Summary
Organoïden die afkomstig zijn van maagpatiënten worden steeds vaker gebruikt in onderzoek, maar formele protocollen voor het genereren van menselijke maagorganoïden uit eencellige digesten met gestandaardiseerde zaaidichtheid ontbreken. Dit protocol presenteert een gedetailleerde methode voor het betrouwbaar maken van maagorganoïden uit biopsieweefsel dat is verkregen tijdens de bovenste endoscopie.
Abstract
Organoïden van maagpatiënten (BOB's) bieden een uniek hulpmiddel voor het bestuderen van maagbiologie en pathologie. Deze BOB's worden dan ook steeds vaker gebruikt in een breed scala aan onderzoekstoepassingen. Er bestaat echter een tekort aan gepubliceerde benaderingen voor het produceren van maag-BOB's uit eencellige digesten met behoud van een gestandaardiseerde initiële celzaaidichtheid. In dit protocol ligt de nadruk op het initiëren van maagorganoïden uit geïsoleerde afzonderlijke cellen en het aanreiken van een methode om organoïden door fragmentatie te laten passeren. Belangrijk is dat het protocol aantoont dat een gestandaardiseerde benadering van de initiële dichtheid van het zaaien van cellen consequent maagorganoïden oplevert uit goedaardig biopsieweefsel en een gestandaardiseerde kwantificering van organoïdegroei mogelijk maakt. Ten slotte ondersteunt bewijs de nieuwe observatie dat maag-BOB's verschillende vormings- en groeisnelheden vertonen, afhankelijk van het feit of de organoïden afkomstig zijn van biopsieën van het lichaam of antrale gebieden van de maag. In het bijzonder wordt onthuld dat het gebruik van antrale biopsieweefsel voor het initiëren van organoïden resulteert in een groter aantal gevormde organoïden en een snellere groei van organoïden over een periode van 20 dagen in vergelijking met organoïden die worden gegenereerd uit biopsieën van het maaglichaam. Het hierin beschreven protocol biedt onderzoekers een tijdige en reproduceerbare methode voor het succesvol genereren van en werken met maag-BOB's.
Introduction
Organoïden zijn miniatuur driedimensionale (3D) cellulaire structuren die lijken op de architectuur en functionaliteit van de organen waarvan ze zijn afgeleid 1,2. Deze in het laboratorium gekweekte modellen worden gemaakt door stamcellen of weefselspecifieke cellen te kweken in een gecontroleerde omgeving die deze cellen in staat stelt zichzelf te organiseren en te differentiëren in verschillende celtypen 1,2,3. Een van de belangrijkste voordelen van organoïden is hun vermogen om de menselijke biologie nauwkeuriger te recapituleren dan traditionele tweedimensionale (2D) celculturen 1,2,3. In het bijzonder is aangetoond dat menselijke organoïden de genetische diversiteit van hun weefsel van oorsprong behouden 3,4,5. Organoïden bieden een unieke kans om de ontwikkeling van menselijke organen te bestuderen, ziekten te modelleren en potentiële therapieën te testen in een gecontroleerde laboratoriumomgeving. Bovendien kunnen organoïden worden afgeleid van individuele patiëntmonsters, waardoor gepersonaliseerde geneeswijzen en de mogelijke ontwikkeling van geïndividualiseerde behandelingen mogelijk worden 3,6,7.
Onderzoekers hebben menselijke maagorganoïden gebruikt om verschillende aspecten van maagbiologie en pathologie te onderzoeken. Prominente voorbeelden zijn het gebruik van van patiënten afgeleide organoïden (BOB's) om de chemotherapierespons op maagkankerte voorspellen 8,9,10 en de epitheliale respons op Helicobacter pylori-infectie te modelleren 11,12,13. Menselijke maagorganoïden bestaan uit verschillende celtypen die in de maag worden aangetroffen, waaronder nekcellen, pitcellen en andere ondersteunende cellen 11,14. Maagorganoïden kunnen worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) of stamcellen die rechtstreeks zijn geïsoleerd uit maagweefsel dat is verkregen via biopsieën of uit maagresectiemonsters11,14. Het isoleren van maagstamcellen uit maagweefsel wordt gewoonlijk gedaan door het isoleren en kweken van maagklieren of het enzymatisch verteren van weefselmonsters om afzonderlijke cellen vrij te maken 9,13,15. Belangrijk is dat is aangetoond dat de differentiatie van cellen in maagorganoïden die met een van deze technieken zijn gegenereerd, vergelijkbaar is13. Het hierin beschreven protocol richt zich op een eencellige digestie.
Organoïden vertegenwoordigen een wetenschappelijke innovatie die de kloof overbrugt tussen traditionele celkweek en hele organen. Naarmate het onderzoek in het veld vordert, staan organoïden klaar om bij te dragen aan de ontwikkeling van effectievere behandelingen en therapieën voor een breed scala aan toepassingen. Gezien het toenemende gebruik van maag-BOB's, is er tijdig behoefte aan een gestandaardiseerde aanpak voor het genereren ervan. Hier wordt het protocol beschreven voor het genereren van BOB's in de maag van de menselijke maag uit afzonderlijke cellen die zijn geïsoleerd uit goedaardig maagbiopsieweefsel dat is verkregen tijdens de bovenste endoscopie. Belangrijk en uniek is dat een gestandaardiseerd aantal afzonderlijke cellen wordt bepaald voor zaaien om op betrouwbare wijze maag-BOB's te genereren en daaropvolgende karakterisering mogelijk te maken. Met behulp van deze techniek worden betrouwbare verschillen aangetoond in de vorming en groei van organoïden die worden gegenereerd uit biopsieën van het maaglichaam of maagantrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het menselijk weefsel dat in dit protocol wordt gebruikt, is verzameld van personen die geïnformeerde toestemming hebben gegeven voor weefselverzameling via een onderzoek naar het verzamelen van maagweefsel dat is goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB #842961) van de Universiteit van Pennsylvania. Deelnemers aan deze studie moesten een bovenste endoscopie ondergaan als onderdeel van hun routinematige zorg, ten minste 18 jaar oud zijn en geïnformeerde toestemming kunnen geven. Al het uitgevoerde onderzoek voldeed aan de richtlijnen van de Universiteit van Pennsylvania.
1. Experimentele voorbereiding
- Bereid geconditioneerde L-WRN-media voor zoals eerder beschreven16. Hoewel niet verplicht, kunnen de concentraties van Wnt-3A, R-spondine en noggin in de geconditioneerde media worden gecontroleerd met behulp van een in de handel verkrijgbare ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Bereid RPMI-antibiotica (RPMI-ABX), PBS-antibiotica (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), spijsverteringsbuffer en maagorganoïde media voor (zie aanvullende tabel 1 voor gedetailleerde samenstelling). Maagorganoïde media zijn gedurende 1 week stabiel bij 4 °C.
- Autoclaaftang, fijndissectieschaar en buisjes van 1,5 ml.
- Begin met het ontdooien van de basaalmembraanmatrix (Matrigel) op ijs.
- Begin met het ontdooien van de spijsverteringsbuffer en trypsine-EDTA in een waterbad van 37 °C.
- Stel een orbitale schudder van de couveuse in op 37 °C en 200 tpm.
2. Isoleren van afzonderlijke cellen uit het biopsieweefsel
- Verzamel maagbiopten tijdens een bovenste endoscopie17 volgens het institutionele klinische protocol, waarschijnlijk met behulp van een jumbotang. Gebruik een naald met stompe punt om weefselmonsters uit de pincet te extraheren en plaats ze in een conische buis van 15 ml met RPMI-ABX-media. Bewaar de buis op ijs voor een snelle overdracht naar het laboratorium.
OPMERKING: Er moeten minimaal 2-4 biopsieën worden verzameld. - Laat het biopsieweefsel zich op de bodem van de conische buis nestelen. Gebruik een pipet om het medium op te zuigen en was de biopsieën twee keer met 1 ml PBS-ABX-buffer. Centrifugeren is niet nodig, omdat de weefselstukjes zich op natuurlijke wijze in de conische buis nestelen.
- Breng minimaal 20 mg biopsieweefsel over in een buisje van 1,5 ml met 1 ml PBS-DTT.
- Gebruik een fijne dissectieschaar om het weefsel in stukjes van 1-2 mm of kleiner te knippen.
- Gebruik een minicentrifuge op tafel gedurende 15 seconden om weefselstukjes op de bodem van de buis samen te voegen en zoveel mogelijk supernatant op te zuigen. Een klein restvolume PBS-DTT is acceptabel.
- Voeg 5 ml vers opgewarmde digestiebuffer toe aan een conische buis van 50 ml. Om de kleine stukjes weefsel over te brengen zonder weefsel te verliezen, neemt u 500 μL van de verteringsbuffer en voegt u deze toe aan het buisje van 1,5 ml met het weefsel. Wijzig vervolgens de punt van een pipetpunt van 1000 μl met een schaar om de diameter van de punt te vergroten, zodat weefselstukjes gemakkelijk kunnen worden opgezogen en overgebracht naar de conische buis van 50 ml met de verteringsbuffer.
- Incubeer de verteringsbuffer en het weefselmengsel bij 37 °C gedurende 30 minuten met orbitaal schudden bij 200 omw/min.
- Voeg 5 ml opgewarmde trypsine met 0,25% EDTA toe aan de spijsverteringsbuffer en incubeer nog eens 10 minuten bij 37 °C met orbitaal schudden bij 200 tpm.
- Neutraliseer de digestiebuffer en trypsine door een gelijk volume Advanced (Adv.) DMEM/F12-media toe te voegen en de oplossing door een celzeef van 70 μm te leiden.
- Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 1400 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Afhankelijk van de aanvankelijke grootte van het biopsieweefsel kan een kleincellige pellet al dan niet zichtbaar zijn.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml Adv. DMEM/F12-media en tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van Trypan Blue en een hemocytometer.
- Pelleteer de cellen opnieuw door middel van centrifugeren bij 1400 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.
OPMERKING: Figuur 1 geeft een schematische weergave van het proces voor het isoleren van afzonderlijke cellen uit het biopsieweefsel.
3. Inbedding van enkele cellen in een "koepel" van een basaalmembraanmatrix
- Bereken op basis van het getelde aantal levensvatbare cellen het volume van de basaalmembraanmatrix dat nodig is om een uiteindelijke concentratie van 105 levensvatbare cellen per 50 μL basale membraanmatrix te bereiken.
- Voer het volgende snel uit om te voorkomen dat de basaalmembraanmatrix polymeriseert voordat u gaat plateren. Verwijder de ontdooide basaalmembraanmatrix van ijs, voeg het eerder berekende volume van de basaalmembraanmatrix toe aan de cellen en meng voorzichtig door ongeveer 10 s op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om tijdens deze stap geen luchtbellen te creëren. Verdun de basaalmembraanmatrix niet. - Pipetteer snel 50 μL aliquots van de basale membraanmatrix/celmix in het midden van individuele putjes in een weefselkweekplaat met 24 putjes.
- Dek de plaat met 24 putjes onmiddellijk af en draai de plaat in één vloeiende beweging ondersteboven. Plaats de omgekeerde plaat gedurende 35 minuten in een weefselkweekincubator van 37 °C om de basaalmembraanmatrix te laten polymeriseren.
OPMERKING: Het omkeren van de plaat is essentieel om te voorkomen dat de cellen naar de bodem van de plaat zinken en om de basale membraanmatrix in staat te stellen te polymeriseren tot een 3D "koepelvorm". - Voeg 500 μL voorverwarmde maagorganoïde media toe aan elk putje en zorg ervoor dat de bovenkant van elke "koepel" volledig ondergedompeld is in het medium. Doseer de media langs de zijkant van elke put om te voorkomen dat de "koepel" wordt verstoord.
- Vervang de media elke 2-3 dagen.
4. Routinematige doorgifte van organoïden via fragmentatie
- Zodra de organoïden klaar zijn om te passeren, verwijdert u de media uit elke aangewezen put.
OPMERKING: Om het juiste tijdstip voor het passeren te bepalen, raadpleegt u het gedeelte Representatieve resultaten. - Doseer 1 ml ijskoude Adv. DMEM/F12-media rechtstreeks op een "dome" van de basaalmembraanmatrix. Dit zou gemakkelijk het uiteenvallen van de "koepel" in gang moeten zetten. Ga door met opzuigen en doseren totdat alle fragmenten van de "koepel" loskomen van de plaat.
- Transporteer zowel de media als de gefragmenteerde basaalmembraanmatrix naar de volgende put en herhaal dit proces voor alle putten die gepland zijn voor passaging. Na het demonteren van de laatste "koepel" van de basaalmembraanmatrix, doseert u de media en het mengsel van organoïden en de basaalmembraanmatrix in een buis van 1,5 ml.
- Bevestig een tip van 1000 μl aan een P1000-pipet en steek deze tip vervolgens in een tip van 200 μl. Hierdoor ontstaat een pipetpunt met een diameter die klein genoeg is om de organoïden te fragmenteren, terwijl toch een groter volume kan worden opgezogen.
- Pipeteer het mengsel van organoïden en de basaalmembraanmatrix ongeveer 25 keer op en neer om de organoïden in kleine stukjes te fragmenteren.
- Centrifugeer het gefragmenteerde organoïdemengsel met behulp van een tafelcentrifuge bij 4 °C gedurende 30 s bij 2000 x g. Dit zal resulteren in een korrel van gefragmenteerde organoïden gescheiden van de basale membraanmatrix en media. Gebruik een pipet om de supernatant van de media en de basaalmembraanmatrix op te zuigen. Gebruik geen vacuüm om het supernatant op te zuigen, omdat de pellet los zit.
- Bereken het volume van de pas ontdooide basaalmembraanmatrix die nodig is, zodat het aantal putten/koepels wordt gesplitst in een verhouding van 1:2 (50 μL/koepel). Voeg de verse basaalmembraanmatrix toe en pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
- Breng snel 50 μl van het mengsel van organoïdefragmenten en basaalmembraanmatrix aan in afzonderlijke putjes van een plaat met 24 putjes.
- Dek de plaat af, draai hem ondersteboven en plaats hem gedurende 35 minuten in een weefselkweekincubator van 37 °C om de basaalmembraanmatrix te laten polymeriseren.
- Voeg 500 μL voorverwarmde maagorganoïdemedia toe aan elk putje.
OPMERKING: Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van het passeren van organoïden afkomstig van maagpatiënten door fragmentatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De daaropvolgende representatieve resultaten zijn afgeleid van biopsieën genomen uit het goedaardige epitheel van zowel het maaglichaam als de maagantrumgebieden van de maag van vijf verschillende patiënten die een bovenste endoscopie ondergaan. Twee tot vier "koepels"/putjes werden per patiënt geplateerd en geanalyseerd voor zowel maaglichaam- als antrumbiopten. Organoïden werden met succes gegenereerd uit het maaglichaam en maagantrumbiopsieweefsel van alle vijf patiënten. Gemiddeld werden er 41 organoïden per "dome"/put geanalyseerd. Alle beelden zijn z-projecties die zijn verkregen met behulp van een confocale microscoop en de kwantificering van de grootte en bolvorm van organoïden werd uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel).
Organoïden zijn over het algemeen identificeerbaar binnen 10 dagen na het zaaien van afzonderlijke cellen (Figuur 3A). Op dag 20 zijn de organoïden groot en moeten ze meestal worden gepasseerd. Hoewel het aantal organoïden dat zich vormt na het zaaien van eencellige cellen enigszins kan variëren, worden de verwachte resultaten voor het aantal organoïden dat wordt gevormd uit lichaams- en antrale maagbiopten weergegeven in figuur 3B. Het aantal lichaams- en antrale organoïden piekt op dag 10 na het zaaien. Hoewel niet significant, begint het totale aantal organoïden af te nemen van dag 10 tot dag 15 en van dag 15 tot dag 20. Er lijkt een subpopulatie te zijn van kleine organoïden die zich op dag 10 vormen en dan stoppen met groeien en afsterven in de volgende 10 dagen, wat deze trend zou verklaren. Belangrijk is dat wordt aangetoond dat het aantal organoïden gevormd uit antrale biopsieweefsel significant hoger is dan biopsieweefsel uit het lichaam op dag 10, 15 en 20. Het aantal gevormde antrale organoïden was gemiddeld 2 keer hoger dan het aantal organoïden dat uit het lichaam werd gevormd.
In figuur 3C worden representatieve resultaten getoond voor de groei van organoïden na het zaaien van eencellige cellen tussen dag 10 en dag 20. Terwijl organoïden van zowel antrale als lichaamsbiopten een gestage groei zagen van dag 10 tot 20, vertoonden organoïden gegenereerd uit antral biopsieweefsel een grotere groeisnelheid in vergelijking met organoïden gegenereerd uit lichaamsbiopsieweefsel. In het bijzonder hadden antrale organoïden op dag 20 bijna een 4-voudig groter oppervlak dan lichaamsorganoïden.
Bij verschillende patiënten wordt doorgaans een diversiteit aan organoïdemorfologie waargenomen in een enkele "koepel"/put (Figuur 4A). Sommige organoïden zijn meer rond of bolvormig, terwijl andere een meer onregelmatige morfologie vertoonden. Gemiddeld vertoonde bolvormigheid, een maat voor hoe bolvormig een organoïde is (waarbij een score van 1 = een perfecte bol)18, echter weinig variatie binnen en tussen organoïden gegenereerd uit lichaams- of antrale biopsieweefsel (Figuur 4B). Daarom, hoewel er verschillende groeisnelheden zijn, zijn er doorgaans geen significante morfologische verschillen tussen organoïden die worden gegenereerd uit biopsieweefsel van het maaglichaam of antrum.
Op dag 20 na de initiatie zijn maagorganoïden meestal klaar om te worden gepasseerd. Een grote organoïde (≥1500 μm in diameter) of een donkere binnenkant (wat wijst op een uitgebreide celvernieuwing) van de organoïde zijn belangrijke tekenen dat organoïden moeten worden gepasseerd (Figuur 5A). Organoïden die dit punt overschrijden, kunnen beginnen af te breken in 2D-monolagen (Figuur 5B) die organoïden na het passeren niet op betrouwbare wijze opnieuw vormen, wat misschien wijst op een verlies van levensvatbaarheid of stamvorming. Na het passeren en opnieuw inzaaien van maagorganoïden met behulp van het hierin beschreven fragmentatieprotocol, zullen de "koepels" veel organoïdefragmenten bevatten (Figuur 5C) die zichzelf zullen reorganiseren tot veel meer organoïden en veel sneller zullen groeien in vergelijking met het eerste zaaien van afzonderlijke cellen (Figuur 5D). Als de groei van organoïden nog moet worden gekarakteriseerd en/of gestandaardiseerd op het moment van passeren, kunnen maagorganoïden in plaats daarvan worden verteerd tot afzonderlijke cellen, zoals eerder beschreven19.
Figuur 1: Genereren van organoïden afkomstig van maagpatiënten. Schematisch overzicht van het proces van het genereren van organoïden van maagpatiënten uit biopsieën van goedaardig maagepitheel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Passaging van organoïden afkomstig van maagpatiënten. Schematisch overzicht van het passeren van organoïden afkomstig van maagpatiënten door middel van fragmentatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vorming en groei van organoïden afkomstig van maagpatiënten. (A) Representatieve z-projectiebeelden die de groei van maagorganoïden weergeven op dag 10, 15 en 20 na het zaaien van eencellige cellen. Afbeeldingen zijn van organoïden die zijn gegenereerd uit maag-, lichaams- en antrumbiopsieweefsel van dezelfde patiënt. Schaalbalk = 1 mm. (B) Gemiddeld (±SD) aantal maaglichaam- en antrumorganoïden op aangegeven tijdstippen na het zaaien van eencellige cellen. (C) Gemiddelde (±SD) oppervlakte (μm2) van organoïden van het maaglichaam en antrum op aangegeven tijdstippen na het zaaien van eencellige cellen. n = 5 patiënten per groep en tijdstip. * = statistisch significant verschil (p ≤ 0,05) op het aangegeven tijdstip. n.s. = geen statistisch significant verschil op het aangegeven tijdstip. Statistische vergelijkingen uitgevoerd via 2-weg ANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Van maagpatiënten afgeleide organoïdemorfologie. (A) Representatieve z-projectiebeelden van verschillende maagorganoïdemorfologieën van een individuele "koepel"/put van organoïden afkomstig van het maaglichaam op dag 15 na het zaaien van eencellige cellen. Schaalbalk = 200 μm. (B) Gemiddelde (±SD) bolvorm van maaglichaam en antrumorganoïde (waarbij een waarde van 1 = een perfecte bol). n = 5 patiënten per groep en tijdstip. N.S. = geen statistisch significant verschil op enig tijdstip. Statistische vergelijkingen uitgevoerd via 2-weg ANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Passages van organoïden afkomstig van de maagpatiënt. (A) Representatief beeld van organoïden die klaar zijn om te worden gepasseerd op dag 20 na het zaaien van eencellige cellen. (B) Representatief beeld van organoïden die te laat zijn voor passaging op dag 25 na het zaaien van eencellige cellen. (C) Representatief beeld van gefragmenteerde organoïden na herinzaai (Passage 1 - Dag 0). (D) Representatief beeld van de groei van organoïden gedurende 5 dagen na het opnieuw inzaaien (passage 1 - dag 5). Alle beelden zijn z-projecties. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Oplossingen en mediarecepten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin wordt een gedetailleerd protocol geschetst voor het betrouwbaar genereren van menselijke maagorganoïden uit afzonderlijke cellen geïsoleerd uit biopsieën van goedaardig epitheel uit het maaglichaam en antrum. Kritieke stappen in het protocol draaien om timing en het hanteren van de basaalmembraanmatrix. Om de levensvatbaarheid te behouden, is het essentieel om het protocol zo snel mogelijk na het verkrijgen van het biopsieweefsel te starten. Het doel is om binnen 30 minuten na de biopsie te beginnen met het verteren van het biopsieweefsel. Het hanteren van de basaalmembraanmatrix kan ook een uitdaging zijn. Wanneer het op ijs wordt ontdooid, blijft het een vloeistof; bij temperaturen boven 4 °C polymeriseert het echter. Daarom moet het snel overbrengen van de basaalmembraanmatrix van ijs om te mengen met enkele cellen of organoïdefragmenten voor het plateren van "koepels" onmiddellijk worden gedaan, aangezien het binnen een minuut begint te polymeriseren. Als het eenmaal is gepolymeriseerd in een buisje, kan het niet meer in een pipetpunt worden opgezogen. Als dit gebeurt, kan de buis op ijs worden geplaatst totdat de Matrigel weer depolymeriseert tot een vloeistof. Bij het voorzichtig op en neer pipetteren om afzonderlijke cellen of organoïdefragmenten te mengen met de basale membraanmatrix, is het ook van cruciaal belang om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Hoewel bubbels in een "koepel" van een basale membraanmatrix de vorming en groei van organoïden niet lijken te belemmeren, kunnen ze de visualisatie belemmeren. Bovendien moet de plaat, na het aliquoteren van de basaalmembraanmatrix/celmengsel in de put(jes) van een celkweekplaat, worden omgekeerd en in een incubator worden geplaatst. Deze stap is van cruciaal belang om de basale membraanmatrix te laten polymeriseren tot een 3D-"koepelvorm" en te voorkomen dat de afzonderlijke cellen of organoïdefragmenten naar de bodem van de plaat zinken.
Met behulp van dit protocol kunnen maagorganoïden binnen 10 dagen na het zaaien van eencellige cellen worden geïdentificeerd. De ervaring leert dat er na dag 10 maar heel weinig nieuwe maagorganoïden worden gevormd, en in feite kan het totale aantal organoïden vanaf dag 10-20 licht afnemen. Dit geldt voor organoïden die worden gegenereerd uit zowel het maaglichaam als het antrum. Het totale aantal organoïden dat wordt gevormd uit antrale maagbiopten is echter aanzienlijk hoger dan uit maaglichaamsbiopten. Bovendien overtreft de groei van antrale organoïden de lichaamsorganoïden tussen dag 10-20 na het zaaien van eencellige cellen. Dit verschil kan worden toegeschreven aan variaties in Wnt-gevoeligheid. Een recente studie toonde aan dat BOB's in het maaglichaam een betere groei vertonen bij een lagere Wnt-activering, terwijl BOB's in het maagantrum gedijen bij een hogere Wnt-activatie20. De locatie van maagbiopten die worden gebruikt om maag-BOB's te genereren, wordt doorgaans niet gespecificeerd in de literatuur. Dergelijke verschillen moeten worden overwogen in toekomstige studies waarbij gebruik wordt gemaakt van maag-BOB's die zijn gegenereerd uit maagbiopten van verschillende maaggebieden.
Een ander cruciaal aspect van dit protocol is het vaststellen van een gestandaardiseerd aantal afzonderlijke cellen om per "dome"/put te zaaien voor het betrouwbaar genereren van maag-BOB's. Hoewel een eerdere studie een gestandaardiseerd aantal maagklieren rapporteerde om te zaaien voor het genereren van PDO's, hebben geen eerdere studies met behulp van een methode voor het verteren van één cel het aantal gezaaide cellen vermeld of dat het aantal consistent was over verschillende PDO-lijnen. Het niet standaardiseren van het aantal gezaaide cellen kan ertoe leiden dat er een zeer variabel aantal stamcellen per "koepel"/put wordt gezaaid. Aangezien stamcellen de primaire bron zijn van de vorming van maagorganoïden, kan dit leiden tot variabele snelheden van organoïdevorming en groei. Daarom kan het gebruik van een niet-gestandaardiseerd aantal afzonderlijke cellen interpretaties van vormings- of groeivergelijkingen tussen verschillende maag-PDO-lijnen verwarren. Hier wordt aangetoond dat het standaardiseren van het aantal gezaaide cellen tot 105 cellen per "koepel"/put op betrouwbare wijze maag-BOB's genereert uit biopsieën van zowel het lichaam als de antrale gebieden van de maag.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor het gebruik van vers maagbiopsieweefsel. Bijgevolg kan het succes van dit protocol variëren bij gebruik van bevroren weefsel of weefsel dat op een andere manier is geconserveerd. Bovendien zijn er geen gegevens over hoe lang verse biopsieën levensvatbaar blijven, aangezien het biopsieweefsel zo snel mogelijk na verwijdering uit de maag van een patiënt wordt verwerkt. Vermoedelijk geldt dat hoe langer het verse weefsel blijft zitten voordat het wordt verwerkt, hoe minder levensvatbare cellen zullen worden geïsoleerd.
Het passeren van maag-BOB's via fragmentatie, zoals beschreven in dit protocol, biedt een gemakkelijke methode voor routinematige passatie. Hoewel maag-BOB's met deze techniek tot 4 keer met succes zijn gepasseerd, zijn er geen pogingen gedaan om te bepalen hoe vaak ze kunnen worden gepasseerd met behoud van gestage groei en levensvatbaarheid. Sommige rapporten geven aan dat de groei van maagorganoïden kan vertragen na 5 of meer passages 21,22, terwijl andere een betrouwbare groei hebben waargenomen tot 10 passages23.
De maagorganoïde media die in dit protocol worden gebruikt, bevatten Wnt-3A, noggin en R-spondine afgeleid van geconditioneerde media van L-WRN-cellen. Om de geconditioneerde media te produceren, wordt een protocol gebruikt dat is beschreven door Miyoshi en Stappenbeck16. Als alternatief kunnen Wnt-3A, noggin en R-spondine afzonderlijk worden gekocht als recombinante eiwitten. Het afzonderlijk aanschaffen van de afzonderlijke componenten is ideaal om mogelijke batcheffecten te voorkomen die kunnen optreden bij het gebruik van geconditioneerde media van L-WRN-cellen. Het kopen van de recombinante eiwitten is echter duur en kan onbetaalbaar zijn voor onderzoekers die vaak met organoïden werken.
Gezien het toenemende gebruik van maag-BOB's in verschillende toepassingen, is het tijdig en noodzakelijk om gestandaardiseerde benaderingen vast te stellen voor het genereren van goedaardige maag-BOB's. Het hier beschreven protocol biedt een betrouwbare methode voor toekomstig onderzoek met behulp van maag-BOB's. Onze ervaring is dat dit protocol in meer dan 90% van de gevallen met succes organoïden heeft gegenereerd uit biopsieën van goedaardig maagslijmvlies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen relevante openbaarmakingen.
Acknowledgments
Universiteit van Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & BRCA-programma in het Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H.
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S.
- Zhao, Z., et al.
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
