Summary
Denna studie presenterar en lättanvänd, komplett och enkel uppsättning metoder för att märka och analysera glomeruli från CUBIC-rensade musnjurar. Data som glomerulus antal och volym kan erhållas enkelt och tillförlitligt med hjälp av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence mikroskopi (LSFM) eller vanlig konfokalmikroskopi och programvara som Imaris.
Abstract
Glomeruli är grundläggande enheter i njuren; Därför är studier av glomeruli avgörande för att förstå njurfunktion och patologi. Biologisk avbildning ger intuitiv information; Därför är det av stor betydelse att märka och observera glomeruli. De glomeruli-observationsmetoder som för närvarande används kräver dock komplicerade operationer, och resultaten kan förlora etikettdetaljer eller tredimensionell (3D) information. Den klara, obehindrade hjärnavbildningscocktails och beräkningsanalys (CUBIC) vävnadsrensningstekniken har använts i stor utsträckning inom njurforskning, vilket möjliggör mer exakt detektion och djupare detektionsdjup. Vi fann att musglomeruli snabbt och effektivt kan märkas genom svansveninjektion av medelmolekylär FITC-Dextran följt av CUBIC-clearingmetoden. Den rensade musnjuren kunde skannas med ett light-sheet-mikroskop (eller ett konfokalmikroskop när den skivades) för att få tredimensionella bildstaplar av alla glomeruli i hela njuren. Bearbetade med lämplig programvara kan glomerulisignalerna enkelt digitaliseras och analyseras ytterligare för att mäta antal, volym och frekvens av glomeruli.
Introduction
Antalet och volymen av glomeruli är mycket viktiga för diagnos och behandling av olika njursjukdomar 1,2,3,4,5. Den gyllene standarden för glomerulitalsuppskattning är den fysiska dissekeraren/fraktionatorkombinationen. Denna metod kräver dock speciella reagenser och utrustning, vilket gör den långsam och dyr 6,7,8,9. Biopsi ger en mängd information, men uppenbarligen är denna metod endast lämplig för grova uppskattningar10,11. Medicinsk bildteknik, inklusive magnetisk resonanstomografi (MRI), datortomografi (CT) och röntgen, används också i stor utsträckning vid glomerulär detektion 12,13,14,15, men sådan teknik kräver skrymmande instrument. Nya metoder, såsom matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI) avbildande masspektrometer16 eller tjock- och tunnsnittsmetoden17, har också använts för glomerulär detektion, även om de fortfarande är tråkiga och mödosamma.
Med hjälp av transparensteknik är det möjligt att observera djupare djup och få rikare och mer fullständig information från tjocka vävnader eller till och med hela organ 18,19,20,21,22,23. Därför har transparensteknik använts i stor utsträckning inom njurforskning24. Observation och detektion av glomeruli i de rensade njurarna är också involverad. Dessa publicerade artiklar hänvisade dock antingen endast kortfattat till glomerulär detektion25 eller använde svåruppnådda märkningsmetoder såsom transgena djur26, egenproducerade färgämnen13 eller högkoncentrerad antikroppsinkubation27 för att märka glomeruli. Dessutom, även om studier hade analyserat glomeruli i rensade njurar, var analyserna alltid begränsade13 eller förlitade sig på analysalgoritmer som fastställts av författarna själva26.
Vi har tidigare visat ett bekvämare sätt att märka glomeruli i mössnjurar28. Genom att använda Imaris fann vi att glomeruliantal, frekvens och volym snabbt kunde erhållas. Således presenterar vi här en mer tillgänglig, omfattande och förenklad uppsättning metoder för att märka och analysera glomeruli hos mössnjurar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vuxna C57BL/6-möss (6 veckors ålder, 25-30 g) användes i denna studie. Alla procedurer utfördes i enlighet med lokala bestämmelser om djurskydd och experimentetik. Studien godkändes av West China Hospital of Sichuan University Biomedical Research Ethics Committee.
1. Glomeruli-märkning och vävnadsberedning
- Glomeruli märkning
- Lös upp FITC-dextran (10 mg) i 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i förhållandet 1:1 (1 mg: 1 ml) för att bereda arbetssondlösningen.
OBS: Arbetslösningen kan förvaras vid 4 °C i 1 månad. - Placera C57-musen i en mussvansvenfixator. Blöt gasbindan med varmt vatten, linda gasbindan runt mitten av mussvansen och värm svansen i 1 min.
- Torka av mussvansen med 75 % etanol tills vänster och höger svansvener är synliga.
- Dra upp 100 μl av den fungerande sondlösningen med en 1 ml insulinspruta och injicera långsamt lösningen i mussvansvenen.
- Efter injektionen, låt sondlösningen cirkulera i 30 minuter. Låt mössen röra sig fritt i sina burar.
- När tillräcklig cirkulation har uppnåtts bedövas mössen djupt genom intraperitoneal injektion av natriumpentobarbital (1 %, 60-80 μg/kg).
- Lös upp FITC-dextran (10 mg) i 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i förhållandet 1:1 (1 mg: 1 ml) för att bereda arbetssondlösningen.
- Provtagning och fixering av njurar
- Fäst de sövda mössen på den anatomiska plattan i ryggläge. Fäst tassarna med medicinsk tejp.
- Efter hudberedning avlivas mössen med en dödlig dos natriumpentobarbital (1 %, 10 mg/kg).
- Gör ett snitt i mitten av buken för att exponera bukhålan.
- Ta fram njurarna och ta bort dem med skalpell och sax i dragskåpet. Ta försiktigt bort njurhöljet.
- Samla in njurarna och fixera dem i 4 % paraformaldehyd (PFA) vid 4 °C över natten.
- Tvätta proverna med PBS tre gånger 1 timme vardera med skakning vid rumstemperatur (RT).
- Förbered njuren för mikroskopi.
- Skiva njuren för konfokalmikroskopi: Skär njuren i 1 mm tjocka skivor med hjälp av hjärnmatrisen (1 mm stål, 40-75 g) för att standardisera skivtjockleken. Överför skivorna till 4 % PFA och fortsätt fixeringen vid 4 °C över natten.
- Hel njure för light-sheet-mikroskopi: Fixera njurarna i 4 % PFA vid 4 °C i 48 timmar.
2. Röjning
- Beredning av reagens
- Bered CUBIC-L-reagens genom att blanda 10 % (vikt/vikt) N-butyldietanolamin, 10 % (vikt/vikt) Triton X-100 och 80 % ddH2O.
- Bered CUBIC-R-reagens genom att blanda 45 % (vikt/vikt) antipyrin, 30 % (vikt/vikt) nikotinamid, 0,5 % (vol/vol) N-butyldietanolamin och 24,5 % ddH2O. Se till att lösningen har ett pH på 9,6-9,8 och ett brytningsindex (RI) på 1,522.
OBS: CUBIC-L används för delipidering och CUBIC-R används för matchning av brytningsindex.
- Förfarande för clearing
- Samla njurproverna i ett 50 ml centrifugrör och rensa dem sedan i CUBIC-L genom att skaka vid 60 varv per minut vid 37 °C. Byt ut CUBIC-L var 4:e timme (för njurskivor) eller var 24:e timme (för en hel njure) tills tillfredsställande optisk transparens uppnås.
OBS: Denna process tar 1 dag för njurskivor och 5 dagar för en hel njure. - Tvätta proverna tre gånger i PBS med lätt skakning vid RT i 1 timme vardera.
- Applicera CUBIC-R på proverna, skaka samples vid 37 °C, 60 rpm i 6 timmar.
- Observera de rensade proverna direkt eller förvara dem i svarta rör fyllda med CUBIC-R vid RT i 1 vecka.
- Samla njurproverna i ett 50 ml centrifugrör och rensa dem sedan i CUBIC-L genom att skaka vid 60 varv per minut vid 37 °C. Byt ut CUBIC-L var 4:e timme (för njurskivor) eller var 24:e timme (för en hel njure) tills tillfredsställande optisk transparens uppnås.
3. Bildtagning
- Konfokal avbildning
OBS: Avbilda de skivade njurproverna med konfokalmikroskopi (linser: Ett Plan Apo λ 4×/0.2 N1-objektiv eller ett Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1-objektiv). Ta stora bilder (t.ex. 6052 μm x 6052 μm för njurskivan) med z-stackar.- Slå på det konfokala mikroskopet i följande ordning: laserström, konfokal kontrollbrytare, dator, mikroskop och konfokal hårdvara. När du har kört självtestet, slå på konfokalprogramvaran.
- Välj lämpligt objektiv. Ta bort sample från CUBIC-R-reagenset, placera det i konfokalskålen och täck över det för att förhindra att CUBIC-R-reagenset torkar ut.
- Flytta sample till mitten av synfältet och justera fokalplanet tills det är i fokus.
- Tillämpa 3D-rekonstruktion (steg 3.1.4.1) och storbildsrekonstruktion (steg 3.1.4.2-3.1.4.3).
- 3D-rekonstruktion (konfokal): Växla zoomplanet i en riktning tills ingen fluorescens är synlig; Den här positionen definieras som toppen. Växla sedan zoomplanet i motsatt riktning tills ingen fluorescens är synlig. Denna position definieras som botten. Klicka på knappen Kör i det nedre högra hörnet av dialogrutan för att starta genomsökningen.
- Stor bildrekonstruktion (konfokal): Flytta synfältet till mitten av exemplet och ställ in den aktuella positionen som mittpunkt. Välj ett 2 x 2 synfält.
- I ND-multifunktionsgränssnittet väljer du Z-stapeln för att rekonstruera stora bilder och ställa in olika alternativ i panelen. Tryck sedan på knappen Kör för att starta skanningen.
- Fluorescensmikroskopi (LSFM) avbildning
OBS: Avbilda hela njurarna med ett ljusarkfluorescensmikroskop (lins: EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (Medium n = 1.529) objektiv).- Fastsättning av prov (LSFM):
- Limma fast den genomskinliga njuren på sample fixeringsadapter och vänta tills njuren är ordentligt fastsatt.
- Blötlägg njuren i sample behållaren och tryck in provbehållaren i mikroskopsystemet. Stäng luckan.
- Observera och skanna (LSFM):
- I gränssnittet Lokalisera flyttar du provet till en lämplig observationsposition. Växla till förvärvsgränssnittet , ställ in den optiska vägen, välj 488 nm laser, LBF 405/488/561/640, optiskt delningsfilterblock SBS LP 490, välj Kamera 2 och ändra pseudofärgen till grön.
- Fyll i värdet för vänster/höger Z-förskjutning som spelades in tidigare i undermenyn Kanal . Välj den minsta zoomen (0,36) och finjustera den för maximal skärpa.
- Hitta X\Y-gränsen och Z-området för hela orgeln. Justera laserintensiteten och exponeringstiden (helst mindre än 10 ms) och klicka på Kör för att starta.
- Om vävnaden är för stor sammanfogar du två eller flera bilder med bildsammanfogning. Öppna den infångade filen med hjälp av mikroskopiprogrammet (här ZEISS ZEN 3.7). Välj Processing > Method > Stitching > Method Parameter > Apply (Bearbeta metod Stitching Method Parameter Apply (Tillämpa för att slutföra bildsammanfogningen).
- Fastsättning av prov (LSFM):
4. Databehandling och kvantifiering
OBS: Bearbeta bildstaplarna med Imaris-programvara (bildanalys) med hjälp av Surface-funktionen för att märka glomeruli och utföra analys.
- Antal glomeruli
- Importera stora bilder (konfokalmikroskopi) eller sammanfogade bilder (light-sheet-mikroskopi) till bildanalysprogrammet.
- Öppna filerna i bildanalysprogrammet. Klicka på knappen Surface för att skapa en ny Surface. Följ guiden längst ned till vänster på skärmen.
- Klicka på knappen Nästa (högerpilen) utan att markera något.
- Markera rutan före alternativet Utjämna och ange ett korrekt nummer (t.ex. 14.5) för att styra detaljerna på ytan. Välj Subtraktion av bakgrund i Tröskelvärde och fyll i rutan med glomerulis ungefärliga medeldiameter. Klicka på knappen Nästa .
- Justera om det behövs och klicka på knappen Nästa . Välj rätt intervall och klicka på knappen Nästa för att skapa en Surface.
- Klicka på Filter och sedan på knappen Lägg till för att lägga till sfäricitet för att filtrera bort icke-sfäriska objekt. Klicka på knappen Duplicera för att kopiera den nya ytan.
- Klicka på knappen Statistik och sedan på knappen Övergripande . Programvaran kommer att presentera antalet glomeruli som det totala antalet ytor.
- Volym glomeruli
- Skapa en yta av glomeruli enligt ovan.
- När Surface är klar klickar du på knappen Markering för att markera målobjekten och visa volymen för varje objekt. Klicka på knappen Spara och exportera statistik till ett kalkylblad för vidare analys.
- Skivans eller hela njurens volym
- Importera stora bilder (konfokalmikroskopi) eller sammanfogade bilder (light-sheet-mikroskopi) till bildanalysprogrammet.
- Öppna filer i bildanalysprogrammet. Klicka på knappen Surface för att skapa en ny Surface. Följ guiden längst ned till vänster på skärmen.
- Klicka på knappen Nästa (högerpilen) utan att bocka.
- Markera rutan före alternativet Utjämnad och ange ett korrekt nummer (t.ex. 50) för att styra detaljerna på ytan. Välj Absolut intensitet i Tröskelvärde. Klicka på knappen Nästa .
- Justera Surface tills den täcker hela vävnaden och klicka på knappen Nästa . Klicka på knappen Nästa för att skapa Surface.
- Klicka på knappen Val för att välja ytan på hela vävnaden och presentera vävnadens volym. Klicka på knappen Spara för att exportera statistik till ett kalkylark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie ger en enkel och effektiv metod för att märka och analysera glomeruli i mössnjurar.
Glomeruli (blodkärl) kan märkas väl genom intravaskulärt injicerad FITC-Dextran. Efter utläkningsprocessen blev njuren genomskinlig (Figur 1A) och glomeruli kunde tydligt observeras med hjälp av light-sheet-mikroskopi (Figur 1B) eller konfokalmikroskopi (Figur 1C). Konfokalmikroskopi har ett begränsat skanningsdjup, så njurarna bör skäras i cirka 1 mm tjocka skivor. Om ett light-sheet-mikroskop används kan hela njuren skannas direkt.
Med de tydliga signalerna var det lätt att räkna antalet glomeruli. Faktum är att märkningen var så effektiv att glomeruli kunde räknas med blotta ögat. Volymen av glomeruli kunde också mätas direkt. Naturligtvis påskyndade programvara som Imaris denna process avsevärt. Med hjälp av ytfunktionen kan alla glomeruli i en njurskiva (figur 2), i en hel njure (figur 3) eller i en remsa (figur 4) väljas, och antalet och volymen av glomeruli kan erhållas direkt (figur 2C, figur 3C, figur 4C). Volymen i den valda regionen kunde också mätas (Figur 2B, Figur 3B, Figur 4B), så att glomeruli-volymförhållandet och frekvensen i en viss region eller i hela njuren kunde beräknas (Figur 2D, Figur 3D, Figur 4D). Ett område av njuren kan väljas för att utföra beräkningar i specifika regioner. Vi presenterade en remsa som liknade en biopsi. Antalet, volymen och frekvensen av glomeruli i remsan kunde också enkelt erhållas (figur 4).
Som framgår av figurerna är resultaten som presenteras i denna studie (N = antal, F = frekvens, V = volym, V(a) = medelvolym, V(t) = total volym):
Nglomeruli i skiva = 1128, Nglomeruli i hel njure = 14006, Fglomerulär i skiva = 65 per mm3, Fglomerulär i hela njuren = 105 per mm3, Vtotal glomeruli i skiva/Vskiva = 2,24 %, Vtotal glomeruli i hela njuren/Vnjure = 5,54 %, V(a)glomeruli i skiva = 373654 μm3, V(a)glomeruli i hela njuren = 521627 μm3, V(t)glomeruli i skiva = 421481724 μm3, V(t)glomeruli i hel njure = 7305386256 μm3 (Figur 2D, Figur 3D).
Nglomeruli i remsa = 63, Fglomeruli i remsa = 72 per mm3, Vtotal glomeruli i remsa/Vremsa = 2,23 %, V(a)glomeruli i remsa = 307698 μm3, V(t)glomeruli i remsa = 19384977 μm3 (figur 4D).
Figur 1: Njurvävnadens transparens och FITC-dextranmärkta glomeruli. (A) Njure före och efter genomskinlighetsbehandling. (B) Bilden av en hel njure skannad med LSFM. (C) Bilden av en skiva njure skannad med konfokalmikroskopet (vänster: 4x, höger: 10x). skalstapel = 300 μm (4x, konfokal); skalstapel = 100 μm (10x, konfokal).; skalstapel = 700 μm (5x, zoom 0,36, LSFM). Glomeruli märktes med FITC-Dextran. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Funktionen Yta applicerad på den konfokala skannade njurskivan. (A) Skivans yta och alla glomeruli skapas. Rosa = glomeruli, blå = ut Njurskivans yta, grön = ursprunglig etikett på kärl (glomeruli och några stora kärl). Skalstapel = 300 μm. (B) När skivans yta (vänster) eller glomeruli (höger) är markerad (markerade objekt blir gula) kan data erhållas direkt (prickade rutor markeras där data visas). (C) Antalet, volymen av varje enskild glomerulus och volymen av den totala glomeruli kunde erhållas direkt, liksom volymen av skivan. (D) Exporterade data kunde analyseras ytterligare så att beräkningen, såsom den genomsnittliga volymen av glomeruli och volymförhållandet mellan glomeruli och det valda området, kunde utarbetas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Funktionen Yta applicerad på LSFM skannad hel njure. (A) Ytan på hela njuren och alla glomeruli skapas. Rosa = glomeruli, blå = ut Ytan på hela njuren, grön = ursprunglig etikett på kärl (glomeruli och några stora kärl). Skalstapel =1000 μm. (B) När njurens yta (vänster) eller glomeruli (höger) är markerad (valda objekt blir gula) kan data erhållas direkt (prickade rutor markerar där data visas). (C) Antalet, volymen av varje enskild glomerulus och antalet glomeruli kunde erhållas direkt, liksom njurvolymen. (D) Exporterade data kunde analyseras ytterligare så att beräkningen, såsom den genomsnittliga volymen av glomeruli och volymförhållandet mellan glomeruli och hela njuren, kunde utarbetas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Funktionen Yta applicerad på den valda njurremsan. (A) Remsans yta och alla glomeruli skapas. Rosa = glomeruli, blå = ut Njurremsans yta, grön = ursprunglig etikett på kärl (glomeruli och några stora kärl). Skalstapel =150 μm. (B) När ytan på remsan (vänster) eller glomeruli (höger) är markerad (valda objekt blir gula), kan data erhållas direkt (prickade rutor markeras där data visas). (C) Antalet, volymen av varje enskild glomerulus och volymen av den totala glomeruli kunde erhållas direkt, liksom volymen av remsan. (D) Exporterade data kunde analyseras ytterligare så att beräkningen, såsom den genomsnittliga volymen av glomeruli och volymförhållandet mellan glomeruli och det valda området, kunde utarbetas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vävnadsrensningstekniker kan klassificeras i 3 eller 4 grupper 29,30,31. Organisk lösningsmedelsbaserad vävnadsclearing (t.ex. DISCO och PEGASOS), vattenbaserad vävnadsclearing (t.ex. CUBIC) och hydrogelinbäddningsvävnadsclearing (t.ex. CLARITY) har alla tillämpats vid njurrensning 25,26,28,32. CUBIC, som vi har visat, fungerar bäst när glomeruli (kärl) är märkta med FITC-Dextran. Dessutom har CUBIC en relativt bekvämare driftprocess och kräver inte mer än vanliga mikroskopiska linser27, eftersom de bearbetade proverna inte behöver blötläggas i organiska reagenser33. Olika klareringsmetoder och metoder för fartygsmärkning har dock sina egna för- och nackdelar. Forskare kan behöva experimentera med olika tillvägagångssätt för att möta sina specifika behov.
Tidigare studier har visat att glomeruli kunde märkas i rensade njurar när blodkärlen i njurarna märktes 13,25,26,28. En grundlig förklaring till detta fenomen behöver fortfarande undersökas ytterligare, men det kan härledas att en bra märkningsmetod för kärlsystemet också effektivt märker glomeruli. Baserat på de experimentella resultaten rekommenderar vi intravaskulär injektion av FITC-Dextran med en medelmolekylvikt (t.ex. 150 kDa). Men eftersom märkningen är beroende av blodcirkulationen kan denna metod misslyckas med att märka glomeruli när de saknar cirkulation.
LSFM möjliggör storskalig vävnadsobservation, vilket gör den mer lämplig för detektion av hela njurglomeruli. Det kan dock hända att light-sheet-mikroskop inte finns tillgängliga i alla laboratorier. Så vi tillhandahåller en alternativ uppsättning protokoll med hjälp av vanliga konfokalmikroskop. Även om njuren måste delas upp i flera sektioner är det möjligt att få fram data som antal och volym av glomeruli i hela njuren. Dessutom ger konfokalmikroskopi en mindre mängd data, vilket är mer databehandlingsvänligt.
Imaris tillhandahåller direkt datautdata. Var dock noga med att matcha den analoga signalen med originalet. Dessutom kan programvaran ta lång tid att bearbeta stora filer, vilket kan vara frustrerande. Så länge glomeruli tydligt kan märkas och visualiseras finns det mer än en unik lösning för dataanalys. Forskare från olika laboratorier kunde arbeta med sina egna bekanta programvaror och programmeringsspråk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Samtliga författare deklarerar att de inte är jäviga.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (82204951) och Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V.
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
