Summary
Denne studien presenterer et brukervennlig, komplett og enkelt sett med metoder for å merke og analysere glomeruli fra CUBIC-ryddede musenyrer. Data som glomerulusantall og volum kan oppnås enkelt og pålitelig ved hjelp av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-Dextran, lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM), eller vanlig konfokalmikroskopi og programvare som Imaris.
Abstract
Glomeruli er grunnleggende enheter i nyrene; Derfor er studier av glomeruli avgjørende for å forstå nyrefunksjon og patologi. Biologisk avbildning gir intuitiv informasjon; Dermed er det av stor betydning å merke og observere glomeruli. Imidlertid krever glomeruli observasjonsmetoder som er i bruk kompliserte operasjoner, og resultatene kan miste etikettdetaljer eller tredimensjonal (3D) informasjon. Den klare, uhindrede hjerneavbildningscocktailer og beregningsanalyse (CUBIC) vevsfjerningsteknologi har blitt mye brukt i nyreforskning, noe som muliggjør mer nøyaktig deteksjon og dypere deteksjonsdybde. Vi fant at musglomeruli raskt og effektivt kan merkes ved haleveneinjeksjon av middels molekylvekt FITC-Dextran etterfulgt av CUBIC-clearing-metoden. Den ryddede musenyren kunne skannes av et lysarkmikroskop (eller et konfokalmikroskop når det ble skåret) for å oppnå tredimensjonale bildestabler av alle glomeruli i hele nyren. Behandlet med passende programvare, kan glomeruli-signalene enkelt digitaliseres og analyseres videre for å måle antall, volum og frekvens av glomeruli.
Introduction
Antallet og volumet av glomeruli er svært viktig for diagnostisering og behandling av ulike nyresykdommer 1,2,3,4,5. Den gylne standarden for glomeruli tallestimering er den fysiske dissektor / fraksjonator kombinasjonen. Denne metoden krever imidlertid spesielle reagenser og utstyr, noe som gjør det tregt og dyrt 6,7,8,9. Biopsi gir et vell av informasjon, men åpenbart er denne metoden bare egnet for grove estimater10,11. Medisinsk bildebehandlingsteknologi, inkludert magnetisk resonansavbildning (MRI), computertomografi (CT) og røntgen, er også mye brukt i glomerulær deteksjon 12,13,14,15, men slike teknologier krever store instrumenter. Nye metoder, for eksempel matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) bildemassespektrometer16 eller tykk og tynnsnittmetode17, har også blitt brukt i glomerulær deteksjon, selv om de fortsatt er kjedelige og arbeidskrevende.
Ved hjelp av gjennomsiktighetsteknologier er det mulig å observere dypere dybder og få rikere og mer fullstendig informasjon fra tykt vev eller til og med hele organer 18,19,20,21,22,23. Derfor har åpenhetsteknologier blitt mye brukt i nyreforskning24. Observasjon og påvisning av glomeruli i de ryddede nyrene er også involvert. Imidlertid refererte disse publiserte artiklene enten bare kort til glomerulær deteksjon25 eller brukte vanskelige å oppnå merkingsmetoder som transgene dyr26, selvproduserte fargestoffer13 eller høykonsentrasjons antistoffinkubasjon27 for å merke glomeruli. I tillegg, selv om studier hadde analysert glomeruli i klarerte nyrer, var analysene alltid begrenset13 eller støttet seg på analysealgoritmer etablert av forfatterne selv26.
Vi har tidligere vist en mer praktisk måte å merke glomeruli i mus nyrer28. Ved å bruke Imaris fant vi ut at glomeruli-antall, frekvens og volum raskt kunne oppnås. Dermed presenterer vi her et mer tilgjengelig, omfattende og forenklet sett med metoder for å merke og analysere glomeruli av musnyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne C57BL/6 mus (6 ukers alder, 25-30 g) ble brukt i denne studien. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med lokale forskrifter for dyrevelferd og eksperimentell etikk. Studien ble godkjent av West China Hospital of Sichuan University Biomedical Research Ethics Committee.
1. Glomeruli merking og vev forberedelse
- Glomeruli merking
- Løs opp FITC-dextran (10 mg) i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i forholdet 1:1 (1 mg: 1 ml) for å klargjøre arbeidssondeoppløsningen.
MERK: Arbeidsløsningen kan oppbevares ved 4 °C i 1 måned. - Plasser C57-musen i en musehalevenefikser. Våt gasbindet med varmt vann, vikle gasbindet rundt den midtre delen av musehalen, og varm halen i 1 min.
- Tørk musehalen med 75% etanol til venstre og høyre haleåre er synlige.
- Trekk opp 100 mikrol av arbeidssondeoppløsningen med en 1 ml insulinsprøyte og injiser oppløsningen langsomt inn i musehalvenen.
- Etter injeksjon, la sondeoppløsningen sirkulere i 30 minutter. La musene bevege seg fritt i burene sine.
- Når tilstrekkelig sirkulasjon er oppnådd, bedøves musene dyptved intraperitoneal injeksjon av natriumpentobarbital (1%, 60-80 μg / kg).
- Løs opp FITC-dextran (10 mg) i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i forholdet 1:1 (1 mg: 1 ml) for å klargjøre arbeidssondeoppløsningen.
- Nyreprøvetaking og fiksering
- Fest de bedøvede musene til den anatomiske platen i en liggende stilling. Fest potene med medisinsk tape.
- Etter klargjøring av huden, avlive musene med en dødelig dose natriumpentobarbital (1 %, 10 mg/kg).
- Lag et midtlinje abdominal snitt for å avsløre bukhulen.
- Avslør nyrene og fjern dem med en skalpell og saks i avtrekkshetten. Fjern nyrehylsteret forsiktig.
- Samle nyrene og fikser dem i 4% paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C over natten.
- Vask prøvene med PBS tre ganger 1 time hver med risting ved romtemperatur (RT).
- Forbered nyrene for mikroskopi.
- Skjær nyrene i skiver for konfokalmikroskopi: Skjær nyren i 1 mm tykke skiver ved hjelp av hjernematrisen (1 mm stål, 40-75 g) for å standardisere skivetykkelsen. Overfør skivene til 4 % PFA og fortsett fikseringen ved 4 °C over natten.
- Hel nyre for lysarkmikroskopi: Fikser nyrene i 4% PFA ved 4 °C i 48 timer.
2. Rydding
- Reagens forberedelse
- Klargjør CUBIC-L-reagens ved å blande 10 % (vekt/vekt) N-butyldietanolamin, 10 % (vekt/vekt) Triton X-100 og 80 %ddH2O.
- Klargjør CUBIC-R-reagens ved å blande 45 % (vekt/vekt) antipyrin, 30 % (vekt/vekt) nikotinamid, 0,5 % (vol/vol) N-butyldietanolamin og 24,5 %ddH2O. Sørg for at oppløsningen har en pH på 9,6-9,8 og en brytningsindeks (RI) på 1,522.
MERK: CUBIC-L brukes til delipidering, og CUBIC-R brukes til brytningsindeksmatching.
- Prosedyre for tømming
- Samle nyreprøvene i et 50 ml sentrifugerør og fjern dem deretter i CUBIC-L med risting ved 60 o / min ved 37 ° C. Bytt ut CUBIC-L hver 4. time (for nyreskiver) eller hver 24. time (for en hel nyre) til du oppnår tilfredsstillende optisk gjennomsiktighet.
MERK: Denne prosessen tar 1 dag for nyreskiver og 5 dager for en hel nyre. - Vask prøvene tre ganger i PBS med forsiktig risting ved RT i 1 time hver.
- Påfør CUBIC-R på prøvene, rist prøver ved 37 ° C, 60 o / min i 6 timer.
- Observer de ryddede prøvene direkte eller lagre dem i svarte rør fylt med CUBIC-R ved RT i 1 uke.
- Samle nyreprøvene i et 50 ml sentrifugerør og fjern dem deretter i CUBIC-L med risting ved 60 o / min ved 37 ° C. Bytt ut CUBIC-L hver 4. time (for nyreskiver) eller hver 24. time (for en hel nyre) til du oppnår tilfredsstillende optisk gjennomsiktighet.
3. Oppkjøp av bilder
- Konfokal avbildning
MERK: Bilde skiver nyreprøver med konfokal mikroskopi (Linser: A Plan Apo λ 4×/0.2 N1 mål eller en Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1 mål). Ta store bilder (f.eks. 6052 μm x 6052 μm for nyreskiven) med z-stabler.- Slå på konfokalmikroskopet i følgende rekkefølge: laserkraft, konfokalkontrollbryter, datamaskin, mikroskop og konfokal maskinvare. Etter å ha kjørt selvtesten, slå på konfokalprogramvaren.
- Velg riktig objektiv. Fjern prøven fra CUBIC-R-reagenset, legg den i konfokalskålen og dekk den til for å forhindre at CUBIC-R-reagenset tørker ut.
- Flytt prøven til midten av synsfeltet, og juster fokalplanet til det er i fokus.
- Bruk 3D-rekonstruksjon (trinn 3.1.4.1) og rekonstruksjon av store bilder (trinn 3.1.4.2-3.1.4.3).
- 3D-rekonstruksjon (konfokal): Bytt zoomplanet i én retning til ingen fluorescens er synlig; Denne posisjonen er definert som toppen. Bytt deretter zoomplanet i motsatt retning til ingen fluorescens er synlig; Denne posisjonen er definert som bunnen. Klikk Kjør-knappen nederst til høyre i dialogboksen for å starte skanningen.
- Rekonstruksjon av store bilder (konfokal): Flytt synsfeltet til midten av prøven, og angi gjeldende posisjon som midtpunkt. Velg et synsfelt på 2 x 2.
- I ND-multifunksjonsgrensesnittet velger du Z-stakken for å rekonstruere store bilder og angi forskjellige alternativer i panelet. Trykk deretter på Kjør butto n for å starte skanningen.
- Lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM) avbildning
MERK: Bilde hele nyrene med et lysarkfluorescensmikroskop (Lens: EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (Medium n = 1.529) objektiv).- Eksempel ved vedlegg (LSFM):
- Lim den gjennomsiktige nyren til prøvefikseringsadapteren og vent til nyrene er godt festet.
- Bløtlegg nyren i prøvebeholderen og skyv prøvebeholderen inn i mikroskopsystemet. Lukk luken.
- Observer og skann (LSFM):
- I lokaliseringsgrensesnittet flytter du prøven til en passende observasjonsposisjon. Bytt til Acquisition-grensesnittet , sett den optiske banen, velg 488 nm laser, LBF 405/488/561/640, optisk splittingsfilterblokk SBS LP 490, velg Kamera 2, og endre pseudofargen til grønn.
- Fyll ut verdien for Venstre/høyre Z-forskyvning som ble registrert tidligere på undermenyen Kanal . Velg den minste zoomen (0,36), og finjuster den for maksimal klarhet.
- Finn X\Y-grensen og Z-området for hele orgelet. Juster laserintensiteten og eksponeringstiden (helst mindre enn 10 ms), og klikk Kjør for å starte.
- Hvis vevet er for stort, slå sammen to eller flere bilder med bildesøm. Åpne den fangede filen ved hjelp av mikroskopiprogramvaren (her ZEISS ZEN 3.7). Velg Processing > Method > Stitching > Method Parameter > Bruk på fullstendig bildesammensetting.
- Eksempel ved vedlegg (LSFM):
4. Databehandling og kvantifisering
MERK: Behandle bildestakkene med Imaris-programvare (bildeanalyse) ved hjelp av Surface-funksjonen til å merke glomeruli og utføre analyse.
- Greve av glomeruli
- Importer store bilder (konfokalmikroskopi) eller sydde bilder (lysarkmikroskopi) til bildeanalyseprogramvaren.
- Åpne filene i bildeanalyseprogramvaren. Klikk på Surface-knappen for å opprette en ny Surface. Følg veiledningen nederst til venstre på skjermen.
- Klikk på Neste-knappen (høyre pilknapp) uten å krysse av for noe.
- Merk av i boksen før alternativet Glatt ut og skriv inn et riktig tall (f.eks. 14.5) for å kontrollere detaljene på overflaten. Velg Bakgrunnssubtraksjon i Terskel og fyll boksen med den omtrentlige gjennomsnittlige diameteren til glomeruli. Klikk på Neste-knappen .
- Juster om nødvendig, og klikk på Neste-knappen . Velg riktig område og klikk på Neste-knappen for å opprette en Surface.
- Klikk på Filter og deretter på Legg til-knappen for å legge til Sfærisitet for å filtrere ut ikke-sfæriske objekter. Klikk på Dupliser-knappen for å kopiere denne nye overflaten.
- Klikk på Statistikk-knappen , og klikk deretter på Overordnet-knappen ; programvaren vil presentere antall glomeruli som totalt antall overflater.
- Volum av glomeruli
- Lag en overflate av glomeruli som ovenfor.
- Når overflaten er fullført, klikker du på Valg-knappen for å velge målobjektene og presentere volumet til hvert objekt. Klikk på Lagre-knappen , og eksporter statistikk til et regneark for videre analyse.
- Volum av skiven eller hele nyren
- Importer store bilder (konfokalmikroskopi) eller sydde bilder (lysarkmikroskopi) til bildeanalyseprogramvaren.
- Åpne filer i bildeanalyseprogramvaren. Klikk på Surface-knappen for å opprette en ny Surface. Følg veiledningen nederst til venstre på skjermen.
- Klikk på Neste-knappen (høyre pilknapp) uten å krysse av.
- Merk av i boksen før alternativet Glatt ut og skriv inn et riktig tall (f.eks. 50) for å kontrollere detaljene på overflaten. Velg Absolutt intensitet i terskelverdi. Klikk på Neste-knappen .
- Juster overflaten til den dekker hele vevet, og klikk på Neste-knappen . Klikk på Neste-knappen for å opprette Surface.
- Klikk på Valg-knappen for å velge overflaten av hele vevet og presentere volumet av vevet. Klikk på Lagre-knappen for å eksportere statistikk til et regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien gir en enkel og effektiv metode for merking og analyse av glomeruli i mus nyrer.
Glomeruli (blodkar) kan være godt merket ved intravaskulært injisert FITC-Dextran. Etter clearingprosessen ble nyren gjennomsiktig (figur 1A), og glomeruli kunne tydelig observeres ved hjelp av lysarkmikroskopi (figur 1B) eller konfokalmikroskopi (figur 1C). Konfokalmikroskopi har begrenset skannedybde, så nyrene skal kuttes i ca. 1 mm tykke skiver. Hvis et lysarkmikroskop brukes, kan hele nyren skannes direkte.
Med de tydelige signalene var det enkelt å telle antall glomeruli. Faktisk var merkingen så effektiv at glomeruli kunne telles med det blotte øye. Volumet av glomeruli kunne også måles direkte. Selvfølgelig akselererte programvare som Imaris denne prosessen sterkt. Ved hjelp av overflatefunksjonen kunne alle glomeruli i en nyreskive (figur 2), i en hel nyre (figur 3) eller i en stripe (figur 4) velges, og antall og volum av glomeruli kunne oppnås direkte (figur 2C, figur 3C, figur 4C). Volumet av den valgte regionen kan også måles (figur 2B, figur 3B, figur 4B), slik at glomeruli-volumforholdet og frekvensen i en bestemt region eller i hele nyren kan beregnes (figur 2D, figur 3D, figur 4D). Et område av nyrene kan velges for å utføre beregninger i bestemte regioner. Vi presenterte en stripe som ligner på en biopsi. Antallet, volumet og frekvensen av glomeruli i stripen kunne også oppnås enkelt (figur 4).
Som vist i figurene er resultatene som presenteres i denne studien (N = tall, F = frekvens, V = volum, V (a) = gjennomsnittlig volum, V (t) = totalt volum):
Nglomeruli i skive = 1128, Nglomeruli i hel nyre = 14006, Fglomeruli i skive = 65 per mm3, Fglomeruli i hel nyre = 105 per mm3, Vtotal glomeruli i skive/V-skive = 2,24 %, Vtotal glomeruli i hel nyre/Vnyre = 5,54 %, V(a)glomeruli i skive = 373654 μm3, V(a)glomeruli i hel nyre = 521627μm 3, V(t)glomeruli i skive = 421481724 μm3, V(t)glomeruli i hel nyre = 7305386256 μm3 (figur 2D, figur 3D).
Nglomeruli i stripe = 63, Fglomeruli i stripe = 72 per mm3, Vtotale glomeruli i stripe /V-stripe = 2,23%, V (a) glomeruli i stripe = 307698 μm3, V (t) glomeruli i stripe = 19384977 μm3 (figur 4D).
Figur 1: Gjennomsiktighet i nyrevev og FITC-dextran-merket glomeruli. (A) Nyre før og etter åpenhetsbehandling. (B) Bildet av en hel nyre skannet med LSFM. (C) Bildet av et stykke nyre skannet med konfokalmikroskopet (venstre: 4x, høyre: 10x). skala bar = 300 μm (4x, konfokal); skala bar = 100 μm (10x, konfokal) .; skala bar = 700 μm (5x, zoom 0,36, LSFM). Glomeruli ble merket med FITC-Dextran. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Funksjonen Overflate påført den konfokale skannede nyreskiven. (A) Overflaten av stykket og alle glomeruli er opprettet. Rosa = glomeruli, blå = ut Overflaten av nyreskiven, grønn = original etikett på fartøy (glomeruli og noen store kar). Skala bar = 300 μm. (B) Når overflaten av stykket (venstre) eller glomeruli (høyre) er valgt (valgte objekter vil bli gule), kan data fås direkte (stiplet boks fremhever der den viser dataene). (C) Antallet, volumet av hver enkelt glomerulus og volumet av totale glomeruli kunne oppnås direkte, så vel som volumet av skiven. (D) Eksporterte data kunne analyseres videre slik at beregningen, for eksempel gjennomsnittsvolumet av glomeruli og volumforholdet mellom glomeruli og valgt område, kunne utarbeides. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Funksjonen Overflate brukt på LSFM-skannet hel nyre. (A) Overflaten av hele nyren og alle glomeruli er opprettet. Rosa = glomeruli, blå = ut Overflaten av hele nyren, grønn = original etikett på fartøy (glomeruli og noen store kar). Skala bar = 1000 μm. (B) Når overflaten av nyrene (venstre) eller glomeruli (høyre) er valgt (valgte objekter vil bli gule), kan data fås direkte (stiplet boks fremhever hvor den viser dataene). (C) Antallet, volumet av hver enkelt glomerulus og antallet glomeruli kunne oppnås direkte, samt nyrevolumet. (D) Eksporterte data kunne analyseres videre slik at beregningen, for eksempel gjennomsnittlig volum av glomeruli og volumforhold mellom glomeruli og hele nyren, kunne utarbeides. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Funksjonen Overflate påført den valgte nyrestrimmelen. (A) Overflaten på stripen og alle glomeruli er opprettet. Rosa = glomeruli, blå = ut Overflaten av nyrestripen, grønn = original etikett på kar (glomeruli og noen store kar). Skala bar = 150 μm. (B) Når overflaten av stripen (venstre) eller glomeruli (høyre) er valgt (valgte objekter vil bli gule), kan data fås direkte (stiplet boks fremhever hvor den viser dataene). (C) Antallet, volumet av hver enkelt glomerulus og volumet av totale glomeruli kunne oppnås direkte, samt volumet av stripen. (D) Eksporterte data kunne analyseres videre slik at beregningen, for eksempel gjennomsnittsvolumet av glomeruli og volumforholdet mellom glomeruli og valgt område, kunne utarbeides. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tissue-clearing teknologier kan klassifiseres i 3 eller 4 grupper 29,30,31. Organisk løsemiddelbasert vevsfjerning (f.eks. DISCO og PEGASOS), vandig vevsrydding (f.eks. CUBIC) og hydrogelinnebygging av vevsfjerning (f.eks. CLARITY) har alle blitt brukt i nyrerydding 25,26,28,32. CUBIC, som vi har vist, fungerer best når glomeruli (fartøyene) er merket med FITC-Dextran. I tillegg har CUBIC en relativt mer praktisk operasjonsprosess og krever ikke mer enn vanlige mikroskopiske linser27, da de behandlede prøvene ikke trenger å bli gjennomvåt i organiske reagenser33. Imidlertid har forskjellige clearingmetoder og fartøysmerkingsmetoder sine egne fordeler og ulemper; Forskere må kanskje eksperimentere med ulike tilnærminger for å møte deres spesifikke behov.
Tidligere studier la merke til at glomeruli kunne merkes i ryddede nyrer når blodårene i nyrene ble merket 13,25,26,28. En grundig forklaring på dette fenomenet må fortsatt undersøkes nærmere, men det kan utledes at en god merkingsmetode for det vaskulære systemet også effektivt merker glomeruli. Basert på de eksperimentelle resultatene vil vi anbefale intravaskulær injeksjon av FITC-Dextran med middels molekylvekt (for eksempel 150 kDa). Men siden merking er avhengig av blodsirkulasjon, kan denne metoden ikke merke glomeruli når de mangler sirkulasjon.
LSFM tillater storskala vevsobservasjon, noe som gjør den mer egnet for deteksjon av hele nyreglomeruli. Imidlertid kan lysarkmikroskoper ikke være tilgjengelige i alle laboratorier. Så vi gir et alternativt sett med protokoller ved hjelp av vanlige konfokale mikroskoper. Selv om nyrene må kuttes i flere seksjoner, er det mulig å skaffe data som antall og volum av glomeruli i hele nyrene. Dessuten gir konfokalmikroskopi et mindre volum data, som er mer databehandlingsvennlig.
Imaris gir direkte datautgang. Imidlertid bør det utvises forsiktighet for å matche det analoge signalet til originalen nøye. I tillegg kan programvaren ta lang tid å behandle store filer, noe som kan være frustrerende. Så lenge glomeruli kan merkes og visualiseres tydelig, er det mer enn en unik løsning for dataanalyse. Forskere fra forskjellige laboratorier kan jobbe med sin egen kjente programvare og programmeringsspråk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (82204951) og Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V.
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
