Summary
Organoides gástricos derivados de pacientes encontram uso crescente em pesquisas, mas faltam protocolos formais para gerar organoides gástricos humanos a partir de digestores unicelulares com densidade de semeadura padronizada. Este protocolo apresenta um método detalhado para a criação confiável de organoides gástricos a partir de tecido de biópsia obtido durante a endoscopia digestiva alta.
Abstract
Os organoides derivados do paciente gástrico (DOPs) oferecem uma ferramenta única para o estudo da biologia e patologia gástrica. Consequentemente, essas DOPs encontram uso crescente em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. No entanto, existe uma escassez de abordagens publicadas para produzir PDOs gástricas a partir de digeridos de célula única, mantendo uma densidade de semeadura celular inicial padronizada. Neste protocolo, a ênfase está na iniciação de organoides gástricos a partir de células isoladas isoladas e no fornecimento de um método para passar organoides através da fragmentação. É importante ressaltar que o protocolo demonstra que uma abordagem padronizada para a densidade inicial de semeadura celular produz organoides gástricos a partir de tecido benigno de biópsia e permite a quantificação padronizada do crescimento organoide. Finalmente, as evidências apoiam a nova observação de que as DOPs gástricas exibem taxas variáveis de formação e crescimento com base no fato de os organoides se originarem de biópsias do corpo ou de regiões antrais do estômago. Especificamente, revela-se que o uso de tecido de biópsia antral para iniciação organoide resulta em maior número de organoides formados e crescimento organoide mais rápido durante um período de 20 dias quando comparado aos organoides gerados a partir de biópsias do corpo gástrico. O protocolo aqui descrito oferece aos investigadores um método oportuno e reprodutível para gerar e trabalhar com sucesso com DOPs gástricas.
Introduction
Os organoides são estruturas celulares tridimensionais (3D) em miniatura que se assemelham à arquitetura e funcionalidade dos órgãos dos quais foram derivadas 1,2. Esses modelos cultivados em laboratório são criados a partir do cultivo de células-tronco ou células tecido-específicas em um ambiente controlado que permite que essas células se auto-organizem e se diferenciem em vários tipos celulares 1,2,3. Uma das principais vantagens dos organoides é sua capacidade de recapitular a biologia humana mais de perto do que as culturas tradicionais de células bidimensionais (2D) 1,2,3. Em particular, organoides humanos têm demonstrado manter a diversidade genética de seu tecido de origem 3,4,5. Os organoides oferecem uma oportunidade única para estudar o desenvolvimento de órgãos humanos, modelar doenças e testar potenciais terapêuticas em um ambiente laboratorial controlado. Além disso, os organoides podem ser derivados de amostras individuais de pacientes, possibilitando abordagens de medicina personalizada e o potencial desenvolvimento de tratamentos individualizados 3,6,7.
Pesquisadores têm usado organoides gástricos humanos para investigar vários aspectos da biologia e patologia gástrica. Exemplos proeminentes incluem o uso de organoides derivados do paciente (DOPs) para predizer respostas à quimioterapia do câncer gástrico 8,9,10 e modelar a resposta epitelial à infecção pelo Helicobacter pylori 11,12,13. Os organoides gástricos humanos consistem em vários tipos celulares encontrados no estômago, incluindo células do pescoço, células da fossa e outras células de suporte11,14. Os organoides gástricos podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ou células-tronco diretamente isoladas do tecido gástrico obtido por biópsias ou de espécimes de ressecção gástrica11,14. O isolamento de células-tronco gástricas do tecido gástrico é comumente feito por meio do isolamento e cultura de glândulas gástricas ou digestão enzimática de amostras de tecido para liberação de células isoladas 9,13,15. É importante ressaltar que a diferenciação de células dentro de organoides gástricos gerados por qualquer uma dessas técnicas tem se mostrado semelhante13. O protocolo aqui descrito concentra-se em um digesto unicelular.
Os organoides representam uma inovação científica que faz a ponte entre a cultura celular tradicional e órgãos inteiros. À medida que a pesquisa no campo continua a progredir, os organoides estão prontos para contribuir para o desenvolvimento de tratamentos e terapias mais eficazes para uma ampla gama de aplicações. Dada a crescente utilização de DOPs gástricas, há uma necessidade oportuna de uma abordagem padronizada para sua geração. Aqui é descrito o protocolo para geração de DOPs gástricas humanas a partir de células isoladas de tecido de biópsia gástrica benigna adquirida durante endoscopia digestiva alta. Importante e singularmente, um número padronizado de células únicas é determinado para semeadura para gerar PDOs gástricas de forma confiável e permitir a caracterização subsequente. Usando esta técnica, diferenças confiáveis na formação e crescimento de organoides gerados a partir de biópsias do corpo gástrico ou antro gástrico são demonstradas.
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Protocol
Todo o tecido humano utilizado neste protocolo foi coletado de indivíduos que forneceram consentimento informado para a coleta de tecidos através de um estudo de coleta de tecido gástrico aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia (IRB #842961). Os participantes deste estudo deveriam ser submetidos a uma endoscopia digestiva alta como parte de seus cuidados de rotina, ter pelo menos 18 anos de idade e ser capazes de fornecer consentimento informado. Todas as pesquisas realizadas seguiram as diretrizes estabelecidas pela Universidade da Pensilvânia.
1. Preparação experimental
- Preparar meios L-WRN condicionados conforme descrito anteriormente16. Embora não seja obrigatório, as concentrações de Wnt-3A, R-spondin e noggin contidas no meio condicionado podem ser verificadas usando kits ELISA disponíveis comercialmente seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Preparar RPMI-Antibióticos (RPMI-ABX), PBS-Antibióticos (PBS-ABX), PBS-Ditiotreitol (PBS-TDT), tampão de digestão e meios organoides gástricos (consulte a Tabela Suplementar 1 para composição detalhada). O meio organoide gástrico é estável por 1 semana a 4 °C.
- Pinça de autoclave, tesoura de dissecção fina e tubos de 1,5 mL.
- Comece a descongelar a matriz da membrana basal (Matrigel) no gelo.
- Comece a descongelar o tampão de digestão e a tripsina-EDTA em banho-maria a 37 °C.
- Ajuste um agitador orbital da incubadora para 37 °C e 200 rpm.
2. Isolamento de células isoladas do tecido da biópsia
- Coletar biópsias gástricas durante endoscopia digestiva alta17 seguindo o protocolo clínico institucional, provavelmente envolvendo o uso de pinça jumbo. Utilizar uma agulha romba para extrair amostras de tecido da pinça e colocá-las em um tubo cônico de 15 mL contendo meio RPMI-ABX. Mantenha o tubo no gelo para transferência rápida para o laboratório.
NOTA: No mínimo, 2-4 biópsias devem ser coletadas. - Permitir que o tecido da biópsia se deposite no fundo do tubo cônico. Utilizar pipeta para aspirar o meio e lavar as biópsias duas vezes com 1 mL de tampão PBS-ABX. Não há necessidade de centrifugação, pois as peças de tecido se depositam naturalmente no tubo cônico.
- Transferir um mínimo de 20 mg de tecido de biópsia para um tubo de 1,5 ml contendo 1 ml de PBS-TDT.
- Use tesouras de dissecção fina para cortar o tecido em pedaços de 1-2 mm ou menos.
- Utilize uma minicentrífuga de mesa por 15 s para agregar pedaços de tecido no fundo do tubo e aspirar o máximo de sobrenadante possível. Um pequeno volume residual de PBS-TDT é aceitável.
- Adicionar 5 ml de tampão de digestão recém-aquecido a um tubo cónico de 50 ml. Para transferir os pequenos pedaços de tecido sem perder tecido, pegue 500 μL do tampão de digestão e adicione-o ao tubo de 1,5 mL que contém o tecido. Em seguida, modifique a ponta de uma pipeta de 1000 μL com tesoura para aumentar o diâmetro da ponta, permitindo fácil aspiração e transferência de pedaços de tecido para o tubo cônico de 50 mL contendo o tampão de digestão.
- Incubar o tampão de digestão e a mistura de tecidos a 37 °C durante 30 minutos com agitação orbital a 200 rpm.
- Adicionar 5 mL de tripsina aquecida com EDTA a 0,25% ao tampão de digestão e incubar por mais 10 min a 37 °C com agitação orbital a 200 rpm.
- Neutralizar o tampão de digestão e a tripsina adicionando um volume igual de meio DMEM/F12 avançado (Adv.) e passar a solução através de um filtro celular de 70 μm.
- Pellet as células por centrifugação a 1400 x g durante 4 min a 4 °C. Dependendo do tamanho inicial do tecido da biópsia, uma pastilha de células pequenas pode ou não ser visível.
- Ressuspender o pellet celular em 1 mL de meio Adv. DMEM/F12 e contar o número de células viáveis usando Azul de Tripano e um hemocitômetro.
- Pellet as células novamente através de centrifugação a 1400 x g por 4 min a 4 °C e remover o sobrenadante.
NOTA: A Figura 1 apresenta uma representação esquemática do processo de isolamento de células isoladas do tecido da biópsia.
3. Incorporação de células únicas em uma "cúpula" de matriz de membrana basal
- Com base no número contado de células viáveis, calcular o volume de matriz da membrana basal necessário para atingir uma concentração final de 10a 5 células viáveis por 50 μL de matriz da membrana basal.
- Execute o seguinte rapidamente para evitar que a matriz da membrana basal se polimerize antes do revestimento. Remova a matriz da membrana basal descongelada do gelo, adicione o volume previamente calculado da matriz da membrana basal às células e misture suavemente pipetando para cima e para baixo por aproximadamente 10 s.
NOTA: É crucial evitar a criação de bolhas durante esta etapa. Não diluir a matriz da membrana basal. - Pipetar rapidamente alíquotas de 50 μL da mistura matriz/célula da membrana basal para o centro de poços individuais em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.
- Cubra imediatamente a placa de 24 poços e, em um único movimento suave, vire a placa de cabeça para baixo. Colocar a placa invertida em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C por 35 min para permitir que a matriz da membrana basal se polimerize.
NOTA: A inversão da placa é essencial para evitar que as células afundem no fundo da placa e para permitir que a matriz da membrana basal se polimerize em uma forma de "cúpula" 3D. - Adicione 500 μL de meio organoide gástrico pré-aquecido a cada poço, garantindo que o topo de cada "cúpula" esteja totalmente submerso no meio. Distribua a mídia ao lado de cada poço para não perturbar a "cúpula".
- Troque a mídia a cada 2-3 dias.
4. Passagem rotineira de organoides via fragmentação
- Uma vez que os organoides estão prontos para a passagem, remova a mídia de cada poço designado.
NOTA: Para determinar o tempo apropriado para a passagem, consulte a seção Resultados Representativos. - Dispense 1 mL de mídia Adv. DMEM/F12 gelada diretamente em uma "cúpula" de matriz de membrana basal. Isso deve iniciar prontamente o rompimento da "cúpula". Continue aspirando e dispensando até que todos os fragmentos da "cúpula" se desprenda da placa.
- Transporte tanto o meio quanto a matriz fragmentada da membrana basal para o próximo poço, repetindo esse processo para todos os poços programados para passagem. Após a desmontagem da "cúpula" final da matriz da membrana basal, dispense o meio e a mistura de organoides e matriz da membrana basal em um tubo de 1,5 mL.
- Anexe uma ponta de 1000 μL a uma pipeta P1000 e, em seguida, insira essa ponta em uma ponta de 200 μL. Isso criará uma ponta de pipeta com um diâmetro pequeno o suficiente para fragmentar os organoides, permitindo ainda a aspiração de um volume maior.
- Pipetar vigorosamente a mistura de organoides e matriz de membrana basal para cima e para baixo aproximadamente 25 vezes para fragmentar os organoides em pequenos pedaços.
- Centrifugar a mistura organoide fragmentada utilizando uma centrífuga de mesa a 4 °C durante 30 s a 2000 x g. Isso resultará em uma pelota de organoides fragmentados separados da matriz e do meio da membrana basal. Utilizar pipeta para aspirar o sobrenadante da matriz da membrana basal e média. Não use vácuo para aspirar o sobrenadante, pois o pellet está solto.
- Calcular o volume de matriz de membrana basal recém-descongelada necessário para que o número de poços/cúpulas seja dividido em uma proporção de 1:2 (50 μL/cúpula). Adicione a matriz de membrana basal fresca e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar, tomando cuidado para evitar a criação de bolhas.
- Alicote rapidamente 50 μL da mistura de fragmentos organoides e matriz da membrana basal em poços individuais de uma placa de 24 poços.
- Tampe a placa, vire-a de cabeça para baixo e coloque-a em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C por 35 minutos para permitir que a matriz da membrana basal se polimerize.
- Adicionar 500 μL de meio organoide gástrico pré-aquecido a cada poço.
NOTA: A Figura 2 apresenta uma visão geral esquemática da passagem de organoides gástricos derivados do paciente através da fragmentação.
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Representative Results
Os resultados representativos subsequentes são derivados de biópsias retiradas do epitélio benigno das regiões do corpo gástrico e antro gástrico dos estômagos de cinco pacientes diferentes submetidos à endoscopia digestiva alta. Duas a quatro "cúpulas"/poços foram plaqueadas e analisadas por paciente para biópsias do corpo gástrico e do antro. Organoides foram gerados com sucesso a partir do corpo gástrico e tecido de biópsia do antro gástrico de todos os cinco pacientes. Em média, 41 organoides foram analisados por "cúpula"/poço. Todas as imagens são projeções z adquiridas em microscópio confocal, e a quantificação do tamanho e esfericidade dos organoides foi realizada por meio de software de análise de imagens disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).
Os organoides são geralmente identificáveis dentro de 10 dias após a semeadura de células únicas (Figura 3A). No dia 20, os organoides são grandes e normalmente precisam ser passados. Embora o número de organoides que formam a semeadura pós-unicelular possa ser um pouco variável, os resultados esperados para o número de organoides formados a partir de biópsias gástricas do corpo e do antro são mostrados na Figura 3B. O número de organoides corporais e antrais atinge o pico no 10º dia pós-semeadura. Embora não significativo, o número total de organoides começa a diminuir do dia 10 ao dia 15 e do dia 15 ao dia 20. Parece haver uma subpopulação de pequenos organoides que se formam no dia 10 e depois cessam o crescimento e morrem nos 10 dias seguintes, o que explicaria essa tendência. É importante ressaltar que é demonstrado que o número de organoides formados a partir do tecido da biópsia antral é significativamente maior do que o tecido da biópsia do corpo nos dias 10, 15 e 20. O número de organoides antrais formados foi, em média, 2 vezes maior do que o número de organoides formados a partir do corpo.
Na Figura 3C, são apresentados resultados representativos para o crescimento organoide após semeadura unicelular entre o 10º e o 20º dia. Enquanto organoides de biópsias antrais e corporais tiveram crescimento constante do dia 10 ao 20, organoides gerados a partir do tecido de biópsia antral exibiram uma taxa de crescimento maior em comparação com organoides gerados a partir do tecido de biópsia corporal. Em particular, os organoides antrais tinham uma área quase 4 vezes maior do que os organoides corporais no dia 20.
Em diferentes pacientes, uma diversidade de morfologia organoide é tipicamente observada em qualquer "cúpula"/poço (Figura 4A). Alguns organoides são mais redondos ou esféricos, enquanto outros apresentam morfologia mais irregular. No entanto, em média, a esfericidade, uma medida de quão esférico é um organoide (onde um escore de 1 = uma esfera perfeita)18, mostrou pouca variação dentro e entre organoides gerados a partir de tecido de biópsia corporal ou antral (Figura 4B). Portanto, embora existam diferentes taxas de crescimento, tipicamente não há diferenças morfológicas significativas entre organoides gerados a partir de tecido de biópsia do corpo gástrico ou antro.
No dia 20 pós-iniciação, os organoides gástricos normalmente estão prontos para serem passados. Um grande tamanho organoide (≥1500 μm de diâmetro) ou um interior escurecido (sugestivo de extenso turnover celular) do organoide são os principais sinais de que os organoides precisam ser passados (Figura 5A). Os organoides deixados para ir além deste ponto podem começar a se decompor em monocamadas 2D (Figura 5B) que não reformam organoides de forma confiável após a passagem, talvez indicando uma perda de viabilidade ou caule. Após a passagem e resemeadura dos organoides gástricos usando o protocolo de fragmentação aqui descrito, as "cúpulas" conterão muitos fragmentos organoides (Figura 5C) que se reorganizarão em muito mais organoides e crescerão muito mais rapidamente em comparação com a semeadura inicial de células únicas (Figura 5D). Se o crescimento organoide ainda necessitar de caracterização e/ou padronização no momento da passagem, os organoides gástricos podem ser digeridos para células únicas, como descrito anteriormente19.
Figura 1: Geração de organoides gástricos derivados do paciente. Visão geral esquemática descrevendo o processo de geração de organoides gástricos derivados do paciente a partir de biópsias de epitélio gástrico benigno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Passagem de organoides gástricos derivados do paciente. Visão geral esquemática ilustrando a passagem de organoides gástricos derivados do paciente através da fragmentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Formação e crescimento de organoides derivados do paciente gástrico. (A) Imagens representativas de projeção z mostrando o crescimento de organoides gástricos nos dias 10, 15 e 20 pós-semeadura unicelular. As imagens são de organoides gerados a partir do corpo gástrico e tecido de biópsia de antro do mesmo paciente. Barra de escala = 1 mm. (B) Número médio (±DP) de organoides do corpo gástrico e antro nos momentos indicados pós-semeadura unicelular. (C) Área média (±DP) (μm2) dos organoides do corpo gástrico e antro nos momentos indicados pós-semeadura unicelular. n = 5 pacientes por grupo e momento. * = diferença estatisticamente significante (p ≤ 0,05) no momento indicado. s.n. = ausência de diferença estatisticamente significante no momento indicado. Comparações estatísticas realizadas via ANOVA de 2 vias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Morfologia organoide gástrica derivada do paciente. (A) Imagens representativas de projeção z de diferentes morfologias organoides gástricas de uma "cúpula"/poço individual de organoides derivados do corpo gástrico no dia 15 pós-semeadura unicelular. Barra de escala = 200 μm. (B) Média (±DP) do corpo gástrico e esfericidade organoide do antro (onde um valor de 1 = uma esfera perfeita). n = 5 pacientes por grupo e momento. n.s. = ausência de diferença estatisticamente significante em nenhum momento. Comparações estatísticas realizadas via ANOVA de 2 vias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Passagem organoide gástrica derivada do paciente. (A) Imagem representativa de organoides prontos para serem passados no dia 20 pós-semeadura unicelular. (B) Imagem representativa de organoides vencidos para passagem no dia 25 pós-semeadura unicelular. (C) Imagem representativa de organoides fragmentados após ressemeadura (Passagem 1 - Dia 0). (D) Imagem representativa do crescimento organoide ao longo de 5 dias após a ressemeadura (Passagem 1 - Dia 5). Todas as imagens são projeções z. Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela Suplementar 1: Soluções e receitas de mídia. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Neste trabalho, um protocolo detalhado para a geração confiável de organoides gástricos humanos a partir de células isoladas isoladas de biópsias de epitélio benigno do corpo gástrico e antro é delineado. As etapas críticas do protocolo giram em torno do tempo, bem como do manuseio da matriz da membrana basal. Para preservar a viabilidade, é essencial iniciar o protocolo o mais rápido possível após a aquisição do tecido da biópsia. O objetivo é começar a digerir o tecido da biópsia dentro de 30 minutos após a biópsia ser realizada. O manuseio da matriz da membrana basal também pode ser um desafio. Quando descongelado no gelo, permanece um líquido; no entanto, em temperaturas acima de 4 °C, polimeriza-se. Portanto, a transferência rápida da matriz da membrana basal do gelo para a mistura com células únicas ou fragmentos organoides para plaqueamento de "cúpulas" deve ser feita prontamente, pois ela começa a se polimerizar dentro de um minuto. Uma vez polimerizado em um tubo, ele não pode ser aspirado em uma ponta de pipeta. Se isso ocorrer, o tubo pode ser colocado no gelo até que o Matrigel se despolimerize novamente em um líquido. Ao pipetar suavemente para cima e para baixo para misturar células individuais ou fragmentos organoides com a matriz da membrana basal, também é crucial evitar a criação de bolhas. Embora bolhas em uma "cúpula" de matriz de membrana basal não pareçam impedir a formação e o crescimento de organoides, elas podem obstruir a visualização. Além disso, após aliquotar a mistura matriz da membrana basal/célula no(s) poço(s) de uma placa de cultura celular, a placa deve ser invertida e colocada em uma incubadora. Esta etapa é fundamental para permitir que a matriz da membrana basal se polimerize em uma forma de "cúpula" 3D e evite que as células individuais ou fragmentos organoides afundem no fundo da placa.
Usando este protocolo, organoides gástricos podem ser identificados dentro de 10 dias após a semeadura de célula única. A experiência mostra que muito poucos novos organoides gástricos se formam além do dia 10 e, de fato, o número total de organoides pode diminuir ligeiramente a partir do dia 10-20. Isto é verdadeiro para organoides gerados a partir do corpo gástrico e antro. No entanto, o número total de organoides formados a partir de biópsias gástricas antrais é significativamente maior do que a partir de biópsias de corpo gástrico. Além disso, o crescimento de organoides antrais supera em muito os organoides corporais entre os dias 10-20 após a semeadura de célula única. Essa diferença pode ser atribuída a variações na sensibilidade de Wnt. Um estudo recente demonstrou que as DOPs do corpo gástrico exibem melhor crescimento com menor ativação de Wnt, enquanto as DOPs de antro gástrico prosperam com maior ativação de Wnt20. A localização das biópsias gástricas utilizadas para gerar DOP gástrica não é tipicamente especificada na literatura. Tais diferenças devem ser consideradas em estudos futuros utilizando DOPs gástricas geradas a partir de biópsias gástricas de diferentes áreas do estômago.
Outro aspecto crucial deste protocolo é o estabelecimento de um número padronizado de células únicas para semear por "cúpula"/poço para gerar PDOs gástricas de forma confiável. Enquanto um estudo anterior relatou um número padronizado de glândulas gástricas para semear para geração de DOP, nenhum estudo anterior usando um método de digestão de célula única mencionou o número de células semeadas ou se o número era consistente em diferentes linhas de DOP. A falha em padronizar o número de células semeadas pode resultar em um número altamente variável de células-tronco sendo semeadas por "cúpula"/poço. Uma vez que as células-tronco são a principal fonte de formação de organoides gástricos, isso poderia levar a taxas variáveis de formação e crescimento de organoides. Portanto, a utilização de um número não padronizado de células únicas poderia confundir interpretações de comparações de formação ou crescimento em diferentes linhas gástricas de DOP. Aqui, demonstra-se que a padronização do número de células semeadas para 10a 5 células por "cúpula"/bem confiável gera DOPs gástricas a partir de biópsias tanto do corpo quanto das regiões antrais do estômago.
Este protocolo foi otimizado para o uso de tecido gástrico fresco. Consequentemente, o sucesso desse protocolo pode variar quando se utiliza tecido congelado ou tecido preservado por outros meios. Além disso, não há dados sobre por quanto tempo as biópsias a fresco mantêm a viabilidade, pois o tecido da biópsia é processado o mais rápido possível após a remoção do estômago do paciente. Presumivelmente, quanto mais tempo o tecido fresco permanecer antes do processamento, menos células viáveis serão isoladas.
A passagem de DOPs gástricas por fragmentação, como descrito neste protocolo, fornece um método fácil para a passagem de rotina. Embora as DOPs gástricas tenham sido passadas com sucesso até 4 vezes usando essa técnica, não houve tentativas de determinar quantas vezes elas podem ser passadas, mantendo o crescimento e a viabilidade constantes. Alguns relatos indicam que o crescimento de organoides gástricos pode desacelerar após 5 ou maispassagens21,22, enquanto outros observaram crescimento confiável por até 10passagens23.
O meio organoide gástrico utilizado neste protocolo contém Wnt-3A, noggin e R-spondin derivados de meios condicionados de células L-WRN. Para a produção dos meios condicionados, utiliza-se um protocolo descrito por Miyoshi e Stappenbeck16. Alternativamente, Wnt-3A, noggin, e R-spondin podem ser comprados separadamente como proteínas recombinantes. Comprar os componentes individuais separadamente é ideal para evitar potenciais efeitos de lote que podem surgir ao usar mídia condicionada de células L-WRN. No entanto, comprar as proteínas recombinantes é caro e pode ser proibitivo para pesquisadores que frequentemente trabalham com organoides.
Dado o uso crescente de DOPs gástricas em várias aplicações, é oportuno e necessário estabelecer abordagens padronizadas para a geração de DOPs gástricas benignas. O protocolo aqui descrito oferece um método confiável para futuras investigações utilizando DOPs gástricas. Em nossa experiência, este protocolo gerou organoides com sucesso a partir de biópsias de mucosa gástrica benigna em mais de 90% das vezes.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações relevantes.
Acknowledgments
Medicina Genômica da Universidade da Pensilvânia T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & Programa BRCA no Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
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