Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Kalciumavbildning av sensoriska neuroner i råttans trigeminusganglion

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) möjliggör en robust analys på populationsnivå av sensorisk neuronsignalering. Här har vi utvecklat ett nytt tillvägagångssätt som möjliggör in vivo GECI-visualisering av neuronaktivitet hos trigeminusganglier hos råtta.

Abstract

Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) möjliggör avbildningstekniker för att övervaka förändringar i intracellulärt kalcium i riktade cellpopulationer. Deras stora signal-brusförhållande gör GECI:er till ett kraftfullt verktyg för att detektera stimulusframkallad aktivitet i sensoriska neuroner. GECI underlättar analys på populationsnivå av stimulus som kodar för antalet neuroner som kan studeras samtidigt. Den här populationskodningen görs lämpligast in vivo. Dorsalrotsganglierna (DRG), som hyser soma av sensoriska neuroner som innerverar somatiska och viscerala strukturer under nacken, används mest i stor utsträckning för in vivo-avbildning eftersom dessa strukturer är relativt lätta att komma åt. På senare tid har denna teknik använts på möss för att studera sensoriska nervceller i trigeminusgangliet (TG) som innerverar orala och kraniofaciala strukturer. Det finns många skäl att studera TG utöver DRG, inklusive den långa listan över smärtsyndrom som är specifika för orala och kraniofaciala strukturer som verkar återspegla förändringar i sensorisk neuronaktivitet, såsom trigeminusneuralgi. Möss används mest i stor utsträckning i studier av DRG- och TG-neuroner på grund av tillgången på genetiska verktyg. Men med skillnader i storlek, enkel hantering och potentiellt viktiga artskillnader finns det skäl att studera TG-neuroner från råttor snarare än möss. Således utvecklade vi ett tillvägagångssätt för att avbilda TG-neuroner från råttor in vivo. Vi injicerade neonatala valpar (p2) intraperitonealt med en AAV-kodande GCaMP6s, vilket resulterade i >90% infektion av både TG- och DRG-neuroner. TG visualiserades hos den vuxne efter kraniotomi och decortication, och förändringar i GCaMP6s fluorescens observerades i TG-neuroner efter stimulering av underkäks- och maxillära regioner i ansiktet. Vi bekräftade att ökningar av fluorescens framkallades av stimulus vid perifer nervblockad. Även om detta tillvägagångssätt har många potentiella användningsområden, använder vi det för att karakterisera subpopulationen (erna) av TG-neuroner som förändrats efter perifer nervskada.

Introduction

Somatosensation, den neurala kodningen av mekaniska, termiska och kemiska stimuli som påverkar huden eller andra kroppsstrukturer, inklusive muskler, ben och inälvor, börjar med aktivitet i primära afferenta neuroner som innerverar dessa strukturer1. Elektrofysiologiska metoder baserade på en enhet har gett en mängd information om de afferenta subtyper som är involverade i denna process samt hur deras stimulus-responsegenskaper kan förändras över tid 1,2,3. Men även om det fortfarande finns starka bevis till stöd för teorin om märkta linjer, som föreslår att specifika sensoriska modaliteter förmedlas av specifika subpopulationer av neuroner, tyder förmågan hos många subpopulationer av neuroner att svara på samma typer av mekaniska, termiska och kemiska stimuli på att majoriteten av somatosensoriska stimuli kodas av flera subpopulationer av neuroner4, 5. veckor Således kommer en bättre förståelse av somatosensation endast att komma med möjligheten att studera aktiviteten hos 10-tals, om inte hundratals, neuroner samtidigt.

Framsteg inom optiska metoder med den relativt nya tillkomsten av konfokala och därefter multifoton- och digitala avbildningstekniker har underlättat möjligheten att utföra relativt icke-invasiva populationsnivåanalyser av neuronal aktivitet 6,7. Ett av de sista hindren i tillämpningen av denna teknik har varit utvecklingen av verktyg för att möjliggöra optisk bedömning av neural aktivitet. Med tanke på hastigheten hos en aktionspotential som kan börja och sluta på mindre än en millisekund, skulle ett spänningskänsligt färgämne med kapacitet att följa förändringar i membranpotentialen med hastigheten av en aktionspotential vara det perfekta verktyget för detta ändamål. Men även om det har skett enorma framsteg inom detta område 7,8,9,10, är signal-brusförhållandet för många av dessa färgämnen fortfarande inte tillräckligt högt för att möjliggöra en populationsanalys av hundratals neuroner på encellsnivå. Som ett alternativt tillvägagångssätt har utredarna vänt sig till att övervaka förändringar i intracellulär Ca2+-koncentration ([Ca2+]i). Begränsningarna med denna strategi har varit tydliga från början och inkluderar det faktum att en ökning av [Ca2+]i är ett indirekt mått på neural aktivitet11; att en ökning av [Ca2+]i kan inträffa oberoende av Ca2+-inflöde i samband med aktivering av spänningsstyrda Ca2+-kanaler (VGCC)12,13; att storleken och varaktigheten av en Ca2+-transient kan styras av processer som är oberoende av VGCC-aktivitet 11,12,14; och att tidsförloppet för Ca2+ transienter vida överstiger det för en aktionspotential15. Ändå finns det ett antal betydande fördelar förknippade med användningen av Ca2+ som ett indirekt mått på neural aktivitet. Inte minst av dessa är signal-brusförhållandet som är associerat med de flesta Ca2+-indikatorer, vilket återspeglar både storleken på förändringen i intracellulärt Ca2+ och det faktum att signalen härrör från cytosolens tredimensionella utrymme snarare än cellmembranets tvådimensionella utrymme. Dessutom, med utvecklingen av genetiskt kodade Ca2+-indikatorer (GECI), är det möjligt att dra nytta av genetiska strategier för att driva uttrycket av Ca2+-indikatorerna i specifika subpopulationer av celler, vilket underlättar analyser på populationsnivå i intakta preparat (t.ex. se16).

Med tanke på det antal genetiska verktyg som nu finns tillgängliga på möss borde det inte vara någon överraskning att GECI:er har använts mest i denna art. Muslinjer med konstitutivt GECI-uttryck i subpopulationer av sensoriska neuroner har utvecklats 7,16,17. Med utvecklingen av muslinjer som uttrycker rekombinaser i specifika celltyper är det möjligt att använda ännu mer sofistikerade strategier för att kontrollera GECI-uttryck15. Men även om dessa verktyg blir allt kraftfullare finns det ett antal skäl till varför andra arter, som råttor, kan vara mer lämpliga för vissa experimentella frågor. Dessa inkluderar den större storleken, vilket underlättar ett antal experimentella manipulationer som är svåra, om inte omöjliga, i den mindre musen; hur lätt det är att träna råttor i relativt komplexa beteendeuppgifter; och åtminstone vissa bevis för att biofysiska egenskaper och uttrycksmönster för flera jonkanaler i sensoriska neuroner hos råttor kan vara mer lika de som observerats i mänskliga sensoriska neuroner än samma kanaler i mus i förhållande till de mänskliga18.

Medan transduktionen av somatosensoriska stimuli i allmänhet sker i de perifera terminalerna av primära afferenter, måste aktionspotentialen som initieras i periferin passera genom strukturen som rymmer primära afferenta somata, kallad dorsal rot (DRG) eller trigeminusganglier (TG) innan den når det centrala nervsystemet19. Även om det finns bevis för att inte alla aktionspotentialer som fortplantar sig längs en primär afferent axon kommer att invadera cellkroppen20, en konsekvens av det faktum att de primära afferenta somata är anslutna till den huvudsakliga afferenta axonen via en T-övergång19, verkar majoriteten av aktionspotentialerna som initieras i periferin invadera soma21. Detta ger tre experimentella fördelar vid användning av GECI för att bedöma populationskodning i primära afferenter: den stora storleken på cellkroppen i förhållande till axonerna ökar ytterligare signalen till brus när man använder [Ca2+]i som ett indirekt mått på afferent aktivitet; DRG är i allmänhet lätta att komma åt. Och genom att bedöma aktiviteten på en plats som är rumsligt avlägsen från de afferenta terminalerna minimeras den potentiella effekten av den kirurgi som behövs för att exponera ganglierna på stimulus-responsegenskaperna hos de afferenta terminalerna. Men eftersom TG finns under hjärnan (eller ovanför paletten) är de mycket svårare att komma åt än DRG. Dessutom, även om det finns många likheter mellan DRG- och TG-neuroner, finns det också en växande lista över skillnader. Detta inkluderar den grovt somatotopiska organisationen av neuroner i TG22, unika strukturer som innerveras, olika centrala terminala termineringsmönster 23,24,25,26, och nu en växande lista över skillnader i både genuttryck27,28 och funktionellt receptoruttryck29. Dessutom, eftersom vi är intresserade av att identifiera perifera mekanismer för smärta, tyder det relativt stora antalet smärtsyndrom som verkar vara unika för trigeminussystemet (t.ex. migrän, trigeminusneuralgi, brännande munsyndrom) som verkar involvera avvikande aktivitet i primära afferenter 30,31,32, på att TG måste studeras direkt.

Således, medan stimulus-responsegenskaper hos TG-neuroner har studerats med GECIs i mus16, eftersom de skäl som anges ovan tyder på att råttan kan vara en mer lämplig art för att ta itu med en mängd olika experimentella frågor, var syftet med denna studie att utveckla ett tillvägagångssätt för att använda GECIs för att studera TG-neuroner hos råtta. För att uppnå detta använde vi ett viralt tillvägagångssätt för att driva uttrycket av GECI GCaMP6s i det perifera nervsystemet. Vi tog sedan bort framhjärnan för att ge tillgång till TG. Slutligen applicerades mekaniska och termiska stimuli på ansiktet medan neuronala svar bedömdes under fluorescerande mikroskopi. Tillsammans stöder dessa data en roll för att använda råttan för att undersöka förändringar i TG under många stater, vilket utökar verktygslådan för forskare som är intresserade av sensorisk kodning i trigeminussystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment som involverar användning av djur i forskning utfördes i enlighet med standarder som lagts fram av National Institutes of Health och International Association for the Study of Pain och godkändes av University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll #22051100). I slutet av varje experiment avlivades råttor genom exanguination med hjärtperfusion av iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS), ett tillvägagångssätt som godkänts av American Veterinary Medical Association och University of Pittsburgh IACUC.

1. GCaMP-induktion

  1. Beställ tidsdräktiga Sprague Dawley-råttor så att ungarna kan injiceras vid lämplig tidpunkt efter födseln.
  2. Spraya handskarna med 70 % EtOH innan du hanterar varje råttunge. Detta kommer att avskräcka modern från att kannibalisera på ungarna.
  3. Svabb råttungar (P1-2) med 70% EtOH och bedöva på is i 3 min.
  4. Injicera 15 μl AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) intraperitonealt med en 25 μL steril, gastät Hamilton-spruta.

2. Exponeringskirurgi för trigeminusgangli

  1. Administrera anestesicocktail (55 mg/kg ketamin, 5,5 mg/kg xylazin, 1 mg/kg acepromazin) intraperitonealt baserat på kroppsvikt till 6-8 veckor gamla råttor (cirka 150-200 g).
    OBS: Detta är i allmänhet tillräckligt för att upprätthålla ett kirurgiskt anestesiplan bedömt av frånvaron av en tillbakadragande reflex till skadlig nypa av en baktass. Komplettera dock med isofluran via en noskon om djuren blir lätta.
  2. När du är helt sövd, raka håret och morrhåren på huvudet och ansiktet.
  3. Montera råttan på en stereotaktisk ram med öronstänger och placera en värmedyna (~37 oC) under för att bibehålla kroppstemperaturen.
  4. Övervaka vitala tecken (hjärtfrekvens, andningsfrekvens, syremättnad i blodet) med en musoximeter eller liknande.
    OBS: Kroppstemperaturen övervakas av en rektal sond och upprätthålls genom att placera råttor på en återkopplingskontrollerad cirkulerande vattenfilt.
  5. Placera gasbinda doppad i iskall koksaltlösning på huvudet för att dra ihop blodkärlen för att minimera blödning. Använd en skalpell i storlek 15 och gör ett snitt i mitten av huden och muskeln över skallen.
  6. Använd trubbig dissektion av hud och muskler för att exponera skallen.
  7. Använd en 1/4 rund borr och perforera försiktigt skallelocket för att exponera framhjärnan. Använd sedan rongeurs (2,5 mm kopp) för att försiktigt skära igenom skallen.
  8. Använd en skalpell i storlek 15 och gör ett snitt i hjärnan (Bregma: -3,80) och luktbulben.
    OBS: Att klippa mer kaudalt förbi denna punkt kommer att resultera i råttdöd
  9. Använd en spatel för att försiktigt koppla bort dura från skallen och lyft försiktigt den avskurna hjärnan för att avslöja TG och skallbasen.
    OBS: Ytterligare användning av iskall koksaltlösning perfusion under hela extraktionen kommer att minimera blödning och optimera följande dissektionsfält.
  10. Använd en kauterpenna för att stoppa eventuell blödning till följd av extraktionen.
    OBS: Att skära dura kommer att resultera i oundviklig blödning. Det är bäst att förbereda iskall aCSF (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glukos, 2,5 mM CaCl2) för att bada skallhålan för att hjälpa till att dra ihop blodkärlen samtidigt som neuronal hälsa bibehålls.

3. GCaMP6s-avbildning

OBS: Med tanke på storleken och densiteten hos dessa neuroner kommer det avbildnings- och datainsamlingssystem som används (objektiv, mikroskop, ljuskälla, kamera) att avgöra antalet visualiserade GECI+ -celler. Ljuskällan, objektivet och kameran kommer också att bestämma parametrarna som används för bildtagning, inklusive exponeringstid och bildtagningshastighet. Medan multifoton- och konfokaltekniker kan användas beroende på experimentets parametrar, kan epifluorescensmikroskopi vara tillräckligt för att lösa upp många celler. Alla bildinsamlingspaket kan användas. Helst är stimulusapplikationen tidslåst med mjukvarupaketet för bildförvärv.

  1. Placera skallhålan under objektivet och fokusera TG med hjälp av synligt ljus.
  2. Excitationsvåglängden för GCaMP6s är 496 nm och dess emissionsvåglängd är 513 nm; Använd därför lämpliga dikroiska kuber och filterkuber för att hitta GCaMP+ -celler. Justera fokus för att lokalisera och lösa upp det område av ganglierna där neuroner svarar på stimuli som appliceras på det receptiva intressefältet.
  3. Använd ett 10x-objektiv för att möjliggöra visualiseringar av de flesta neuroner i TG som reagerar på mekaniska stimuli som appliceras på en 1 cm2-region i ansiktet16. Använd ett 20x torrt objektiv med långt arbetsavstånd (10.8 mm) för att öka upplösningen.
  4. Använda insamlingsprogramvara (t.ex. Metamorph) för att samla in fluorescensdata över tid och som svar på stimulusapplicering.
    1. För att minimera fotoblekning av neuronerna, använd så kort exponeringstid som möjligt för att upptäcka baslinje och framkallade ökningar av fluorescens. Med 20x, 0,40 NA luftobjektiv, en 120 W kvicksilverhalogenidljuskälla och en komplementär metalloxidhalvledarkamera (CMOS) som används i den aktuella studien, en exponeringstid på 300 ms och en bildinsamlingshastighet på 3 Hz, får man stabila baslinjeinspelningar i >90 minuter.
      OBS: 1) Dessa bildtagningsparametrar måste bestämmas empiriskt. 2) Mekanisk (borsta, punktera, vibrationer, nypa), termisk (värme och kyla) och kemisk (capsaicin, mentol, inflammatoriska mediatorer) kan appliceras på det receptiva fältet. Ett relativt billigt subjektivt tillvägagångssätt är att applicera stimuli för hand. Mer objektiva och reproducerbara tillvägagångssätt rekommenderas dock där återkopplingsstyrda ställdon kan användas för upprepad applicering vid en känd kraft. Även om återkopplingsstyrda Peltier-enheter är användbara för kontrollerad uppvärmning och kylning, är de inte idealiska för termisk stimulering av ett böjt ansikte. Återkopplingsstyrda infraröda ljuskällor är ett alternativ för uppvärmning, och kall spray är ett mindre bra alternativ för kylning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eftersom vi tidigare har haft framgång med AAV9-serotypen för infektion av sensoriska nervceller hos råtta15, använde vi denna serotyp för uttryck av GCaMP6 i TG-neuroner hos råtta. Vi försökte därför först bedöma effektiviteten av sensoriska neuroninfektioner hos AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) när detta virus administrerades till neonatala råttungar20. Detta virus använder CAG-promotorn, som driver och upprätthåller höga nivåer av genuttryck. Dessutom har AAV9 visat sig effektivt infektera sensoriska nervceller när det administreras till neonatala råttor33. De första injektionerna använde 5 μL hos postnatala dag 5 (p5) ungar, vilket resulterade i cirka 51,66 % ± 14,33 % effektivitet (Figur 1A). För att öka infektionsfrekvensen använde vi så småningom en större volym virus (15 μL) hos yngre råttor (p2), vilket gjorde att virustitern på 2,4 x 1014 var densamma. Denna strategi resulterade i 91,84 % ± 3,18 % (n = 8) av de infekterade nervcellerna (figur 1B).

För att visualisera TG-neuronerna som innerverar den vibrisala dynan, utvecklade vi sedan en kirurgisk strategi för att exponera TG in vivo. Cirka 60 % av framhjärnan kan tas bort utan att det påverkar större andningscentra. Detta motsvarar hjärnvävnad rostral till Bregma -3,80. En schematisk bild av den exponerade TG (vänster) och innervationsterritoriet för den infraorbitala nerven (ION, höger) visas i figur 2. Den del av triglyceriden som ger upphov till innervationen av den vibrisala dynan bestämdes med applicering av lätt mekanisk stimulering (borste) på den vibrisala dynan samtidigt som förändringar i fluorescens övervakades vid 20x. Som förutspått var V2-regionen i TG, som innerverar överkäksdelningen i ansiktet, det enda området som aktiverades. Det vill säga, även om det inte studerades systematiskt, upptäcktes inga förändringar i fluorescens som svar på stimuli applicerade på V1 (hud på pannan) eller V3 (hud på underkäken) regioner när neuronerna som studerades kunde aktiveras med stimuli applicerade på vibrissaldynan. Förändringar i fluorescens vid baslinjen och som svar på stimuli applicerade på vibrissaldynan övervakades sedan. Intresseområdet (V2) är avgränsat i figur 3A. I överensstämmelse med tidigare rapporter om relativt låga nivåer av viloaktivitet i sensoriska neuroner34, var vilofluorescensen relativt låg i de flesta neuroner, och det fanns få tecken på spontana ökningar av fluorescens (Figur 3B). Kriterierna som används för att identifiera stimulus-framkallad aktivitet i neuroner i periferin 6,16,21 och CNS 12,35,36 är ett område under utveckling med flera sofistikerade arbetsflödespaket som har gjorts fritt tillgängliga37,38. En fullständig diskussion om styrkor och svagheter i de olika tillvägagångssätt som används ligger utanför ramen för detta manuskript. Eftersom detta inte var fokus för den aktuella studien, använde vi relativt godtyckliga och subjektiva kriterier baserade på den maximala responsen som observerades i regioner av ganglierna där det inte fanns några tydligt detekterbara neuroner (baserat på förmågan att se kärnan), så att en neuron ansågs svara på ett stimulus om ökningen av fluorescensen var tidslåst till stimulusappliceringen (ökning av fluorescens detekterad inom 1 s efter stimulusapplicering ( baserat på antagandet att en aktionspotential initierad i de långsammaste ledande axonerna (0,2 m/s) initierad på ett ställe högst 3 cm från cellkroppen bör nå cellkroppen på mindre än en sekund), och var >6 gånger standardavvikelsen för toppresponsen (ΔF/F) detekterade ett kontrollställe (figur 3C). Därefter karakteriserade vi dessa neuroners svarsegenskaper på naturliga stimuli: borsta, punktera, värme och kyla. Exempel på svar på vart och ett av dessa stimuli visas i figur 4. Noterbart är att svaret på punktiv stimulering, som oftast används i smärtrelaterade studier, har den mest robusta responsen (Figur 4B,F).

Vårt mål med att utveckla denna teknik var att kunna bedöma förändringar i populationskodning i TG-neuroner. Således anpassade vi den kroniska förträngningsskadan till ION (CCI-ION), som tidigare använts29, för att studera råttor 2 veckor efter nervskada. Efter induktionen av modellen exponerade vi TG och bedömde vilo- och framkallad aktivitet i TG ipsilateralt och kontralateralt till skadestället. Intressant nog ökade storleken på den maximala framkallade responsen på borstning ~2-faldigt på den nervskadade sidan i förhållande till toppresponsen på samma stimulus applicerad på den kontralaterala sidan (Figur 5A-C). Dessutom, när två borststimuli applicerades i serie (med ett interstimulusintervall på 10 s), fanns det en signifikant förstärkning av storleken på responsen på den andra stimulus på den skadade men inte oskadade sidan (Figur 5D).

Slutligen, som ett första kontrollexperiment för att bekräfta att den stimulusframkallade ökningen av fluorescens berodde på aktionspotentialer initierade i periferin, bedömde vi effekten av tetrodotoxin (1 μM) på stimulusframkallade svar. TTX injicerades i en volym av 200 μL perkutant som beskrivits tidigare28 för att rikta in sig på den infraorbitala nerven. Som visas i figur 6 eliminerades den framkallade aktiviteten nästan helt. Sammantaget visar dessa resultat nyttan av att använda AAV9-GCaMP för att undersöka TG-populationens svar in vivo.

Figure 1
Figur 1: Hög effektivitet av GCaMP6s-infektion i TG-neuroner med neonatal AAV-injektion. (A) P5-råttungar injicerades med 5 μL pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (titer: 2,4 x 1014) virus intraperitonealt: GCaMP6s-uttryck detekterades hos 51,7 ± 14,3 % av TG-neuronerna (n = 3 skivor per djur, 7 råttor). (B) Ökad injektionsvolym till 15 μL hos yngre djur (p2) förbättrade infektionseffektiviteten: GCaMP6s-uttryck detekterades i 91,8 ± 3,2 % av TG-neuronerna (n = 3 skivor per djur, 8 råttor). Panelerna till vänster var betsade för GCaMP6. Panelerna i mitten färgades med NeuN, en neuronspecifik markör. Panelerna till höger är en sammanfogad bild av GCaMP6s- och NeuN-panelerna. Skalstapeln i den första panelen är densamma för alla efterföljande paneler. Grafen till höger är ett diagram över GCaMP6s uttryck (medelvärde ± SEM) som en procentandel av det totala antalet neuroner per skiva per djur, där de enskilda punkterna är data för varje djur. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Stimulering av trigeminusgangliet (TG), infraorbitalnerven (ION) och området i ansiktet (vibrissaldynan). (A) Framhjärnan avlägsnades för att möjliggöra åtkomst till TG. (B) Område i ansiktet där naturliga stimuli applicerades i förhållande till ION och TG. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Stimulus-framkallad ökning av GCaMP6s fluorescens. (A) Totalt synfält under 20x förstoring. Oftalmologiska (V1) och maxillära (V2) divisioner av TG indikeras. (B,C) Området i rutan visas i panelerna B och C, som är fluorescensbilder före respektive efter borststimulering av vibrissaldynan. Vita cirklar är jämförelseområden av intresse. Neuroner ansågs svara på ett stimulus baserat på den maximala förändringen i fluorescens som observerades i jämförelseregioner av intresse som beskrivs i texten. Skalstapeln i den första panelen är densamma för båda panelerna. (D) Representativa förändringar i fluorescens av neuroner som visas i B och C som svar på en borststimulus applicerad på ansiktet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Klassificering av neuroner baserat på deras svar på stimuli som appliceras i ansiktet. Representativa bilder av TG-neuroner före (övre panelerna - Baslinje) och efter (mittpanelen - Stimulering) av svar på en 1 cm kamelhårsborste (A - Borste), 1 cm2 rutnät av monofilament (B - Punctate), uppvärmning (C - Värme) och kylning (D - Cold) applicerade på samma område i ansiktet. Skalstapeln i den första panelen är densamma för alla efterföljande paneler. Orange cirklar betecknar ett exempel på en responsiv neuron. Vita cirklar är jämförelseområden av intresse. (E-H) Representativa spår av varje respons per stimulus. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Nervskada ökar borstframkallade svar i TG-neuroner. Typiska svar av TG-neuroner på borstning appliceras två gånger på råttans ansikte på sidan kontralateralt till en kronisk sammandragningsskada av infraorbitalnerven (A, Contra) eller på sidan ipsilateral till nervskadan (B, Ipsi). (C) Analys av poolade data från responsiva neuroner från sex råttor (data plottade är per råtta) bekräftade att skillnaden i storleken på den första responsen på borstning var signifikant (parat t-test). (D) När toppresponsen på den första och andra stimulusapplikationen analyserades som en kvot (R2/R1), bekräftade analysen av de sammanslagna data att ökningen av responskvoten på den nervskadade sidan var signifikant. ** p < 0.01 Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Blockering av framkallad aktivitet i TG-neuroner med tetrodotoxin (TTX). (A) Fluorescensdata från TG-neuroner ipsilateralt till en nervskada efter injektion av TTX (200 μL, 1 μM) intill den infraorbitala nerven efter applicering av en borststimulus (blå stapel). B) Sammanslagna toppresponsdata från tre råttor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här demonstrerar vi ett snabbt, icke-invasivt sätt att generera en GECI-råtta för avbildning av TG. Vi valde en CAG-promotor för att driva och upprätthålla höga nivåer av genuttryck. Medan tidigare studier tyder på att andra AAV-serotyper effektivt kan driva genuttryck i DRG-neuroner39, överensstämmer våra resultat med en nyligen genomförd studie som involverar intraperitoneal injektion av AAV hos nyfödda32, vilket indikerar att AAV9-serotypen är mycket effektiv vid infektion av neonatala sensoriska neuroner hos råtta.

Genom att felsöka denna teknik är det värt att notera några fallgropar som kan förhindra optimal infektion. Den viktigaste variabeln att tänka på är valparnas ålder. Råttans nervsystem utvecklas snabbt under de första 7 dagarna efterfödseln. Vi försökte med infektioner vid senare tidpunkter (t.ex. p4-7), vilket resulterade i varierande och dålig effektivitet. Tidigare tidpunkter (p1-4) ger mer robust och konsekvent effektivitet, där p1-2 ger de högsta infektionsfrekvenserna. Den andra variabeln är injektionsvolymen. Oavsett ålder krävdes minst 15 μL för att producera mer än 70 % effektivitet i TG eller DRG med en titer på 2,5 x 1014. Vi fann att intraperitoneala injektioner på mindre än 10 μL ger mycket lite uttryck hos den vuxna individen även vid p2. Det är möjligt att mer lokaliserade injektioner, d.v.s. direkt i det receptiva intresseområdet, vid lägre volymer skulle ge liknande effekter. Detta tillvägagångssätt skulle dock kräva att valparna är helt bedövade och kan orsaka trauma på den vävnad som är av intresse. Slutligen är det möjligt att mindre volymer kan användas med högre titrar.

Exponering av TG för GECI-avbildning har tidigare utförts på möss16. Men när man översatte detta tillvägagångssätt till råttan avslöjades flera frågor som var värda att överväga. För det första är tjockleken på skallen och duran hos råttan mycket större än hos en mus. Därför kan det vara svårt att ta bort kalotten. Vi fann att en liten borr är ett effektivt sätt att perforera skallemössan, som sedan kan tas bort med rongeurs. Ett andra problem är blödning när hjärnan har tagits bort. Detta kan vara ett fortsatt problem för både preparatets livslängd och klarheten i avbildningen, om inte neuronernas egenskaper. Gasväv doppad i iskall CSF kan appliceras på den exponerade ytan av hjärnan för att hjälpa till att stänga huvudartärerna. Användningen av en liten injektionspenna kan också vara effektiv för att hejda ytterligare blödningar. Slutligen kan gelfoam som ligger på den kontralaterala sidan av avbildningsfönstret också hjälpa till att förhindra att blod och CSF orsakar avbildningsproblem. En tredje faktor är hur mycket hjärna som ska tas bort. Vi fann att om man tar bort hjärnsvansen till ~Bregma -3,80 kommer det att leda till döden inom en timme efter borttagningen. Hjärnan bör därför avlägsnas i små sektioner och behålla så mycket som möjligt samtidigt som så mycket av TG som möjligt exponeras.

Som noterades i inledningen är [Ca2+]i ett indirekt mått på neuronal aktivitet, och följaktligen innebär en ökning av [Ca2+]i inte nödvändigtvis att det finns en ökning av neural aktivitet. Således är kontrollexperiment avgörande för att bekräfta att det som anses vara framkallad aktivitet faktiskt är aktivitet i sig. Till exempel bör elektriskt framkallade stimuli producera en tidslåst ökning av [Ca2+]i, som är på en liknande skala som för naturligt framkallade stimuli. Det är viktigt att denna aktivitet elimineras med blockering av nerven (dvs. TTX). Det är dock också viktigt att notera att trots dessa viktiga kontroller är det fortfarande möjligt att några av de till synes framkallade ökningarna av [Ca2+]i beror på signalering inom ganglierna, till exempel på grund av transmittorfrisättning inom ganglierna41, snarare än på grund av en aktionspotential initierad i periferin som har invaderat cellsoma.

Även om våra resultat bekräftar att av tidigare forskare 16,42,43 som indikerar att signal-brusförhållandet associerat med förändringar i GCaMP-fluorescens i sensorisk somata är tillräckligt för användning med ett vanligt epifluorescensmikroskop, kan manipulationer som den nervskada som används i den aktuella studien vara associerade med sådana dramatiska förändringar i neuronal aktivitet och Ca2+-signalering34, att reaktioner i hela ganglierna kan vara förknippade med en så stor ökning av den skenbara bakgrunden att reaktionerna hos enskilda nervceller kan dämpas artificiellt. Även om metoder för bildbehandling har utvecklats som kan hjälpa till att ta itu med denna begränsning44, kan konfokal- eller multifotonavbildning behövas för att lösa detta problem så effektivt som möjligt.

Sammantaget ger denna teknik ett tillvägagångssätt för att undersöka stimulus-responsegenskaperna hos TG-neuroner hos råtta på populationsnivå. Våra resultat med CCI för ION bekräftar möjligheten att upptäcka förändringar i dessa stimulus-responsegenskaper. Även om endast mekaniska och termiska stimuli användes i den aktuella studien, bör detta preparat vara mottagligt för applicering av kemiska stimuli för att fullt ut definiera stimulus-responsegenskaperna hos TG-neuroner. På samma sätt, medan vi fokuserade på stimulus-responsegenskaper hos kutana afferenter, på grund av uppkomsten av sådana fenomen som dynamisk mekanisk allodyni efter traumatisk skada på en kutan nerv, bör det också vara möjligt att upptäcka förändringar i egenskaperna hos afferenter som innerverar andra kraniofaciala strukturer såsom käkleden (som svar på ofarliga kontra skadliga käkrörelser). hornhinnan eller tungan. Perifer injektion av serotypen AAV9 möjliggör neuronspecifik induktion av GCaMP som är PNS-specifik. En stor fördel med denna strategi är att viral märkning ger ett robust, ihållande uttryck i postmitotiska celler (dvs. neuroner) men inte i mitotiska celler (t.ex. epitelceller). Dessutom indikerar preliminär screening av olika PNS-vävnader att denna virala strategi kan användas för att undersöka para/sympatiska ganglier, DRG och enteriska nervsystemet (data visas inte).

Denna in vivo-förberedelse ger också grunden för att utforska många jämförelser som saknas i den aktuella litteraturen. In vivo populationsstudier mellan råtta TG och DRG, råtta vs. mus TG, har ännu inte utförts. De data som presenteras här illustrerar den nya genomförbarheten av dessa viktiga experiment som ska genomföras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Gold fick bidrag från Grünenthal under utvecklingen av detta preparat. Det fanns ingen överlappning i fokus för Grünenthalstudien och den förberedelse som beskrivs i detta manuskript. Ingen av de andra författarna har några andra potentiella intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr. Kathy Albers och Brian Davis för användningen av deras Leica Microscope and Metamorph-program, Charles Warwick för att ha hjälpt till att bygga vår termiska Peltier-enhet och Dr. Raymond Sekula för att ha hjälpt till med felsökning av de kirurgiska förberedelserna. Detta arbete stöddes av anslag från National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) och R01NS122784 (MSG och RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Tags

Neurovetenskap nummer 204
<em>In vivo</em> Kalciumavbildning av sensoriska neuroner i råttans trigeminusganglion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter