Summary
Denne undersøgelse præsenterer et brugervenligt, komplet og simpelt sæt metoder til at mærke og analysere glomeruli fra CUBIC-ryddede musenyrer. Data såsom glomerulus antal og volumen kan opnås let og pålideligt ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC)-Dextran, lysark fluorescens mikroskopi (LSFM), eller fælles konfokal mikroskopi og software såsom Imaris.
Abstract
Glomeruli er grundlæggende enheder i nyrerne; Derfor er undersøgelse af glomeruli afgørende for forståelsen af nyrefunktion og patologi. Biologisk billeddannelse giver intuitiv information; Det er således af stor betydning at mærke og observere glomeruli. Imidlertid kræver glomeruli-observationsmetoderne, der i øjeblikket er i brug, komplicerede operationer, og resultaterne kan miste etiketdetaljer eller tredimensionel (3D) information. Den klare, uhindrede hjernebilleddannelsescocktails og beregningsanalyse (CUBIC) vævsrensningsteknologi er blevet brugt i vid udstrækning i nyreforskning, hvilket giver mulighed for mere nøjagtig detektion og dybere detektionsdybde. Vi fandt ud af, at museglomeruli hurtigt og effektivt kan mærkes ved haleveneinjektion af FITC-Dextran med medium molekylvægt efterfulgt af CUBIC clearing-metoden. Den ryddede musenyre kunne scannes af et lysarkmikroskop (eller et konfokalmikroskop, når det skæres) for at opnå tredimensionelle billedstakke af alle glomeruli i hele nyrerne. Behandlet med passende software kunne glomeruli-signalerne let digitaliseres og analyseres yderligere for at måle antallet, volumenet og frekvensen af glomeruli.
Introduction
Antallet og mængden af glomeruli er meget vigtigt for diagnosticering og behandling af forskellige nyresygdomme 1,2,3,4,5. Den gyldne standard for glomeruli nummer estimering er den fysiske dissektor / fraktionator kombination. Denne metode kræver dog specielle reagenser og udstyr, hvilket gør den langsom og dyr 6,7,8,9. Biopsi giver et væld af oplysninger, men denne metode er naturligvis kun egnet til grove estimater10,11. Medicinske billeddannelsesteknologier, herunder magnetisk resonansbilleddannelse (MR), computertomografi (CT) og røntgen, anvendes også i vid udstrækning i glomerulær detektion 12,13,14,15, men sådanne teknologier kræver omfangsrige instrumenter. Nye metoder, såsom matrixassisteret laserdesorption / ionisering (MALDI) billeddannelsemassespektrometer 16 eller tyk og tynd sektion metode17, er også blevet brugt til glomerulær detektion, selvom de forbliver kedelige og besværlige.
Ved hjælp af gennemsigtighedsteknologier er det muligt at observere dybere dybder og opnå rigere og mere komplet information fra tykt væv eller endda hele organer 18,19,20,21,22,23. Derfor er gennemsigtighedsteknologier blevet anvendt i vid udstrækning i nyreforskning24. Observation og påvisning af glomeruli i de ryddede nyrer er også involveret. Imidlertid henviste disse offentliggjorte artikler enten kun kort til glomerulær detektion25 eller brugte vanskelige at opnå mærkningsmetoder såsom transgene dyr26, selvproducerede farvestoffer13 eller antistofinkubation med høj koncentration27 til mærkning af glomeruli. Hertil kommer, at selv om undersøgelser havde analyseret glomeruli i ryddede nyrer, var analyserne altid begrænsede13 eller baseret på analysealgoritmer etableret af forfatterne selv26.
Vi har tidligere demonstreret en mere bekvem måde at mærke glomeruli hos mus nyrer28. Ved at bruge Imaris fandt vi, at glomerulital, frekvens og volumen hurtigt kunne opnås. Således præsenterer vi her et mere tilgængeligt, omfattende og forenklet sæt metoder til mærkning og analyse af glomeruli hos mus nyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne C57BL/6-mus (6 uger, 25-30 g) blev anvendt i dette studie. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med lokale regler for dyrevelfærd og eksperimentel etik. Undersøgelsen blev godkendt af West China Hospital of Sichuan University Biomedical Research Ethics Committee.
1. Glomeruli mærkning og vævsforberedelse
- Glomeruli mærkning
- FITC-dextran (10 mg) opløses i 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i forholdet 1:1 (1 mg: 1 ml) for at forberede arbejdssondeopløsningen.
BEMÆRK: Arbejdsløsningen kan opbevares ved 4 °C i 1 måned. - Placer C57-musen i en musehalevenefiksator. Våd gasbindet med varmt vand, vikl gasbindet rundt om den midterste del af musehalen og varm halen i 1 min.
- Tør musehalen af med 75% ethanol, indtil venstre og højre hale er synlige.
- Træk 100 μL af arbejdssondeopløsningen med en 1 ml insulinsprøjte og injicer langsomt opløsningen i musehalevenen.
- Efter injektion lades sondeopløsningen cirkulere i 30 minutter. Lad musene bevæge sig frit i deres bure.
- Når tilstrækkelig cirkulation er opnået, bedøves musene dybt ved intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital (1%, 60-80 μg / kg).
- FITC-dextran (10 mg) opløses i 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i forholdet 1:1 (1 mg: 1 ml) for at forberede arbejdssondeopløsningen.
- Prøvetagning og fiksering af nyrer
- Fastgør de bedøvede mus til den anatomiske plade i liggende stilling. Fastgør deres poter med medicinsk tape.
- Efter hudforberedelse aflives musene med en dødelig dosis natriumpentobarbital (1%, 10 mg / kg).
- Lav et midterlinie abdominal snit for at udsætte bughulen.
- Afslør nyrerne og fjern dem med en skalpel og saks i damphætten. Fjern nyrehylsteret forsigtigt.
- Opsaml nyrerne og fiksér dem i 4% paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C natten over.
- Prøverne vaskes med PBS tre gange 1 time hver med omrystning ved stuetemperatur (RT).
- Forbered nyrerne til mikroskopi.
- Skær nyren til konfokal mikroskopi: Skær nyren i 1 mm tykke skiver ved hjælp af hjernematrixen (1 mm stål, 40-75 g) for at standardisere skivetykkelsen. Overfør skiverne til 4% PFA og fortsæt fikseringen ved 4 °C natten over.
- Hele nyren til lysarkmikroskopi: Fastgør nyrerne i 4% PFA ved 4 °C i 48 timer.
2. Rydning
- Fremstilling af reagens
- Der fremstilles KUBIC-L-reagens ved at blande 10 % (vægt/vægt) N-butyldiethanolamin, 10 % (vægt/vægt) Triton X-100 og 80 %ddH2O.
- Forbered CUBIC-R-reagens ved at blande 45% (vægt/vægt) antipyrin, 30% (vægt/vægt) nikotinamid, 0,5% (vol/vol) N-butyldiethanolamin og 24,5%ddH2O. Sørg for, at opløsningen har en pH-værdi på 9,6-9,8 og et brydningsindeks (RI) på 1,522.
BEMÆRK: CUBIC-L bruges til delipidering, og CUBIC-R bruges til brydningsindeksmatchning.
- Procedure for clearing
- Nyreprøverne samles i et 50 ml centrifugerør og ryddes derefter i CUBIC-L med omrystning ved 60 o/min ved 37 °C. Udskift CUBIC-L hver 4. time (for nyreskiver) eller hver 24. time (for en hel nyre), indtil der opnås tilfredsstillende optisk gennemsigtighed.
BEMÆRK: Denne proces tager 1 dag for nyreskiver og 5 dage for en hel nyre. - Prøverne vaskes tre gange i PBS under forsigtig omrystning ved RT i hver 1 time.
- CUBIC-R påføres prøverne, idet prøverne rystes ved 37 °C, 60 o/min i 6 timer.
- Overhold de rensede prøver direkte eller opbevar dem i sorte rør fyldt med CUBIC-R ved RT i 1 uge.
- Nyreprøverne samles i et 50 ml centrifugerør og ryddes derefter i CUBIC-L med omrystning ved 60 o/min ved 37 °C. Udskift CUBIC-L hver 4. time (for nyreskiver) eller hver 24. time (for en hel nyre), indtil der opnås tilfredsstillende optisk gennemsigtighed.
3. Optagelse af billeder
- Konfokal billeddannelse
BEMÆRK: Billede de skiveskårne nyreprøver med konfokal mikroskopi (linser: A Plan Apo λ 4×/0.2 N1 mål eller en Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1 mål). Tag store billeder (f.eks. 6052 μm x 6052 μm for nyreskiven) med z-stakke.- Tænd for det konfokale mikroskop i følgende rækkefølge: lasereffekt, konfokal kontrolkontakt, computer, mikroskop og konfokal hardware. Når du har kørt selvtesten, skal du tænde for den konfokale software.
- Vælg det relevante objektiv. Prøven fjernes fra CUBIC-R-reagenset, anbringes i konfokalskålen og dækkes til for at forhindre, at CUBIC-R-reagenset tørrer ud.
- Flyt prøven til midten af synsfeltet, og juster brændplanet, indtil det er i fokus.
- Anvend 3D-rekonstruktion (trin 3.1.4.1) og stor billedrekonstruktion (trin 3.1.4.2-3.1.4.3).
- 3D-rekonstruktion (konfokal): Skift zoomplanet i én retning, indtil ingen fluorescens er synlig; Denne position er defineret som toppen. Skift derefter zoomplanet i den modsatte retning, indtil der ikke er nogen fluorescens synlig; Denne position er defineret som bunden. Klik på knappen Kør i nederste højre hjørne af dialogboksen for at starte scanningen.
- Stor billedrekonstruktion (konfok): Flyt synsfeltet til midten af eksemplet, og indstil den aktuelle position som centrum. Vælg et synsfelt på 2 x 2.
- I ND-multifunktionsgrænsefladen skal du vælge Z-stakken for at rekonstruere store billeder og indstille forskellige indstillinger i panelet. Tryk derefter på Kør butto n for at starte scanningen.
- Lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM) billeddannelse
BEMÆRK: Billede hele nyrerne med et lysarkfluorescensmikroskop (linse: EC Plan-Neofluar 5x / 0.16 (medium n = 1.529) mål).- Prøvefastgørelse (LSFM):
- Lim den gennemsigtige nyre på prøvefastgørelsesadapteren, og vent, indtil nyren er ordentligt fastgjort.
- Sug nyren i prøvebeholderen, og skub prøvebeholderen ind i mikroskopsystemet. Luk lugen.
- Overvåg og scan (LSFM):
- I grænsefladen Find skal du flytte prøven til en passende observationsposition. Skift til anskaffelsesgrænsefladen , indstil den optiske sti, vælg 488 nm laser, LBF 405/488/561/640, optisk opdelingsfilterblok SBS LP 490, vælg Kamera 2, og skift pseudofarven til grøn.
- Udfyld venstre/højre Z-forskydningsværdien , der blev registreret tidligere i undermenuen Kanal . Vælg den mindste zoom (0,36), og finjuster den for at opnå maksimal klarhed.
- Find X\Y-grænsen og Z-området for hele orglet. Juster laserintensiteten og eksponeringstiden (helst mindre end 10 ms), og klik på Kør for at starte.
- Hvis vævet er for stort, skal du flette to eller flere billeder med billedsøm. Åbn den optagne fil ved hjælp af mikroskopisoftwaren (her ZEISS ZEN 3.7). Vælg Behandling > Metode > syning > metodeparameter > Anvend for at fuldføre billedsyning.
- Prøvefastgørelse (LSFM):
4. Databehandling og kvantificering
BEMÆRK: Behandl billedstablerne med Imaris-software (billedanalyse) ved hjælp af Surface-funktionen til at mærke glomeruli og udføre analyse.
- Greven af glomeruli
- Importer store billeder (konfokal mikroskopi) eller syede billeder (lysarkmikroskopi) til billedanalysesoftwaren.
- Åbn filerne i billedanalysesoftwaren. Klik på knappen Surface for at oprette en ny Surface. Følg vejledningen nederst til venstre på skærmen.
- Klik på knappen Næste (højre pileknap) uden at markere noget.
- Markér afkrydsningsfeltet før indstillingen Udglat , og indtast et korrekt tal (f.eks. 14,5) for at kontrollere detaljerne på overfladen. Vælg Baggrundssubtraktion i Tærskelværdi, og udfyld feltet med glomeruliens omtrentlige gennemsnitlige diameter. Klik på knappen Næste .
- Juster om nødvendigt, og klik på knappen Næste . Vælg det korrekte område, og klik på knappen Næste for at oprette en Surface.
- Klik på Filter og derefter knappen Tilføj for at tilføje Sfæricitet for at filtrere ikke-sfæriske objekter fra. Klik på knappen Dubler for at kopiere denne nye overflade.
- Klik på knappen Statistik , og klik derefter på knappen Generelt ; Softwaren præsenterer antallet af glomeruli som det samlede antal overflader.
- Volumen af glomeruli
- Opret en overflade af glomeruli som ovenfor.
- Når overfladen er færdig, skal du klikke på knappen Markering for at markere målobjekterne og præsentere lydstyrken for hvert objekt. Klik på knappen Gem , og eksporter statistik til et regneark til yderligere analyse.
- Volumen af skiven eller hele nyren
- Importer store billeder (konfokal mikroskopi) eller syede billeder (lysarkmikroskopi) til billedanalysesoftwaren.
- Åbn filer i billedanalysesoftwaren. Klik på knappen Surface for at oprette en ny Surface. Følg vejledningen nederst til venstre på skærmen.
- Klik på knappen Næste (højre pileknap) uden at markere.
- Markér afkrydsningsfeltet før indstillingen Udglat , og indtast et korrekt tal (f.eks. 50) for at kontrollere detaljerne på overfladen. Vælg Absolut intensitet i Tærskelværdi. Klik på knappen Næste .
- Juster overfladen, indtil den dækker hele vævet, og klik på knappen Næste . Klik på knappen Næste for at oprette Surface.
- Klik på knappen Valg for at vælge overfladen af hele vævet og præsentere vævets volumen. Klik på knappen Gem for at eksportere statistik til et regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse giver en enkel og effektiv metode til mærkning og analyse af glomeruli hos mus nyrer.
Glomeruli (blodkar) kan mærkes godt ved intravaskulært injiceret FITC-Dextran. Efter clearingprocessen blev nyrerne gennemsigtige (figur 1A), og glomeruli kunne tydeligt observeres ved hjælp af lysarkmikroskopi (figur 1B) eller konfokalmikroskopi (figur 1C). Konfokal mikroskopi har en begrænset scanningsdybde, så nyrerne skal skæres i ca. 1 mm tykke skiver. Hvis der anvendes et lysarkmikroskop, kan hele nyren scannes direkte.
Med de klare signaler var det let at tælle antallet af glomeruli. Faktisk var mærkningen så effektiv, at glomeruli kunne tælles med det blotte øje. Volumenet af glomeruli kunne også måles direkte. Selvfølgelig accelererede software som Imaris denne proces kraftigt. Ved hjælp af overfladefunktionen kunne alle glomeruli i en nyreskive (figur 2), i en hel nyre (figur 3) eller i en strimmel (figur 4) vælges, og antallet og volumenet af glomeruli kunne opnås direkte (figur 2C, figur 3C, figur 4C). Volumenet af den valgte region kunne også måles (figur 2B, figur 3B, figur 4B), så glomerulivolumenforholdet og frekvensen i en bestemt region eller i hele nyren kunne beregnes (figur 2D, figur 3D, figur 4D). Et område af nyrerne kunne vælges til at udføre beregninger i bestemte regioner. Vi præsenterede en strimmel svarende til en biopsi. Antallet, volumenet og frekvensen af glomeruli i strimlen kunne også let fås (figur 4).
Som det fremgår af figurerne, er resultaterne præsenteret i denne undersøgelse (N = antal, F = frekvens, V = volumen, V (a) = gennemsnitligt volumen, V (t) = samlet volumen):
Nglomeruli i skive = 1128, Nglomeruli i hel nyre = 14006, Fglomerulær i skive = 65 pr. mm3, Fglomerulær i hel nyre = 105 pr. mm3, Vtotal glomeruli i skive/Vskive = 2,24%, Vtotal glomeruli i hele nyre/Vnyre = 5,54%, V(a)glomeruli i skive = 373654 μm3, V(a)glomeruli i hel nyre = 521627 μm3, V(t)glomeruli i skive = 421481724 μm3, V(t)glomeruli i hele nyren = 7305386256 μm3 (figur 2D, figur 3D).
Nglomeruli i strimmel = 63, Fglomeruli i strimler = 72 pr. mm3, Vtotal glomeruli i strimmel/Vstrip = 2,23%, V(a)glomeruli i strip = 307698 μm3, V(t)glomeruli i strip = 19384977 μm3 (figur 4D).
Figur 1: Nyrevæv gennemsigtighed og FITC-dextran-mærket glomeruli. (A) Nyre før og efter transparensbehandling. (B) Billedet af en hel nyre scannet med LSFM. (C) Billedet af et stykke nyre scannet med det konfokale mikroskop (venstre: 4x, højre: 10x). skalabjælke = 300 μm (4x, konfokal); skalabjælke = 100 μm (10x, konfokal).; skalabjælke = 700 μm (5x, zoom 0,36, LSFM). Glomeruli blev mærket med FITC-Dextran. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Funktionen Overflade påført den konfokale scannede nyreskive. (A) Overfladen af skiven og alle glomeruli oprettes. Pink = glomeruli, blå = ud Nyreskivens overflade, grøn = original etiket af kar (glomeruli og nogle store kar). Skalabjælke = 300 μm. (B) Når overfladen af skiven (venstre) eller glomeruli (højre) er valgt (valgte objekter bliver gule), kan data hentes direkte (stiplede bokshøjdepunkter, hvor dataene vises). (C) Antallet, volumenet af hver enkelt glomerulus og volumenet af total glomeruli kunne fås direkte såvel som skivens volumen. (D) Eksporterede data kunne analyseres yderligere, så beregningen, såsom det gennemsnitlige volumen af glomeruli og volumenforholdet mellem glomeruli og det valgte område, kunne udarbejdes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Funktionen Overflade anvendt på LSFM-scannet hele nyre. (A) Overfladen af hele nyren og alle glomeruli skabes. Pink = glomeruli, blå = ud Overflade af hele nyren, grøn = original etiket af fartøjer (glomeruli og nogle store kar). Skalabjælke = 1000 μm. (B) Når nyrens overflade (venstre) eller glomeruli (højre) er valgt (valgte objekter bliver gule), kan data fås direkte (stiplede bokshøjdepunkter, hvor de viser dataene). (C) Antallet, volumenet af hver enkelt glomerulus og antallet af glomeruli kunne fås direkte, såvel som nyrens volumen. (D) Eksporterede data kunne analyseres yderligere, så beregningen, såsom det gennemsnitlige volumen af glomeruli og volumenforholdet mellem glomeruli og hele nyrerne, kunne udarbejdes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Funktionen Overflade påført den valgte nyrestrimmel. (A) Overfladen af strimlen og alle glomeruli oprettes. Pink = glomeruli, blå = ud Nyrestrimlens overflade, grøn = original etiket af kar (glomeruli og nogle store kar). Skalabjælke = 150 μm. (B) Når overfladen af strimlen (venstre) eller glomeruli (højre) er valgt (valgte objekter bliver gule), kan data fås direkte (stiplede bokshøjdepunkter, hvor dataene vises). (C) Antallet, volumenet af hver enkelt glomerulus og volumenet af total glomeruli kunne fås direkte, såvel som båndets volumen. (D) Eksporterede data kunne analyseres yderligere, så beregningen, såsom det gennemsnitlige volumen af glomeruli og volumenforholdet mellem glomeruli og det valgte område, kunne udarbejdes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vævsrensningsteknologier kan klassificeres i 3 eller 4 grupper 29,30,31. Organisk opløsningsmiddelbaseret vævsrensning (f.eks. DISCO og PEGASOS), vandig vævsrensning (f.eks. CUBIC) og hydrogelindlejringsvævsrensning (f.eks. CLARITY) er alle blevet anvendt til nyrerensning 25,26,28,32. CUBIC, som vi har demonstreret, fungerer bedst, når glomeruli (kar) er mærket med FITC-Dextran. Derudover har CUBIC en relativt mere bekvem betjeningsproces og kræver ikke mere end almindelige mikroskopiske linser27, da de behandlede prøver ikke behøver at blive gennemblødt i organiske reagenser33. Forskellige clearingmetoder og beholdermærkningsmetoder har imidlertid deres egne fordele og ulemper; Forskere kan være nødt til at eksperimentere med forskellige tilgange for at imødekomme deres specifikke behov.
Tidligere undersøgelser bemærkede, at glomeruli kunne mærkes i ryddede nyrer, når blodkarrene i nyrerne blev mærket 13,25,26,28. En grundig forklaring på dette fænomen skal stadig undersøges yderligere, men det kan udledes, at en god mærkningsmetode til vaskulærsystemet også effektivt mærker glomeruli. Baseret på de eksperimentelle resultater vil vi anbefale intravaskulær injektion af FITC-Dextran med en medium molekylvægt (såsom 150 kDa). Men da mærkning er afhængig af blodcirkulationen, kan denne metode muligvis ikke mærke glomeruli, når de mangler cirkulation.
LSFM tillader storskala vævsobservation, hvilket gør det mere egnet til helnyreglomeruli-detektion. Imidlertid er lysarkmikroskoper muligvis ikke tilgængelige i alle laboratorier. Så vi leverer et alternativt sæt protokoller ved hjælp af almindelige konfokale mikroskoper. Selvom nyren skal skæres i flere sektioner, er det muligt at indhente data såsom tællinger og volumen af glomeruli i hele nyren. Desuden giver konfokal mikroskopi en mindre mængde data, hvilket er mere databehandlingsvenligt.
Imaris giver direkte dataoutput. Man skal dog sørge for at matche det analoge signal til originalen nøje. Derudover kan softwaren tage lang tid at behandle store filer, hvilket kan være frustrerende. Så længe glomeruli tydeligt kan mærkes og visualiseres, er der mere end en unik løsning til dataanalyse. Forskere fra forskellige laboratorier kunne arbejde med deres egen velkendte software og programmeringssprog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (82204951) og Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V.
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
