Summary
Органоиды, полученные от желудочных пациентов, находят все большее применение в исследованиях, однако формальные протоколы получения органоидов желудка человека из одноклеточных пищеварителей со стандартизированной плотностью посева отсутствуют. В данном протоколе представлен подробный метод надежного создания органоидов желудка из биопсийной ткани, полученной при эндоскопии верхних отделов желудка.
Abstract
Органоиды, полученные от пациентов желудка (PDOs), предлагают уникальный инструмент для изучения биологии и патологии желудка. Следовательно, эти PDO находят все большее применение в широком спектре исследовательских приложений. Тем не менее, существует нехватка опубликованных подходов к получению желудочных ЗОП из одноклеточных дигестов при сохранении стандартизированной начальной плотности посева клеток. В этом протоколе акцент делается на инициации желудочных органоидов из изолированных единичных клеток и предоставлении метода пассации органоидов путем фрагментации. Важно отметить, что протокол демонстрирует, что стандартизированный подход к начальной плотности посева клеток последовательно дает органоиды желудка из доброкачественной биопсийной ткани и позволяет стандартизировать количественную оценку роста органоидов. Наконец, фактические данные подтверждают новое наблюдение о том, что желудочные ЗОП демонстрируют различную скорость образования и роста в зависимости от того, происходят ли органоиды из биопсии тела или антральных областей желудка. В частности, выявлено, что использование ткани антральной биопсии для инициации органоидов приводит к образованию большего количества органоидов и более быстрому росту органоидов в течение 20-дневного периода по сравнению с органоидами, полученными из биопсии тела желудка. Протокол, описанный в настоящем документе, предлагает исследователям своевременный и воспроизводимый метод успешного создания и работы с желудочными ЗОП.
Introduction
Органоиды представляют собой миниатюрные трехмерные (3D) клеточные структуры, которые напоминают архитектуру и функциональность органов, из которых они были получены 1,2. Эти выращенные в лаборатории модели создаются путем культивирования стволовых клеток или тканеспецифичных клеток в контролируемой среде, которая позволяет этим клеткам самоорганизовываться и дифференцироваться в различные типы клеток 1,2,3. Одним из ключевых преимуществ органоидов является их способность более точно повторять биологию человека, чем традиционные двумерные (2D) клеточные культуры 1,2,3. В частности, было показано, что органоиды человека сохраняют генетическое разнообразие тканей своего происхождения 3,4,5. Органоиды дают уникальную возможность изучать развитие органов человека, моделировать заболевания и тестировать потенциальные терапевтические средства в контролируемых лабораторных условиях. Кроме того, органоиды могут быть получены из индивидуальных образцов пациентов, что позволяет применять персонализированные подходы к медицине и потенциальную разработку индивидуализированных методов лечения 3,6,7.
Исследователи использовали органоиды желудка человека для изучения различных аспектов биологии и патологии желудка. Яркими примерами являются использование органоидов, полученных от пациентов (PDO), для прогнозирования ответов на химиотерапию рака желудка 8,9,10 и моделирования эпителиального ответа на инфекцию Helicobacter pylori 11,12,13. Органоиды желудка человека состоят из различных типов клеток, обнаруженных в желудке, включая клетки шеи, клетки ямки и другие поддерживающие клетки11,14. Органоиды желудка могут быть получены либо из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), либо из стволовых клеток, непосредственно выделенных из ткани желудка, полученной с помощью биопсии, или из образцов резекции желудка11,14. Выделение желудочных стволовых клеток из желудочной ткани обычно осуществляется путем изоляции и культивирования желудочных желез или ферментативного расщепления образцов тканей для высвобождения отдельных клеток 9,13,15. Важно отметить, что дифференцировка клеток в органоидах желудка, полученных с помощью любого из этих методов, была аналогичной13. Протокол, описанный здесь, основан на дайджесте с одной клеткой.
Органоиды представляют собой научную инновацию, которая устраняет разрыв между традиционной клеточной культурой и целыми органами. По мере того, как исследования в этой области продолжают прогрессировать, органоиды готовы внести свой вклад в разработку более эффективных методов лечения и терапии для широкого спектра применений. Учитывая растущее использование желудочных ЗОП, существует острая необходимость в стандартизированном подходе к их созданию. Описан протокол получения ЗОП желудка человека из единичных клеток, выделенных из доброкачественной биопсийной ткани желудка, полученной при эндоскопии верхних отделов желудка. Важно и уникально то, что для посева определяется стандартизированное количество отдельных клеток, чтобы надежно генерировать желудочные ЗОП и позволять впоследствии характеризовать. С помощью этого метода продемонстрированы достоверные различия в образовании и росте органоидов, полученных при биопсии тела желудка или антрального слоя желудка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все человеческие ткани, использованные в этом протоколе, были собраны у лиц, которые дали информированное согласие на забор тканей в рамках исследования сбора тканей желудка, одобренного Институциональным наблюдательным советом Университета Пенсильвании (IRB #842961). Участники этого исследования должны были пройти эндоскопию верхних отделов позвоночника в рамках планового ухода, быть не моложе 18 лет и быть в состоянии предоставить информированное согласие. Все проводимые исследования проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Университетом Пенсильвании.
1. Подготовка эксперимента
- Приготовьте кондиционированную среду L-WRN, как описано выше16. Хотя это и не является обязательным, концентрации Wnt-3A, R-спондина и ноггина, содержащиеся в кондиционированных средах, можно проверить с помощью имеющихся в продаже наборов для ИФА в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
- Приготовьте RPMI-антибиотики (RPMI-ABX), PBS-антибиотики (PBS-ABX), PBS-ДИТИОТРЕЙТОЛ (PBS-DTT), ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЙ БУФЕР И ЖЕЛУДОЧНУЮ ОРГАНОИДНУЮ СРЕДУ (СМ. Дополнительную таблицу 1 для подробного состава). Органоидная среда желудка стабильна в течение 1 недели при 4 °С.
- Автоклавные щипцы, ножницы для тонкого препарирования и пробирки объемом 1,5 мл.
- Начните размораживание базальной мембранной матрицы (Matrigel) на льду.
- Начните размораживание пищеварительного буфера и трипсина-ЭДТА на водяной бане с температурой 37 °C.
- Установите орбитальный шейкер инкубатора на 37 °C и 200 об/мин.
2. Выделение единичных клеток из биопсийной ткани
- Забор биопсии желудка во время эндоскопии верхних отделов17 в соответствии с клиническим протоколом учреждения, вероятно, с использованием больших щипцов. Используйте иглу с тупым концом, чтобы извлечь образцы тканей из щипцов и поместить их в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую среду RPMI-ABX. Держите пробирку на льду для быстрой транспортировки в лабораторию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо собрать минимум 2-4 биопсии. - Дайте биопсийной ткани осесть на дне конической трубки. Используйте пипетку для аспирации среды и дважды промойте биопсию 1 мл буфера PBS-ABX. Нет необходимости в центрифугировании, так как кусочки ткани естественным образом оседают в конической пробирке.
- Перенесите минимум 20 мг биопсийной ткани в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл PBS-DTT.
- С помощью тонких ножниц для препарирования разрежьте ткань на кусочки размером 1-2 мм или меньше.
- Используйте настольную миницентрифугу в течение 15 с, чтобы собрать кусочки ткани на дне пробирки и отсосать как можно больше надосадочной жидкости. Допустим небольшой остаточный объем PBS-DTT.
- Добавьте 5 мл свежеподогретого пищеварительного буфера в коническую пробирку объемом 50 мл. Чтобы перенести небольшие кусочки ткани без потери ткани, возьмите 500 мкл пищеварительного буфера и добавьте его в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую ткань. Затем модифицируйте наконечник пипетки на 1000 мкл с помощью ножниц, чтобы увеличить диаметр наконечника, что позволит легко аспирировать и переносить кусочки ткани в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую буфер для пищеварения.
- Инкубируйте пищеварительный буфер и тканевую смесь при 37 °C в течение 30 мин с орбитальным встряхиванием при 200 об/мин.
- Добавьте 5 мл подогретого трипсина с 0,25% ЭДТА в буфер для пищеварения и инкубируйте еще 10 мин при 37 °C с орбитальным встряхиванием при 200 об/мин.
- Нейтрализуйте буфер для пищеварения и трипсин, добавив равный объем среды Advanced (Adv.) DMEM/F12 и пропустите раствор через ситечко с ячейками 70 мкм.
- Гранулируют клетки центрифугированием при 1400 x g в течение 4 мин при 4 °C. В зависимости от исходного размера биопсийной ткани, мелкоклеточная гранула может быть видна, а может и не быть видимой.
- Ресуспендант клеточной гранулы в 1 мл среды Adv. DMEM/F12 и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
- Повторно гранулируют клетки центрифугированием при 1400 x g в течение 4 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлено схематическое изображение процесса выделения отдельных клеток из биопсийной ткани.
3. Встраивание одиночных ячеек в матрицу базальной мембраны «купол»
- На основе подсчитанного количества жизнеспособных клеток рассчитайте объем матрицы базальной мембраны, необходимый для достижения конечной концентрации 105 жизнеспособных клеток на 50 мкл матрицы базальной мембраны.
- Выполните следующие действия быстро, чтобы предотвратить полимеризацию матрицы базальной мембраны перед нанесением покрытия. Вынуть размороженную матрицу базальной мембраны изо льда, добавить в ячейки рассчитанный ранее объем матрицы базальной мембраны и аккуратно перемешать пипеткой вверх и вниз в течение примерно 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать образования пузырей на этом этапе. Не разбавляйте матрицу базальной мембраны. - Быстро пипетка 50 мкл аликвот матрикса базальной мембраны и клеточной смеси в центр отдельных лунок в 24-луночном планшете для культуры тканей.
- Сразу же накройте 24-луночную пластину и одним плавным движением переверните пластину вверх дном. Поместите перевернутую пластину в инкубатор для культуры тканей при температуре 37 °C на 35 минут, чтобы матрица базальной мембраны полимеризовалась.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертирование пластины необходимо для предотвращения опускания клеток на дно пластины и для того, чтобы матрица базальной мембраны могла полимеризоваться в 3D-форму «купола». - Добавьте 500 мкл предварительно подогретой желудочной органоидной среды в каждую лунку, убедившись, что верхняя часть каждого «купола» полностью погружена в среду. Распределите средство вниз по стенкам каждого колодца, чтобы не повредить «купол».
- Меняйте носитель каждые 2-3 дня.
4. Рутинный пассаж органоидов путем фрагментации
- Как только органоиды будут готовы к прохождению, удалите среду из каждой назначенной лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить подходящее время для сдачи, обратитесь к разделу «Репрезентативные результаты». - Распределите 1 мл ледяного носителя Adv. DMEM/F12 непосредственно на матричный «купол» базальной мембраны. Это должно легко инициировать разрушение «купола». Продолжайте аспирацию и дозирование до тех пор, пока все фрагменты «купола» не отделятся от пластины.
- Транспортируйте как среду, так и фрагментированную матрицу базальной мембраны к следующей скважине, повторяя этот процесс для всех скважин, предназначенных для прохода. После разборки окончательного «купола» матрицы базальной мембраны распределите среду и смесь органоидов и матрицы базальной мембраны в пробирку объемом 1,5 мл.
- Прикрепите наконечник на 1000 мкл к пипетке P1000, а затем вставьте этот наконечник в наконечник на 200 мкл. Это позволит создать наконечник пипетки достаточно маленького диаметра, чтобы фрагментировать органоиды, но при этом обеспечить аспирацию большего объема.
- Энергично пипетируйте смесь органоидов и матрицу базальной мембраны вверх и вниз примерно 25 раз, чтобы фрагментировать органоиды на мелкие кусочки.
- Центрифугируют фрагментированную органоидную смесь с помощью настольной центрифуги при 4 °C в течение 30 с при 2000 x g. В результате образуется гранула фрагментированных органоидов, отделенных от матрицы базальной мембраны и среды. Используйте пипетку для аспирации среды и надосадочной жидкости матрицы базальной мембраны. Не используйте вакуум для аспирации надосадочной жидкости, так как гранула рыхлая.
- Рассчитайте необходимый объем свежеразмороженной мембранной матрицы фундамента, чтобы количество лунок/куполов было разделено в соотношении 1:2 (50 мкл/купол). Добавьте свежую матрицу базальной мембраны и осторожно проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать, стараясь не образовывать пузырьки.
- Быстрая аликвота 50 мкл смеси фрагментов органоидов и матрицы базальной мембраны в отдельные лунки 24-луночного планшета.
- Накройте планшет, переверните его вверх дном и поместите в инкубатор для культуры тканей при температуре 37 °C на 35 минут, чтобы матрица базальной мембраны полимеризовалась.
- Добавьте в каждую лунку 500 мкл предварительно подогретой желудочной органоидной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен схематический обзор пассации органоидов, полученных от желудочного пациента, путем фрагментации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Последующие репрезентативные результаты получены на основе биопсии, взятой из доброкачественного эпителия как желудочного тела, так и желудочного антрума желудка пяти разных пациентов, проходящих эндоскопию верхних отделов. От двух до четырех «куполов»/лунок были покрыты и проанализированы для каждого пациента как для биопсии тела желудка, так и для антрального аппарата. Органоиды были успешно получены из тела желудка и ткани биопсии антрального отдела желудка у всех пяти пациентов. В среднем анализировался 41 органоид на «купол»/скважину. Все изображения представляют собой z-проекции, полученные с помощью конфокального микроскопа, а количественная оценка размера и сферичности органоидов была выполнена с помощью коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений (см. таблицу материалов).
Органоиды, как правило, идентифицируются в течение 10 дней после посева отдельных клеток (рис. 3А). К 20-му дню органоиды становятся крупными, и, как правило, их необходимо пассировать. В то время как количество органоидов, образующихся после посева одной клетки, может быть несколько вариабельным, ожидаемые результаты по количеству органоидов, образующихся при биопсии тела и антрального желудка, показаны на рисунке 3B. Количество органоидов тела и антральных органов достигает максимума на 10-й день после посева. Хотя это и незначительно, общее количество органоидов начинает уменьшаться с 10-го по 15-й день и с 15-го по 20-й день. По-видимому, существует субпопуляция мелких органоидов, которые формируются к 10-му дню, а затем прекращают рост и отмирают в течение следующих 10 дней, что объясняет эту тенденцию. Важно отметить, что показано, что количество органоидов, образующихся из ткани антральной биопсии, значительно выше, чем из ткани биопсии из организма на 10, 15 и 20 сутки. Количество образующихся антральных органоидов в среднем в 2 раза превышало количество органоидов, образующихся из тела.
На рисунке 3C показаны репрезентативные результаты роста органоидов после одноклеточного посева между 10-м и 20-м днем. В то время как органоиды как из антральной биопсии, так и из биопсии тела демонстрировали устойчивый рост с 10-го по 20-й день, органоиды, полученные из ткани антральной биопсии, показали большую скорость роста по сравнению с органоидами, полученными из ткани биопсии тела. В частности, антральные органоиды имели почти в 4 раза большую площадь, чем органоиды тела на 20-й день.
У разных пациентов, как правило, наблюдается разнообразие морфологии органоидов в любом отдельном «куполе»/лунке (рис. 4А). Некоторые органоиды имеют более круглую или сферическую форму, в то время как другие имеют более неправильную морфологию. Тем не менее, в среднем, сферичность, мера того, насколько сферическим является органоид (где оценка 1 = идеальная сфера)18, показала незначительные различия внутри и между органоидами, полученными из ткани биопсии тела или антральной биопсии (рис. 4B). Поэтому, несмотря на различия в скорости роста, как правило, нет существенных морфологических различий между органоидами, полученными из биопсийной ткани тела желудка или антрального ствола.
К 20-му дню после инициации органоиды желудка, как правило, готовы к прохождению. Большой размер органоида (≥1500 мкм в диаметре) или затемненная внутренняя часть органоида (предполагающая обширный клеточный оборот) являются ключевыми признаками того, что органоиды должны быть выведены наружу (рис. 5А). Органоиды, оставленные после этой точки, могут начать распадаться на двумерные монослои (рис. 5B), которые не могут надежно повторно образовывать органоиды после пассажа, что, возможно, указывает на потерю жизнеспособности или стеблевой способности. После прохождения и повторного посева желудочных органоидов с использованием протокола фрагментации, описанного в настоящем документе, «купола» будут содержать множество фрагментов органоидов (рис. 5C), которые реорганизуются во гораздо большее количество органоидов и будут расти гораздо быстрее по сравнению с первоначальным посевом одиночных клеток (рис. 5D). Если органоидный рост все еще нуждается в характеризации и/или стандартизации во время пассажа, желудочные органоиды могут быть переварены до отдельных клеток, как описано ранее19.
Рисунок 1: Генерация органоидов, полученных от желудочного больного. Схематический обзор, изображающий процесс получения органоидов, полученных от пациента желудка, из биопсии доброкачественного эпителия желудка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пассаж органоидов, полученных от желудочного больного. Схематический обзор, иллюстрирующий пассацию органоидов, полученных от пациента желудка, путем фрагментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Формирование и рост органоидов желудка у пациента. (A) Репрезентативные изображения в z-проекции, показывающие рост органоидов желудка на 10, 15 и 20 день после посева одной клетки. На изображениях видны органоиды, полученные из биопсийной ткани желудка и антрума у одного и того же пациента. Масштабная линейка = 1 мм. (B) Среднее (±SD) количество органоидов тела желудка и антрального сустава в указанные моменты времени после одноклеточного посева. (C) Средняя (±SD) площадь (мкм2) органоидов тела желудка и антрума в указанные моменты времени после посева одной клетки. n = 5 пациентов в группе и на момент времени. * = статистически значимая разница (p ≤ 0,05) в указанный момент времени. n.s. = нет статистически значимой разницы в указанный момент времени. Статистические сравнения проводились с помощью 2-way ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Морфология органоидов желудка у пациента. (A) Репрезентативные z-проекционные изображения различных морфологий органоидов желудка из индивидуального «купола»/лунки органоидов желудочного тела на 15-й день после посева одной клетки. Масштабная линейка = 200 мкм. (B) Средняя (±SD) сферичность тела желудка и органоида антрума (где значение 1 = идеальная сфера). n = 5 пациентов в группе и на момент времени. n.s. = нет статистически значимой разницы в любой момент времени. Статистические сравнения проводились с помощью 2-way ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Отхождение органоидов желудка от пациента. (А) Репрезентативное изображение органоидов, готовых к пассажу на 20-й день после посева одной клетки. (B) Репрезентативное изображение органоидов, просроченных для пассажа на 25-й день после одноклеточного посева. (C) Репрезентативное изображение фрагментированных органоидов после повторного посева (Проход 1 - День 0). (D) Репрезентативное изображение роста органоидов в течение 5 дней после пересева (Отрывок 1 - День 5). Все изображения являются z-проекциями. Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица 1: Растворы и рецепты сред. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изложен подробный протокол достоверной генерации органоидов желудка человека из единичных клеток, выделенных из биоптатов доброкачественного эпителия из тела желудка и антрума. Важнейшие этапы протокола связаны с синхронизацией, а также с обработкой матрицы базальной мембраны. Для сохранения жизнеспособности важно начать протокол как можно скорее после получения биопсийной ткани. Цель состоит в том, чтобы начать переваривание биопсийной ткани в течение 30 минут после проведения биопсии. Работа с матрицей базальной мембраны также может быть сложной задачей. При размораживании на льду он остается жидким; однако при температуре выше 4 °C он полимеризуется. Поэтому быстрый перенос матрицы базальной мембраны изо льда для смешивания с одиночными клетками или фрагментами органоидов для гальванических «куполов» должен быть выполнен оперативно, так как он начинает полимеризоваться в течение одной минуты. После полимеризации в пробирке его нельзя аспирировать в наконечник пипетки. В этом случае пробирку можно поместить на лед до тех пор, пока Matrigel не деполимеризуется обратно в жидкость. При осторожном пипетировании вверх и вниз для смешивания отдельных клеток или фрагментов органоидов с матрицей базальной мембраны также важно избегать образования пузырьков. В то время как пузырьки в «куполе» матрицы базальной мембраны, по-видимому, не препятствуют образованию и росту органоидов, они могут препятствовать визуализации. Кроме того, после аликвотирования матрикса базальной мембраны и клеточной смеси в лунку (лунки) планшета для клеточной культуры, планшет необходимо перевернуть и поместить в инкубатор. Этот шаг имеет решающее значение для того, чтобы матрица базальной мембраны полимеризовалась в 3D-форму «купола» и предотвратила погружение отдельных клеток или фрагментов органоидов на дно пластины.
Используя этот протокол, органоиды желудка могут быть идентифицированы в течение 10 дней после посева одной клетки. Опыт показывает, что после 10-го дня образуется очень мало новых органоидов желудка, и, фактически, общее количество органоидов может несколько уменьшиться с 10-20 дня. Это справедливо для органоидов, вырабатываемых как из тела желудка, так и из антрального нерва. Однако общее количество органоидов, образующихся при биопсии антрального слоя желудка, значительно выше, чем при биопсии тела желудка. Кроме того, рост антральных органоидов значительно превосходит органоиды тела в период между 10-20 днями после посева одной клетки. Эта разница может быть связана с вариациями чувствительности Wnt. Недавнее исследование показало, что ЗОП желудочного тела демонстрируют лучший рост при более низкой активации Wnt, в то время как PDO желудочного антрума процветают при более высокой активации Wnt20. Локализация биопсии желудка, используемой для получения ЗОП желудка, как правило, не указана в литературе. Такие различия должны быть учтены в будущих исследованиях с использованием ЗОП желудка, полученных из биопсии желудка различных областей желудка.
Другим важным аспектом этого протокола является установление стандартизированного количества отдельных клеток для посева на «купол»/лунку для надежного генерирования желудочных ЗОП. В то время как в предыдущем исследовании сообщалось о стандартизированном количестве желудочных желез, которые необходимо засеять для генерации PDO, ни в одном из предыдущих исследований с использованием метода дигестрирования одной клетки не упоминалось количество клеток, засеянных или было ли это количество одинаковым для разных линий PDO. Неспособность стандартизировать количество засеянных клеток может привести к тому, что количество стволовых клеток, высеваемых на «купол»/лунку, будет сильно варьироваться. Поскольку стволовые клетки являются основным источником образования органоидов желудка, это может привести к различным скоростям образования и роста органоидов. Таким образом, использование нестандартизированного количества одиночных клеток может запутать интерпретации сравнения формирования или роста в разных линиях PDO желудка. Здесь показано, что стандартизация количества клеток, засеянных до 10,5 клеток на «купол»/лунку, надежно генерирует желудочные ЗОП из биопсии как тела, так и антральных отделов желудка.
Этот протокол был оптимизирован для использования свежей ткани для биопсии желудка. Следовательно, успех этого протокола может варьироваться при использовании замороженных тканей или тканей, сохраненных другими способами. Кроме того, нет данных о том, как долго свежая биопсия сохраняет жизнеспособность, поскольку биопсийная ткань обрабатывается как можно скорее после извлечения из желудка пациента. Предположительно, чем дольше свежая ткань находится перед обработкой, тем меньше жизнеспособных клеток будет выделено.
Пассаж желудочных ЗОП с помощью фрагментации, как описано в этом протоколе, является простым методом рутинного пассажа. Несмотря на то, что желудочные ЗОП успешно пассировались до 4 раз с помощью этого метода, не было попыток определить, сколько раз они могут быть пассированы, сохраняя при этом устойчивый рост и жизнеспособность. В некоторых сообщениях указывается, что рост органоидов желудка может замедляться после 5 или более пассажей21,22, в то время как другие отмечают достоверный рост до 10 пассажей23.
Желудочная органоидная среда, используемая в этом протоколе, содержит Wnt-3A, ноггин и R-спондин, полученные из кондиционированных сред клеток L-WRN. Для получения кондиционированной среды используется протокол, описанный Миёси и Стаппенбеком16. В качестве альтернативы Wnt-3A, ноггин и R-спондин можно приобрести отдельно в качестве рекомбинантных белков. Покупка отдельных компонентов по отдельности идеально подходит для того, чтобы избежать потенциальных эффектов партии, которые могут возникнуть при использовании кондиционированных сред из ячеек L-WRN. Тем не менее, покупка рекомбинантных белков стоит дорого и может быть непомерно дорогой для исследователей, которые часто работают с органоидами.
Учитывая растущее использование ЗОП желудка в различных областях, своевременно и необходимо разработать стандартизированные подходы к формированию доброкачественных ЗОП желудка. Протокол, описанный здесь, предлагает надежный метод для будущих исследований с использованием ЗОП желудка. По нашему опыту, этот протокол успешно генерирует органоиды из биопсии доброкачественной слизистой оболочки желудка более чем в 90% случаев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не раскрывают информацию по этому поводу.
Acknowledgments
Университет Пенсильвании по геномной медицине T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), программа Men & BRCA в Центре Бассера для BRCA (KHB, BWK), грант Фонда семьи ДеГрегорио (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H.
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S.
- Zhao, Z., et al.
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
