Summary
Este estudio presenta un conjunto de métodos fáciles de usar, completos y simples para etiquetar y analizar glomérulos de riñones de ratón aclarados por CUBIC. Los datos como el número y el volumen del glomérulo se pueden obtener de forma fácil y fiable utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextrano, microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) o microscopía confocal común y software como Imaris.
Abstract
Los glomérulos son unidades fundamentales en el riñón; Por lo tanto, el estudio de los glomérulos es fundamental para comprender la función renal y la patología. Las imágenes biológicas proporcionan información intuitiva; Por lo tanto, es de gran importancia etiquetar y observar los glomérulos. Sin embargo, los métodos de observación de glomérulos que se utilizan actualmente requieren operaciones complicadas y los resultados pueden perder detalles de la etiqueta o información tridimensional (3D). La tecnología de limpieza de tejidos de análisis computacional (CUBIC) y cócteles de imágenes cerebrales transparentes y sin obstrucciones se ha utilizado ampliamente en la investigación renal, lo que permite una detección más precisa y una profundidad de detección más profunda. Descubrimos que los glomérulos de ratón pueden marcarse rápida y eficazmente mediante la inyección en la vena de la cola de FITC-Dextrano de peso molecular medio, seguida del método de aclaramiento CUBIC. El riñón de ratón aclarado podría escanearse con un microscopio de lámina de luz (o un microscopio confocal cuando se corta) para obtener pilas de imágenes tridimensionales de todos los glomérulos de todo el riñón. Procesadas con el software adecuado, las señales de los glomérulos podrían digitalizarse fácilmente y analizarse más a fondo para medir el número, el volumen y la frecuencia de los glomérulos.
Introduction
El número y el volumen de los glomérulos son muy importantes para el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades renales 1,2,3,4,5. El estándar de oro de la estimación del número de glomérulos es la combinación física de disector/fraccionador. Sin embargo, este método requiere reactivos y equipos especiales, lo que lo hace lento y costoso 6,7,8,9. La biopsia proporciona una gran cantidad de información, pero obviamente, este método solo es adecuado para estimaciones aproximadas10,11. Las tecnologías de imágenes médicas, como la resonancia magnética (RM), la tomografía computarizada (TC) y los rayos X, también se utilizan ampliamente en la detección glomerular 12,13,14,15, pero estas tecnologías requieren instrumentos voluminosos. También se han utilizado nuevos métodos, como el espectrómetro de masas de imágenes de imágenes por láser asistido por matriz (MALDI)16 o el método de sección gruesa y delgada17, en la detección glomerular, aunque siguen siendo tediosos y laboriosos.
Con la ayuda de las tecnologías de transparencia, es posible observar profundidades más profundas y obtener información más rica y completa de tejidos gruesos o incluso de órganos enteros 18,19,20,21,22,23. Por lo tanto, las tecnologías de transparencia han sido ampliamente utilizadas en la investigación renal24. También está implicada la observación y detección de glomérulos en los riñones aclarados. Sin embargo, estos artículos publicados solo se refirieron brevemente a la detección glomerular25 o utilizaron métodos de etiquetado difíciles de lograr, como animales transgénicos26, colorantes autoproducidos13 o incubación de anticuerpos de alta concentración27 para etiquetar los glomérulos. Además, a pesar de que los estudios habían analizado glomérulos en riñones aclarados, los análisis siempre fueron limitados13 o se basaron en algoritmos de análisis establecidos por los propios autores26.
Anteriormente hemos demostrado una forma más conveniente de etiquetar los glomérulos en riñones de ratones28. Mediante el uso de Imaris, descubrimos que el recuento, la frecuencia y el volumen de los glomérulos se podían obtener rápidamente. Por lo tanto, aquí presentamos un conjunto de métodos más accesibles, completos y simplificados para etiquetar y analizar los glomérulos de los riñones de ratones.
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Protocol
En este estudio se utilizaron ratones adultos C57BL/6 (6 semanas de edad, 25-30 g). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las regulaciones locales de bienestar animal y ética experimental. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Biomédica del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan.
1. Marcaje de glomérulos y preparación de tejidos
- Etiquetado de glomérulos
- Disolver FITC-dextrano (10 mg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x en una proporción de 1:1 (1 mg: 1 mL) para preparar la solución de sonda de trabajo.
NOTA: La solución de trabajo puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes. - Coloque el ratón C57 en un fijador de venas de cola de ratón. Humedece la gasa con agua caliente, envuélvela alrededor de la parte media de la cola del ratón y caliéntala durante 1 minuto.
- Limpie la cola del ratón con etanol al 75% hasta que las venas de la cola izquierda y derecha sean visibles.
- Extraiga 100 μL de la solución de la sonda de trabajo con una jeringa de insulina de 1 ml e inyecte lentamente la solución en la vena de la cola del ratón.
- Después de la inyección, deje que la solución de la sonda circule durante 30 minutos. Deja que los ratones se muevan libremente en sus jaulas.
- Una vez que se logre una circulación suficiente, anestesiar profundamente a los ratones mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (1%, 60-80 μg/kg).
- Disolver FITC-dextrano (10 mg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x en una proporción de 1:1 (1 mg: 1 mL) para preparar la solución de sonda de trabajo.
- Toma de muestras y fijación de riñón
- Fijar los ratones anestesiados a la placa anatómica en posición supina. Asegure sus patas con cinta médica.
- Después de la preparación de la piel, eutanasiar a los ratones con una dosis letal de pentobarbital sódico (1%, 10 mg/kg).
- Haga una incisión en la línea media del abdomen para exponer la cavidad abdominal.
- Revela los riñones y retíralos con un bisturí y unas tijeras en la campana extractora. Retire la envoltura renal con cuidado.
- Recoja los riñones y fíjelos en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C durante la noche.
- Lavar las muestras con PBS tres veces 1 h cada una con agitación a temperatura ambiente (RT).
- Preparar el riñón para la microscopía.
- Cortar el riñón para microscopía confocal: Cortar el riñón en rodajas de 1 mm de grosor utilizando la matriz cerebral (acero de 1 mm, 40-75 g) para estandarizar el grosor de la rebanada. Transfiera las rodajas a PFA al 4% y continúe la fijación a 4 °C durante la noche.
- Riñón completo para microscopía de lámina óptica: Fijar los riñones en PFA al 4% a 4 °C durante 48 h.
2. Compensación
- Preparación de reactivos
- Prepare el reactivo CUBIC-L mezclando 10% (peso/peso) de N-butildietanolamina, 10% (peso/peso) Triton X-100 y 80% ddH2O.
- Prepare el reactivo CUBIC-R mezclando 45% (peso/peso) de antipirina, 30% (peso/peso) de nicotinamida, 0,5% (vol/vol) de N-butildietanolamina y 24,5% ddH2O. Asegúrese de que la solución tenga un pH de 9,6-9,8 y un índice de refracción (IR) de 1,522.
NOTA: CUBIC-L se utiliza para la desinfección y CUBIC-R se utiliza para la coincidencia del índice de refracción.
- Procedimiento de compensación
- Recoja las muestras de riñón en un tubo de centrífuga de 50 ml y luego límpielas en CUBIC-L agitando a 60 rpm a 37 °C. Reemplace CUBIC-L cada 4 h (para cortes de riñón) o cada 24 h (para un riñón completo) hasta lograr una transparencia óptica satisfactoria.
NOTA: Este proceso tarda 1 día para los cortes de riñón y 5 días para un riñón completo. - Lave las muestras tres veces en PBS agitando suavemente a RT durante 1 h cada una.
- Aplicar CUBIC-R a las muestras, agitando las muestras a 37 °C, 60 rpm durante 6 h.
- Observe las muestras aclaradas directamente o guárdelas en tubos negros llenos de CUBIC-R en RT durante 1 semana.
- Recoja las muestras de riñón en un tubo de centrífuga de 50 ml y luego límpielas en CUBIC-L agitando a 60 rpm a 37 °C. Reemplace CUBIC-L cada 4 h (para cortes de riñón) o cada 24 h (para un riñón completo) hasta lograr una transparencia óptica satisfactoria.
3. Adquisición de imágenes
- Imágenes confocales
NOTA: Tome imágenes de las muestras de riñón cortadas con microscopía confocal (lentes: un objetivo Plan Apo λ 4×/0.2 N1 o un objetivo Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1). Capture imágenes grandes (p. ej., 6052 μm x 6052 μm para el corte de riñón) con pilas z.- Encienda el microscopio confocal en la siguiente secuencia: potencia láser, interruptor de control confocal, computadora, microscopio y hardware confocal. Después de ejecutar la autocomprobación, encienda el software confocal.
- Seleccione la lente adecuada. Retire la muestra del reactivo CUBIC-R, colóquela en la placa confocal y cúbrala para evitar que el reactivo CUBIC-R se seque.
- Mueva la muestra al centro del campo de visión y ajuste el plano focal hasta que esté enfocada.
- Aplique la reconstrucción 3D (paso 3.1.4.1) y la reconstrucción de imágenes grandes (pasos 3.1.4.2-3.1.4.3).
- Reconstrucción 3D (confocal): Cambie el plano del zoom en una dirección hasta que no se vea fluorescencia; Esta posición se define como la parte superior. Luego, cambie el plano de zoom en la dirección opuesta hasta que no se vea fluorescencia; Esta posición se define como la parte inferior. Haga clic en el botón Ejecutar en la esquina inferior derecha del cuadro de diálogo para iniciar el análisis.
- Reconstrucción de imagen grande (confocal): mueva el campo de visión al centro de la muestra y establezca la posición actual como centro. Seleccione un campo de visión de 2 x 2.
- En la interfaz multifunción ND, seleccione la pila Z para reconstruir imágenes grandes y establezca diferentes opciones en el panel. A continuación, pulse el botón Ejecutar para iniciar el escaneo.
- Imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM)
NOTA: Tome imágenes de los riñones enteros con un microscopio de fluorescencia de lámina de luz (lente: objetivo EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (medio n = 1.529)).- Adjuntar muestras (LSFM):
- Pegue el riñón transparente al adaptador de fijación de muestras y espere hasta que el riñón esté firmemente unido.
- Remoje el riñón en el recipiente de muestras y empuje el recipiente de muestras en el sistema de microscopio. Cierre la escotilla.
- Observar y escanear (LSFM):
- En la interfaz Localizar , mueva la muestra a una posición de observación adecuada. Cambie a la interfaz de adquisición , configure la ruta óptica, seleccione láser de 488 nm, LBF 405/488/561/640, bloque de filtro de división óptica SBS LP 490, seleccione Cámara 2 y cambie el pseudocolor a verde.
- Rellene el valor de Desplazamiento Z izquierdo/derecho grabado anteriormente en el submenú Canal . Seleccione el zoom más pequeño (0,36) y ajústelo para obtener la máxima claridad.
- Encuentre el límite X\Y y el rango Z de todo el órgano. Ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición (preferiblemente menos de 10 ms) y haga clic en Ejecutar para comenzar.
- Si el tejido es demasiado grande, combine dos o más imágenes con la unión de imágenes. Abra el archivo capturado con el software de microscopía (en este caso, ZEISS ZEN 3.7). Seleccione Método de procesamiento > > Parámetro de método de unión > > Aplicar para completar la unión de imágenes.
- Adjuntar muestras (LSFM):
4. Tratamiento y cuantificación de los datos
NOTA: Procese las pilas de imágenes con el software Imaris (análisis de imágenes), utilizando la función Superficie para etiquetar los glomérulos y realizar el análisis.
- Recuento de glomérulos
- Importe imágenes grandes (microscopía confocal) o imágenes cosidas (microscopía de lámina de luz) en el software de análisis de imágenes.
- Abra los archivos en el software de análisis de imágenes. Haga clic en el botón Surface para crear una nueva Surface. Siga la guía en la parte inferior izquierda de la pantalla.
- Haga clic en el botón Siguiente (botón de flecha derecha) sin marcar nada.
- Marque la casilla antes de la opción Suavizar e introduzca un número adecuado (por ejemplo, 14,5) para controlar el detalle de la superficie. Seleccione Resta de fondo en Umbral y rellene el cuadro con el diámetro medio aproximado de los glomérulos. Haga clic en el botón Siguiente .
- Ajústelo si es necesario y haga clic en el botón Siguiente . Seleccione el rango adecuado y haga clic en el botón Siguiente para crear una Surface.
- Haga clic en Filtrar y, a continuación, en el botón Agregar para agregar esfericidad y filtrar los objetos no esféricos. Haga clic en el botón Duplicar para copiar esta nueva superficie.
- Haga clic en el botón Estadísticas y, a continuación, haga clic en el botón General ; el software presentará el número de glomérulos como el número total de superficies.
- Volumen de los glomérulos
- Crea una superficie de los glomérulos como la anterior.
- Cuando se complete la superficie, haga clic en el botón Selección para seleccionar los objetos de destino y presentar el volumen de cada objeto. Haga clic en el botón Guardar y exporte las estadísticas a una hoja de cálculo para su posterior análisis.
- Volumen de la rebanada o del riñón entero
- Importe imágenes grandes (microscopía confocal) o imágenes cosidas (microscopía de lámina de luz) en el software de análisis de imágenes.
- Abra archivos en el software de análisis de imágenes. Haga clic en el botón Surface para crear una nueva Surface. Siga la guía en la parte inferior izquierda de la pantalla.
- Haga clic en el botón Siguiente (botón de flecha derecha) sin marcar.
- Marque la casilla antes de la opción Suavizar e introduzca un número adecuado (por ejemplo, 50) para controlar los detalles de la superficie. Seleccione Intensidad absoluta en Umbral. Haga clic en el botón Siguiente .
- Ajuste la superficie hasta que cubra todo el tejido y haga clic en el botón Siguiente . Haga clic en el botón Siguiente para crear la superficie.
- Haga clic en el botón Selección para seleccionar la superficie de todo el tejido y presentar el volumen del tejido. Haga clic en el botón Guardar para exportar estadísticas a una hoja de cálculo.
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Representative Results
Este estudio proporciona un método simple y eficiente para etiquetar y analizar los glomérulos en riñones de ratones.
Los glomérulos (vasos sanguíneos) pueden ser bien marcados por FITC-Dextrano inyectado intravascularmente. Después del proceso de limpieza, el riñón se volvió transparente (Figura 1A) y los glomérulos se pudieron observar claramente mediante el uso de microscopía de lámina de luz (Figura 1B) o microscopía confocal (Figura 1C). La microscopía confocal tiene una profundidad de exploración limitada, por lo que los riñones deben cortarse en rodajas de aproximadamente 1 mm de grosor. Si se utiliza un microscopio de lámina de luz, se puede escanear todo el riñón directamente.
Con las señales claras, era fácil contar el número de glomérulos. De hecho, el etiquetado era tan efectivo que los glomérulos se podían contar a simple vista. El volumen de los glomérulos también se puede medir directamente. Por supuesto, software como Imaris aceleró enormemente este proceso. Utilizando la función Surface, se pueden seleccionar todos los glomérulos en un corte de riñón (Figura 2), en un riñón completo (Figura 3) o en una tira (Figura 4), y se puede obtener directamente el número y el volumen de los glomérulos (Figura 2C, Figura 3C, Figura 4C). También se podía medir el volumen de la región seleccionada (Figura 2B, Figura 3B, Figura 4B), por lo que se podía calcular la relación de volumen y la frecuencia de los glomérulos en una determinada región o en todo el riñón (Figura 2D, Figura 3D, Figura 4D). Se podría seleccionar un área del riñón para realizar cálculos en regiones específicas. Presentamos una tira similar a una biopsia. También se pudo obtener fácilmente el número, el volumen y la frecuencia de los glomérulos en la tira (Figura 4).
Como se muestra en las figuras, los resultados presentados en este estudio son (N = número, F = frecuencia, V = volumen, V(a) = volumen medio, V(t) = volumen total):
Nglomérulos en corte = 1128, Nglomérulos en riñón total = 14006, Fglomerular en corte = 65 por mm3, Fglomerular en riñón total = 105 por mm3, Vglomérulos totales en corte/corte V = 2,24%,V glomérulos totales en riñón total/riñón V = 5,54%, V(a)glomérulos en corte = 373654 μm3, V(a)glomérulos en riñón total = 521627 μm3, V(t)glomérulos en corte = 421481724 μm3, V(t)glomérulos en riñón entero = 7305386256 μm3 (Figura 2D, Figura 3D).
Nglomérulos en tira = 63,F glomérulos en tira = 72 por mm3, Vglomérulos totales en tira/V tira = 2,23%, V(a)glomérulos en tira = 307698 μm3, V(t)glomérulos en tira = 19384977 μm3 (Figura 4D).
Figura 1: Transparencia del tejido renal y glomérulos marcados con FITC-dextrano. (A) Riñón antes y después del tratamiento de transparencia. (B) La imagen de un riñón completo escaneado con LSFM. (C) La imagen de un corte de riñón escaneado con el microscopio confocal (izquierda: 4x, derecha: 10x). barra de escala = 300 μm (4x, confocal); barra de escala = 100 μm (10x, confocal).; barra de escala = 700 μm (5x, zoom 0,36, LSFM). Los glomérulos fueron marcados con FITC-Dextrano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La función Superficie aplicada a la rebanada de riñón barrido confocal. (A) Se crea la superficie de la rebanada y todos los glomérulos. Rosa = glomérulos, azul = hacia afuera Superficie del corte del riñón, verde = etiqueta original de los vasos (glomérulos y algunos vasos grandes). Barra de escala = 300 μm. (B) Cuando se selecciona la superficie del corte (izquierda) o los glomérulos (derecha) (los objetos seleccionados se volverían amarillos), los datos se pueden obtener directamente (resaltado el cuadro punteado donde se muestran los datos). (C) El número, el volumen de cada glomérulo y el volumen de glomérulos totales se pueden obtener directamente, así como el volumen de la rebanada. (D) Los datos exportados podrían analizarse más a fondo para que el cálculo, como el volumen promedio de los glomérulos y la relación de volumen de los glomérulos y el área seleccionada, pudiera resolverse. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La función Superficie aplicada al riñón entero escaneado por LSFM. (A) Se crea la superficie de todo el riñón y todos los glomérulos. Rosa = glomérulos, azul = fuera Superficie de todo el riñón, verde = etiqueta original de los vasos (glomérulos y algunos vasos grandes). Barra de escala = 1000 μm. (B) Cuando se selecciona la superficie del riñón (izquierda) o los glomérulos (derecha) (los objetos seleccionados se volverían amarillos), los datos se pueden obtener directamente (se resalta el cuadro de puntos donde se muestran los datos). (C) El número, el volumen de cada glomérulo y el número de glomérulos se pueden obtener directamente, así como el volumen del riñón. (D) Los datos exportados podrían analizarse más a fondo para que se pudiera calcular el volumen promedio de glomérulos y la relación de volumen de glomérulos y todo el riñón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La función Superficie aplicada a la tira de riñón seleccionada. (A) Se crea la superficie de la tira y todos los glomérulos. Rosa = glomérulos, azul = hacia afuera Superficie de la tira renal, verde = etiqueta original de los vasos (glomérulos y algunos vasos grandes). Barra de escala = 150 μm. (B) Cuando se selecciona la superficie de la tira (izquierda) o los glomérulos (derecha) (los objetos seleccionados se volverían amarillos), los datos se pueden obtener directamente (se resalta el cuadro de puntos donde se muestran los datos). (C) El número, el volumen de cada glomérulo y el volumen de glomérulos totales se pueden obtener directamente, así como el volumen de la tira. (D) Los datos exportados podrían analizarse más a fondo para que el cálculo, como el volumen promedio de los glomérulos y la relación de volumen de los glomérulos y el área seleccionada, pudiera resolverse. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las tecnologías de limpieza de tejidos se pueden clasificar en 3 o 4 grupos 29,30,31. En la limpieza de los riñones se ha aplicado la limpieza de tejidos a base de disolventes orgánicos (p. ej., DISCO y PEGASOS), la limpieza de tejidos a base de agua (p. ej., CUBIC) y la limpieza de tejidos con incrustación de hidrogel (p. ej., CLARITY) 25,26,28,32. CUBIC, como hemos demostrado, funciona mejor cuando los glomérulos (vasos) están marcados con FITC-Dextrano. Además, CUBIC tiene un proceso de operación relativamente más conveniente y no requiere más que lentes microscópicas ordinarias27, ya que las muestras procesadas no necesitan ser empapadas en reactivos orgánicos33. Sin embargo, los diferentes métodos de limpieza y los métodos de etiquetado de recipientes tienen sus propias ventajas y desventajas; Es posible que los investigadores deban experimentar con diferentes enfoques para satisfacer sus necesidades específicas.
Estudios previos notaron que los glomérulos podían ser marcados en los riñones despejados cuando los vasos sanguíneos de los riñones estaban marcados 13,25,26,28. Todavía es necesario investigar más a fondo una explicación de este fenómeno, pero se puede deducir que un buen método de etiquetado para el sistema vascular también etiqueta eficazmente los glomérulos. Basándonos en los resultados experimentales, recomendaríamos la inyección intravascular de FITC-Dextrano con un peso molecular medio (como 150 kDa). Sin embargo, dado que el etiquetado depende de la circulación sanguínea, es posible que este método no etiquete los glomérulos cuando carecen de circulación.
El LSFM permite la observación de tejidos a gran escala, lo que lo hace más adecuado para la detección de glomérulos renales completos. Sin embargo, es posible que los microscopios de lámina de luz no estén disponibles en todos los laboratorios. Por lo tanto, estamos proporcionando un conjunto alternativo de protocolos utilizando microscopios confocales ordinarios. Aunque el riñón debe cortarse en varias secciones, es factible obtener datos como los recuentos y el volumen de glomérulos en todo el riñón. Además, la microscopía confocal proporciona un menor volumen de datos, lo que facilita el procesamiento de datos.
Imaris proporciona salida directa de datos. Sin embargo, se debe tener cuidado de hacer coincidir la señal analógica con la original. Además, el software puede tardar mucho tiempo en procesar archivos grandes, lo que puede ser frustrante. Siempre que los glomérulos puedan etiquetarse y visualizarse claramente, existe más de una solución única para el análisis de datos. Los investigadores de diferentes laboratorios podrían trabajar con su propio software y lenguajes de programación conocidos.
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Disclosures
Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82204951) y el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2020JDRC0102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
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