividad neuronal. Dada la velocidad de un potencial de acción que puede comenzar y terminar en menos de un milisegundo, un colorante sensible al voltaje con la capacidad de seguir los cambios en el potencial de membrana a la velocidad de un potencial de acción sería la herramienta ideal para este propósito. Pero si bien ha habido un tremendo progreso en esta área 7,8,9,10, la relación señal-ruido para muchos de estos colorantes aún no es lo suficientemente alta como para permitir un análisis poblacional de cientos de neuronas a nivel de una sola célula. Como enfoque alternativo, los investigadores han recurrido a la monitorización de los cambios en la concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i). Las limitaciones de esta estrategia han sido claras desde el principio e incluyen el hecho de que un aumento de [Ca2+]i es una medida indirecta de la actividad neuronal11; que puede ocurrir un aumento de [Ca2+]i independientemente de la afluencia de Ca2+ asociada con la activación de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VGCC)12,13; que la magnitud y duración de un transitorio de Ca2+ puede ser controlada por procesos independientes de la actividad VGCC 11,12,14; y que el curso temporal de los transitorios de Ca2+ supera con creces el de un potencial de acción15. Sin embargo, hay una serie de ventajas significativas asociadas con el uso de Ca2+ como medida indirecta de la actividad neuronal. No menos importante es la relación señal-ruido asociada con la mayoría de los indicadores de Ca2+, que refleja tanto la magnitud del cambio en el Ca2+ intracelular como el hecho de que la señal surge del espacio tridimensional del citosol en lugar del espacio bidimensional de la membrana celular. Además, con el desarrollo de indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI), es posible aprovechar las estrategias genéticas para impulsar la expresión de los indicadores de Ca2+ en subpoblaciones específicas de células, lo que facilita los análisis a nivel poblacional en preparaciones intactas (por ejemplo, ver16).

Dada la cantidad de herramientas genéticas disponibles en ratones, no debería sorprender que las GECI se hayan utilizado más ampliamente en esta especie. Se han desarrollado líneas de ratón con expresión constitutiva de GECI en subpoblaciones de neuronas sensoriales 7,16,17. Con el desarrollo de líneas de ratón que expresan recombinasas en tipos celulares específicos, es posible utilizar estrategias aún más sofisticadas para controlar la expresión de GECI15. Sin embargo, aunque estas herramientas son cada vez más poderosas, hay una serie de razones por las que otras especies, como las ratas, podrían ser más apropiadas para algunas preguntas experimentales. Estos incluyen el tamaño más grande, lo que facilita una serie de manipulaciones experimentales que son difíciles, si no imposibles, en el ratón más pequeño; la facilidad para entrenar a las ratas en tareas conductuales relativamente complejas; y al menos alguna evidencia de que las propiedades biofísicas y los patrones de expresión de varios canales iónicos en las neuronas sensoriales de rata pueden ser más similares a los observados en las neuronas sensoriales humanas que los mismos canales en ratones en relación con los humanos18.

Mientras que la transducción de estímulos somatosensoriales ocurre generalmente en las terminales periféricas de las aferencias primarias, el potencial de acción iniciado en la periferia debe pasar a través de la estructura que alberga los somas aferentes primarios, denominados ganglios de la raíz dorsal (DRG) o del trigémino (TG) antes de llegar al sistema nervioso central19. Si bien existe evidencia de que no todos los potenciales de acción que se propagan a lo largo de un axón aferente primario invadirán el cuerpo celular20, como consecuencia del hecho de que los somas aferentes primarios están conectados al axón aferente principal a través de una unión en T19, la mayoría de los potenciales de acción iniciados en la periferia parecen invadir el soma21. Esto confiere tres ventajas experimentales cuando se utilizan GECIs para evaluar la codificación de la población en aferencias primarias: el gran tamaño del cuerpo celular en relación con los axones aumenta aún más la señal a ruido cuando se utiliza [Ca2+]i como medida indirecta de la actividad aferente; los DRG son generalmente de fácil acceso; y la evaluación de la actividad en un sitio que está espacialmente alejado de las terminales aferentes minimiza el impacto potencial de la cirugía necesaria para exponer los ganglios en las propiedades de estímulo-respuesta de las terminales aferentes. Sin embargo, debido a que los TG se encuentran debajo del cerebro (o por encima de la paleta), son mucho más difíciles de acceder que los DRG. Además, si bien hay muchas similitudes entre las neuronas DRG y TG, también hay una lista creciente de diferencias. Esto incluye la organización más o menos somatotópica de las neuronas en el TG22, estructuras únicas inervadas, diferentes patrones de terminación terminal central 23,24,25,26, y ahora una lista creciente de diferencias tanto en la expresión génica27,28 como en la expresión del receptor funcional29. Además, debido a que estamos interesados en la identificación de los mecanismos periféricos del dolor, el número relativamente grande de síndromes de dolor que parecen ser exclusivos del sistema trigémino (p. ej., migraña, neuralgia del trigémino, síndrome de boca ardiente) que parecen involucrar actividad aberrante en las aferencias primarias 30,31,32, sugiere que el TG necesita ser estudiado directamente.

Por lo tanto, si bien las propiedades de estímulo-respuesta de las neuronas TG se han estudiado con GECI en el ratón16, debido a que las razones enumeradas anteriormente sugieren que la rata puede ser una especie más apropiada para abordar una variedad de preguntas experimentales, el propósito del presente estudio fue desarrollar un enfoque para usar GECI para estudiar las neuronas TG en la rata. Para lograr esto, utilizamos un enfoque viral para impulsar la expresión de los GECI GCaMP6s en el sistema nervioso periférico. A continuación, extirpamos el prosencéfalo para permitir el acceso al TG. Finalmente, se aplicaron estímulos mecánicos y térmicos en la cara mientras se evaluaban las respuestas neuronales bajo microscopía fluorescente. En conjunto, estos datos respaldan el papel de la utilización de la rata para investigar los cambios en el TG en muchos estados, ampliando el conjunto de herramientas para los investigadores interesados en la codificación sensorial en el sistema trigémino.

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Protocol

Todos los experimentos que involucraron el uso de animales en investigación se realizaron de acuerdo con los estándares establecidos por los Institutos Nacionales de Salud y la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh (protocolo # 22051100). Al final de cada experimento, las ratas fueron sacrificadas a través de la exanguinación con perfusión cardíaca de solución salina tamponada con fosfato helado (PBS), un enfoque aprobado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y la Universidad de Pittsburgh IACUC.

1. Inducción de GCaMP

  1. Ordene ratas Sprague Dawley preñadas para que las crías puedan ser inyectadas en el momento adecuado después del nacimiento.
  2. Rocíe los guantes con un 70% de EtOH antes de manipular cada cachorro de rata. Esto disuadirá a la madre de canibalizar a las crías.
  3. Frotar a las crías de rata (P1-2) con EtOH al 70% y anestesiar con hielo durante 3 min.
  4. Inyecte 15 μL de AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) por vía intraperitoneal con una jeringa Hamilton estéril y hermética a los gases de 25 μL.

2. Cirugía de exposición al ganglio trigémino

  1. Administrar cóctel anestésico (55 mg/kg de ketamina, 5,5 mg/kg de xilacina, 1 mg/kg de acepromazina) por vía intraperitoneal en función del peso corporal a ratas de 6-8 semanas de edad (aproximadamente 150-200 g).
    NOTA: Por lo general, esto es suficiente para mantener un plano quirúrgico de anestesia, según lo evaluado por la ausencia de un reflejo de abstinencia al pellizco nocivo de una pata trasera. Sin embargo, suplementar con isoflurano a través de un cono de nariz si los animales se vuelven ligeros.
  2. Una vez completamente anestesiado, afeita el cabello y los bigotes de la cabeza y la cara.
  3. Monta a la rata en un marco estereotáxico con barras para las orejas y coloca una almohadilla térmica (~37 oC) debajo para mantener la temperatura corporal.
  4. Controle los signos vitales (frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, saturación de oxígeno en sangre) con un oxímetro de ratón o similar.
    NOTA: La temperatura corporal se controla mediante una sonda rectal y se mantiene colocando a las ratas en una manta de agua circulante controlada por retroalimentación.
  5. Coloque una gasa mojada en solución salina helada en la cabeza para contraer los vasos sanguíneos y minimizar el sangrado. Con un bisturí de tamaño 15, haga una incisión en la línea media de la piel y el músculo sobre el cráneo.
  6. Use una disección roma de la piel y el músculo para exponer el cráneo.
  7. Con una broca redonda de 1/4, perfore con cuidado la tapa del cráneo para exponer el prosencéfalo. Luego, use rongeurs (taza de 2,5 mm) para cortar con cuidado el cráneo.
  8. Con un bisturí de tamaño 15, haga una incisión en el cerebro (Bregma: -3,80) y en el bulbo olfatorio.
    NOTA: Cortar más caudalmente más allá de este punto provocará la muerte de la rata
  9. Use una espátula para desconectar cuidadosamente la duramadre del cráneo y levante suavemente el cerebro cortado para revelar el TG y la base del cráneo.
    NOTA: El uso adicional de perfusión salina helada durante la extracción minimizará el sangrado y optimizará el siguiente campo de disección.
  10. Con una pluma de cauterización, detenga cualquier sangrado resultante de la extracción.
    NOTA: Cortar la duramadre provocará un sangrado inevitable. Lo mejor es preparar aCSF helado (119 mM de NaCl, 26,2 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4, 1,3 mM de MgCl2, 10 mM de glucosa, 2,5 mM de CaCl2) para bañar la cavidad del cráneo y ayudar a contraer los vasos sanguíneos mientras se mantiene la salud neuronal.

3. Imágenes GCaMP6s

NOTA: Dado el tamaño y la densidad de estas neuronas, el sistema de imagen y adquisición de datos utilizado (objetivo, microscopio, fuente de luz, cámara) determinará el número de células GECI+ visualizadas. La fuente de luz, el objetivo y la cámara también determinarán los parámetros utilizados para la adquisición de imágenes, incluido el tiempo de exposición y la velocidad de captura de imágenes. Si bien se pueden utilizar técnicas multifotónicas y confocales dependiendo de los parámetros del experimento, la microscopía de epifluorescencia puede ser suficiente para resolver muchas células. Se puede utilizar cualquier paquete de adquisición de imágenes. Idealmente, la aplicación de estímulo está bloqueada en el tiempo con el paquete de software de adquisición de imágenes.

  1. Coloque la cavidad del cráneo debajo del objetivo y enfoque el TG con luz visible.
  2. La longitud de onda de excitación de GCaMP6s es de 496 nm y su longitud de onda de emisión es de 513 nm; por lo tanto, utilice los cubos dicroicos y de filtro adecuados para localizar las células GCaMP+ . Ajustar el enfoque para localizar y resolver el área de los ganglios en la que las neuronas responden a los estímulos aplicados al campo receptivo de interés.
  3. Utilice un objetivo de 10x para permitir la visualización de la mayoría de las neuronas en el TG que responden a estímulos mecánicos aplicados a una región de 1cm2 de la cara16. Utilice un objetivo seco de 20x con una distancia de trabajo larga (10,8 mm) para aumentar la resolución.
  4. Utilice un software de adquisición (por ejemplo, Metamorph) para recopilar datos de fluorescencia a lo largo del tiempo y en respuesta a la aplicación de estímulos.
    1. Para minimizar el fotoblanqueo de las neuronas, utilice el menor tiempo de exposición posible para detectar los aumentos de fluorescencia de referencia y evocados. Con el objetivo aéreo de 20x y 0,40 NA, una fuente de luz de halogenuros de mercurio de 120 W y una cámara complementaria de semiconductores de óxido metálico (CMOS) utilizados en el presente estudio, un tiempo de exposición de 300 ms y una tasa de adquisición de imágenes de 3 Hz, se obtienen grabaciones de referencia estables durante >90 min.
      NOTA: 1) Estos parámetros de adquisición de imágenes deben determinarse empíricamente. 2) Al campo receptivo se le pueden aplicar mecánicas (cepillo, punteado, vibración, pellizco), térmicas (calor y frío) y químicas (capsaicina, mentol, mediadores inflamatorios). Un enfoque subjetivo relativamente barato es aplicar los estímulos a mano. Sin embargo, se recomiendan enfoques más objetivos y reproducibles, en los que se pueden utilizar actuadores controlados por retroalimentación para aplicaciones repetidas a una fuerza conocida. Si bien los dispositivos Peltier controlados por retroalimentación son útiles para el calentamiento y enfriamiento controlados, no son ideales para la estimulación térmica de una cara curva. Las fuentes de luz infrarroja controladas por retroalimentación son una alternativa para la calefacción, y la pulverización fría es una alternativa menos que ideal para la refrigeración.

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Representative Results

Debido a que anteriormente hemos tenido éxito con el serotipo AAV9 para la infección de neuronas sensoriales de rata15, utilizamos este serotipo para la expresión de GCaMP6s en neuronas TG de rata. Por lo tanto, primero buscamos evaluar la eficiencia de la infección neuronal sensorial de AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) cuando este virus se administró a crías de ratas neonatas20. Este virus utiliza el promotor CAG, que impulsa y mantiene altos niveles de expresión génica. Además, se ha demostrado que AAV9 infecta eficazmente las neuronas sensoriales cuando se administra a ratas neonatas33. Las primeras inyecciones utilizaron 5 μL en las crías del día 5 (p5) posnatales, lo que resultó en una eficiencia de aproximadamente 51,66% ± 14,33% (Figura 1A). Para aumentar la tasa de infección, finalmente utilizamos un mayor volumen de virus (15 μL) en ratas más jóvenes (p2), manteniendo el título del virus de 2,4 x 1014 igual. Esta estrategia dio como resultado que el 91,84% ± el 3,18% (n = 8) de neuronas se infectaran (Figura 1B).

Para visualizar las neuronas TG que inervan la almohadilla vibrissal, desarrollamos una estrategia quirúrgica para exponer la TG in vivo. Aproximadamente el 60% del prosencéfalo se puede extirpar sin afectar a los principales centros respiratorios. Esto corresponde al tejido cerebral rostral a Bregma -3,80. En la Figura 2 se muestra un esquema del TG expuesto (izquierda) y el territorio de inervación del nervio infraorbitario (ION, derecha). La región del TG que da lugar a la inervación de la almohadilla vibratoria se determinó con la aplicación de estimulación mecánica de luz (cepillo) a la almohadilla vibratoria mientras se monitoreaban los cambios en la fluorescencia a 20x. Como se predijo, la región V2 del TG, que inerva la división maxilar de la cara, fue la única área activada. Es decir, aunque no se estudiaron de forma sistemática, no se detectaron cambios en la fluorescencia en respuesta a estímulos aplicados a las regiones V1 (piel de la frente) o V3 (piel de la mandíbula) cuando las neuronas en estudio pudieron activarse con estímulos aplicados a la almohadilla vibrissal. A continuación, se monitorizaron los cambios en la fluorescencia al inicio y en respuesta a los estímulos aplicados a la almohadilla vibratoria. La región de interés (V2) está demarcada en la Figura 3A. De acuerdo con informes previos de niveles relativamente bajos de actividad en reposo en neuronas sensoriales34, la fluorescencia en reposo fue relativamente baja en la mayoría de las neuronas, y hubo poca evidencia de aumentos espontáneos en la fluorescencia (Figura 3B). El criterio utilizado para identificar la actividad evocada por estímulos en las neuronas de la periferia 6,16,21 y el SNC 12,35,36 es un campo en evolución con varios paquetes de flujo de trabajo sofisticados que se han puesto a disposición de forma gratuita 37,38. Una discusión completa de las fortalezas y debilidades de los diversos enfoques empleados está más allá del alcance del presente manuscrito. Como este no era el enfoque del presente estudio, utilizamos criterios relativamente arbitrarios y subjetivos basados en la respuesta máxima observada en regiones de los ganglios en las que no había neuronas claramente detectables (basadas en la capacidad de ver el núcleo), de modo que se consideraba que una neurona respondía a un estímulo si el aumento de la fluorescencia estaba bloqueado en el tiempo con la aplicación del estímulo (aumento de la fluorescencia detectado dentro de 1 s de la aplicación del estímulo ( basado en la suposición de que un potencial de acción iniciado en los axones conductores más lentos (0,2 m/s) iniciado en un sitio a no más de 3 cm del cuerpo celular debería alcanzar el cuerpo celular en menos de un segundo), y fue >6 veces la desviación estándar de la respuesta máxima (ΔF/F) detectó un sitio de control (Figura 3C). A continuación, caracterizamos las propiedades de respuesta de estas neuronas a estímulos naturales: rozar, puntear, calor y frío. En la Figura 4 se muestran ejemplos de respuestas a cada uno de estos estímulos. En particular, la respuesta a la estimulación punteada, que se utiliza con mayor frecuencia en los estudios relacionados con el dolor, tiene la respuesta más robusta (Figura 4B, F).

Nuestro objetivo al desarrollar esta técnica era poder evaluar los cambios en la codificación poblacional de las neuronas TG. Por lo tanto, adaptamos la lesión crónica por constricción al ION (CCI-ION), como se empleó anteriormente29, para estudiar ratas 2 semanas después de la lesión nerviosa. Tras la inducción del modelo, se expuso el TG y se evaluó la actividad en reposo y evocada en TG ipsilateral y contralateral al sitio de la lesión. Curiosamente, la magnitud de la respuesta máxima evocada al cepillo se incrementó ~ 2 veces en el lado lesionado por el nervio en relación con la respuesta máxima al mismo estímulo aplicado al lado contralateral (Figura 5A-C). Además, cuando se aplicaron dos estímulos de cepillo en serie (con un intervalo entre estímulos de 10 s), hubo una amplificación significativa de la magnitud de la respuesta al segundo estímulo en el lado lesionado pero no lesionado (Figura 5D).

Finalmente, como experimento de control inicial para confirmar que el aumento de fluorescencia evocado por el estímulo se debía a potenciales de acción iniciados en la periferia, evaluamos el impacto de la tetrodotoxina (1 μM) en las respuestas evocadas por el estímulo. TTX se inyectó en un volumen de 200 μL por vía percutánea como se describió anteriormente28 para dirigirse al nervio infraorbitario. Como se muestra en la Figura 6, la actividad evocada se eliminó casi por completo. En conjunto, estos resultados demuestran la utilidad del uso de AAV9-GCaMP para interrogar las respuestas de la población TG in vivo.

Figure 1
Figura 1: Alta eficiencia de la infección por GCaMP6s en neuronas TG con inyección neonatal de AAV. (A) A las crías de rata P5 se les inyectaron 5 μL de virus pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (título: 2,4 x 1014) por vía intraperitoneal: se detectó expresión de GCaMP6s en el 51,7 ± el 14,3% de las neuronas TG (n = 3 cortes por animal, 7 ratas). (B) El aumento del volumen de inyección a 15 μL en animales más jóvenes (p2) mejoró la eficiencia de la infección: la expresión de GCaMP6s se detectó en el 91,8 ± el 3,2% de las neuronas TG (n = 3 cortes por animal, 8 ratas). Los paneles de la izquierda se tiñeron para los GCaMP6. Los paneles en el medio se tiñeron con NeuN, un marcador específico de la neurona. Los paneles de la derecha son una imagen combinada de los paneles GCaMP6s y NeuN. La barra de escala del primer panel es la misma para todos los paneles posteriores. El gráfico de la derecha es un gráfico de la expresión de GCaMP6s (media ± SEM) como porcentaje del número total de neuronas por corte por animal, donde los puntos individuales son los datos de cada animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Localización del ganglio trigémino (TG), el nervio infraorbitario (ION) y el área de la cara (almohadilla vibrissal) estimulada. (A) Se extirpó el prosencéfalo para permitir el acceso al TG. (B) Área de la cara en la que se aplicaron estímulos naturales en relación con el ION y el TG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Aumento de la fluorescencia de GCaMP6s evocada por estímulos. (A) Campo visual total con un aumento de 20x. Están indicadas las divisiones oftálmica (V1) y maxilar (V2) del TG. (B,C) La región de la caja se muestra en los paneles B y C, que son imágenes de fluorescencia antes y después de la estimulación con cepillo de la almohadilla vibratoria, respectivamente. Los círculos blancos son regiones de interés de comparación. Se consideró que las neuronas respondían a un estímulo en función del cambio máximo de fluorescencia observado en las regiones de interés de comparación, tal y como se describe en el texto. La barra de escala del primer panel es la misma para ambos paneles. (D) Cambios representativos en la fluorescencia de las neuronas que se muestran en B y C en respuesta a un estímulo de pincel aplicado a la cara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Clasificación de las neuronas en función de su respuesta a los estímulos aplicados a la cara. Imágenes representativas de las neuronas TG antes (paneles superiores - Línea de base) y después (panel central - Estimulación) de las respuestas a un cepillo de pelo de camello de 1 cm (A - Cepillo), rejilla de 1 cm2 de monofilamentos (B - Punteado), calentamiento (C - Calor) y enfriamiento (D - Frío) aplicados a la misma región de la cara. La barra de escala del primer panel es la misma para todos los paneles posteriores. Los círculos naranjas denotan un ejemplo de una neurona receptiva. Los círculos blancos son regiones de interés de comparación. (E-H) Trazos representativos de cada respuesta por estímulo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La lesión nerviosa aumenta las respuestas evocadas por el cepillo en las neuronas TG. Respuestas típicas de las neuronas TG al cepillado aplicado dos veces a la cara de la rata en el lado contralateral a una lesión crónica por constricción del nervio infraorbitario (A, Contra) o en el lado ipsilateral a la lesión nerviosa (B, Ipsi). (C) El análisis de los datos agrupados de las neuronas receptivas de seis ratas (los datos trazados son por rata) confirmó que la diferencia en la magnitud de la primera respuesta al cepillado fue significativa (prueba t pareada). (D) Cuando se analizó la respuesta máxima a la primera y segunda aplicación de estímulo como una relación (R2/R1), el análisis de los datos agrupados confirmó que el aumento en la proporción de respuesta en el lado lesionado por el nervio fue significativo. ** p < 0.01 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Bloqueo de la actividad evocada en neuronas TG con tetrodotoxina (TTX). (A) Datos de fluorescencia de neuronas TG ipsilaterales a una lesión nerviosa después de la inyección de TTX (200 μL, 1 μM) adyacente al nervio infraorbitario después de la aplicación de un estímulo de cepillo (barra azul). (B) Datos agrupados de respuesta máxima de tres ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, demostramos una forma rápida y no invasiva de generar una rata GECI para obtener imágenes del TG. Elegimos un promotor CAG para impulsar y mantener altos niveles de expresión génica. Si bien estudios previos sugieren que otros serotipos de AAV pueden impulsar eficientemente la expresión génica en las neuronas DRG39, nuestros resultados son consistentes con un estudio reciente que involucra la inyección intraperitoneal de AAV en neonatos32, lo que indica que el serotipo AAV9 es altamente eficiente en la infección de neuronas sensoriales neonatales de ratas.

A través de la solución de problemas de esta técnica, vale la pena señalar algunos escollos que pueden prevenir una infección óptima. La principal variable a tener en cuenta es la edad de los cachorros. El sistema nervioso de la rata se desarrolla rápidamente durante los primeros 7 días postnatales40. Intentamos infecciones en puntos de tiempo posteriores (p. ej., p4-7), lo que resultó en una eficiencia variable y deficiente. Los puntos de tiempo más tempranos (p1-4) producen una eficiencia más robusta y consistente, y p1-2 produce las tasas de infección más altas. La segunda variable es el volumen de inyección. Independientemente de la edad, se requirió un mínimo de 15 μL para producir una eficiencia superior al 70% en el TG o DRG con un título de 2,5 x 1014. Encontramos que, incluso en p2, las inyecciones intraperitoneales de menos de 10 μL producen muy poca expresión en el adulto. Es posible que inyecciones más localizadas, es decir, directamente en el campo receptivo de interés, a volúmenes más bajos produzcan efectos similares. Sin embargo, este enfoque requeriría que los cachorros estén completamente anestesiados y puede causar un traumatismo en el tejido de interés. Por último, es posible que se puedan utilizar volúmenes más pequeños con títulos más altos.

La exposición del TG para la obtención de imágenes de GECI se ha realizado previamente en ratones16. Sin embargo, la traducción de este enfoque a la rata reveló varios problemas que vale la pena considerar. En primer lugar, el grosor del cráneo y la duramadre en la rata es mucho mayor que en un ratón. Por lo tanto, quitarse el casquete craneal puede plantear desafíos. Descubrimos que un pequeño taladro es una forma efectiva de perforar la tapa del cráneo, que luego se puede quitar con rongeurs. Un segundo problema es el sangrado una vez que se ha extirpado el cerebro. Esto puede ser un problema continuo tanto para la longevidad de la preparación como para la claridad de las imágenes, si no para las propiedades de las neuronas. Se puede aplicar una gasa humedecida en líquido cefalorraquídeo helado a la superficie expuesta del cerebro para ayudar a cerrar las arterias principales. El uso de una pequeña pluma de cauterización también puede ser eficaz para detener el sangrado adicional. Por último, la espuma de gel situada en el lado contralateral de la ventana de imagen también puede ayudar a evitar que la sangre y el líquido cefalorraquídeo causen problemas de imagen. Una tercera consideración es la cantidad de cerebro que se va a extirpar. Descubrimos que la extirpación de la caudal cerebral a ~Bregma -3.80 provocará la muerte dentro de una hora después de la extracción. Por lo tanto, el cerebro debe ser extirpado en pequeñas secciones, conservando tanto como sea posible mientras se expone la mayor cantidad posible de TG.

Como se señaló en la Introducción, [Ca2+]i es una medida indirecta de la actividad neuronal y, en consecuencia, un aumento en [Ca2+]i no significa necesariamente que haya un aumento en la actividad neuronal. Por lo tanto, los experimentos de control son fundamentales para confirmar que lo que se considera actividad evocada es en realidad actividad per se. Por ejemplo, los estímulos evocados eléctricamente deberían producir un aumento bloqueado en el tiempo en [Ca2+]i, que está en una escala similar a la de los estímulos evocados naturalmente. Es importante destacar que esta actividad debe eliminarse con el bloqueo del nervio (es decir, TTX). Sin embargo, también es importante tener en cuenta que, a pesar de estos importantes controles, todavía es posible que algunos de los aumentos aparentemente evocados en [Ca2+]i se deban a la señalización dentro de los ganglios, por ejemplo, debido a la liberación del transmisor dentro de los ganglios41, en lugar de debido a un potencial de acción iniciado en la periferia que ha invadido el soma celular.

Si bien nuestros resultados confirman que los investigadores anteriores 16,42,43 indican que la relación señal-ruido asociada con los cambios en la fluorescencia de GCaMP en somata sensorial es suficiente para su uso con un microscopio de epifluorescencia estándar, manipulaciones como la lesión nerviosa utilizada en el presente estudio pueden estar asociadas con cambios tan dramáticos en la actividad neuronal y la señalización de Ca2+ 34, que las respuestas a lo largo de los ganglios pueden estar asociadas con un aumento tan grande en el fondo aparente, que las respuestas de las neuronas individuales pueden atenuarse artificialmente. Si bien se han desarrollado enfoques de procesamiento de imágenes que pueden ayudar a abordar esta limitación44, es posible que se necesiten imágenes confocales o multifotónicas para resolver este problema de manera más efectiva.

En conjunto, esta técnica proporciona un enfoque para investigar las propiedades de estímulo-respuesta de las neuronas TG en la rata a nivel poblacional. Nuestros resultados con el CCI del ION confirman la viabilidad de detectar cambios en estas propiedades estímulo-respuesta. Si bien en el presente estudio solo se emplearon estímulos mecánicos y térmicos, esta preparación debe ser susceptible de la aplicación de estímulos químicos para definir completamente las propiedades de estímulo-respuesta de las neuronas TG. Del mismo modo, si bien nos centramos en las propiedades estímulo-respuesta de las aferencias cutáneas, debido a la aparición de fenómenos como la alodinia mecánica dinámica después de una lesión traumática de un nervio cutáneo, también debería ser posible detectar cambios en las propiedades de las aferencias que inervan otras estructuras craneofaciales como la articulación temporomandibular (en respuesta a movimientos mandibulares inocuos frente a nocivos). córnea o lengua. La inyección periférica del serotipo AAV9 permite la inducción neuronal específica de GCaMP que es específica del SNP. Un beneficio importante de esta estrategia es que el marcaje viral proporciona una expresión robusta y persistente en las células postmitóticas (es decir, las neuronas), pero no en las células mitóticas (por ejemplo, las células epiteliales). Además, el cribado preliminar de diferentes tejidos del SNP indica que esta estrategia viral puede utilizarse para investigar los ganglios para/simpáticos, el DRG y los sistemas nerviosos entéricos (datos no mostrados).

Esta preparación in vivo también proporciona la base para explorar muchas comparaciones que faltan en la literatura actual. Todavía no se han realizado estudios poblacionales in vivo entre TG de rata y GRD, TG de rata vs. TG de ratón. Los datos aquí presentados ilustran la nueva viabilidad de la realización de estos importantes experimentos.

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Disclosures

El Dr. Gold recibió una beca de Grünenthal durante el desarrollo de esta preparación. No hubo superposición entre el enfoque del estudio de Grünenthal y la preparación descrita en este manuscrito. Ninguno de los otros autores tiene ningún otro conflicto de intereses potencial que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a los doctores Kathy Albers y Brian Davis por el uso de su microscopio Leica y su programa Metamorph, a Charles Warwick por ayudar a construir nuestro dispositivo térmico Peltier y al Dr. Raymond Sekula por ayudar a solucionar problemas de preparación quirúrgica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) y R01NS122784 (MSG y RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

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References

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Neurociencia Número 204
<em>En vivo</em> Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata
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Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

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