Estabelecimento e Caracterização de Organoides Gástricos Derivados de Pacientes a partir de Biópsias do Corpo Gástrico Benigno e Epitélio Antral

Resumo

Organoides gástricos derivados de pacientes encontram uso crescente em pesquisas, mas faltam protocolos formais para gerar organoides gástricos humanos a partir de digestores unicelulares com densidade de semeadura padronizada. Este protocolo apresenta um método detalhado para a criação confiável de organoides gástricos a partir de tecido de biópsia obtido durante a endoscopia digestiva alta.

Resumo

Os organoides derivados do paciente gástrico (DOPs) oferecem uma ferramenta única para o estudo da biologia e patologia gástrica. Consequentemente, essas DOPs encontram uso crescente em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. No entanto, existe uma escassez de abordagens publicadas para produzir PDOs gástricas a partir de digeridos de célula única, mantendo uma densidade de semeadura celular inicial padronizada. Neste protocolo, a ênfase está na iniciação de organoides gástricos a partir de células isoladas isoladas e no fornecimento de um método para passar organoides através da fragmentação. É importante ressaltar que o protocolo demonstra que uma abordagem padronizada para a densidade inicial de semeadura celular produz organoides gástricos a partir de tecido benigno de biópsia e permite a quantificação padronizada do crescimento organoide. Finalmente, as evidências apoiam a nova observação de que as DOPs gástricas exibem taxas variáveis de formação e crescimento com base no fato de os organoides se originarem de biópsias do corpo ou de regiões antrais do estômago. Especificamente, revela-se que o uso de tecido de biópsia antral para iniciação organoide resulta em maior número de organoides formados e crescimento organoide mais rápido durante um período de 20 dias quando comparado aos organoides gerados a partir de biópsias do corpo gástrico. O protocolo aqui descrito oferece aos investigadores um método oportuno e reprodutível para gerar e trabalhar com sucesso com DOPs gástricas.

Introdução

Os organoides são estruturas celulares tridimensionais (3D) em miniatura que se assemelham à arquitetura e funcionalidade dos órgãos dos quais foram derivadas ^1,2. Esses modelos cultivados em laboratório são criados a partir do cultivo de células-tronco ou células tecido-específicas em um ambiente controlado que permite que essas células se auto-organizem e se diferenciem em vários tipos celulares ^1,2,3. Uma das principais vantagens dos organoides é sua capacidade de recapitular a biologia humana mais de perto do que ....

Protocolo

Todo o tecido humano utilizado neste protocolo foi coletado de indivíduos que forneceram consentimento informado para a coleta de tecidos através de um estudo de coleta de tecido gástrico aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia (IRB #842961). Os participantes deste estudo deveriam ser submetidos a uma endoscopia digestiva alta como parte de seus cuidados de rotina, ter pelo menos 18 anos de idade e ser capazes de fornecer consentimento informado. Todas as pesquisas realizadas seguiram as diretrizes estabelecidas pela Universidade da Pensilvânia.

1. Preparação experimental

1. Prepa....

Resultados

Os resultados representativos subsequentes são derivados de biópsias retiradas do epitélio benigno das regiões do corpo gástrico e antro gástrico dos estômagos de cinco pacientes diferentes submetidos à endoscopia digestiva alta. Duas a quatro "cúpulas"/poços foram plaqueadas e analisadas por paciente para biópsias do corpo gástrico e do antro. Organoides foram gerados com sucesso a partir do corpo gástrico e tecido de biópsia do antro gástrico de todos os cinco pacientes. Em média, 41 organoides foram analisados por "cú.......

Discussão

Neste trabalho, um protocolo detalhado para a geração confiável de organoides gástricos humanos a partir de células isoladas isoladas de biópsias de epitélio benigno do corpo gástrico e antro é delineado. As etapas críticas do protocolo giram em torno do tempo, bem como do manuseio da matriz da membrana basal. Para preservar a viabilidade, é essencial iniciar o protocolo o mais rápido possível após a aquisição do tecido da biópsia. O objetivo é começar a digerir o tecido da biópsia dentro de 30 minutos após a biópsia ser.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R & D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Anfotericina B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Ditiotreitol (DTT)	EMSCO / Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicina	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Linha Celular	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazol	MP Biomedicals	155710
N2 Suplemento	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Estreptococo de caneta	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Espondina ELISA Kit	R & D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R& D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503