Summary
تجد العضويات المشتقة من مرضى المعدة استخداما متزايدا في البحث ، ومع ذلك لا توجد بروتوكولات رسمية لتوليد عضويات المعدة البشرية من هضم الخلية الواحدة بكثافة بذر موحدة. يقدم هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإنشاء عضويات معدية موثوقة من أنسجة الخزعة التي تم الحصول عليها أثناء التنظير العلوي.
Abstract
تقدم المواد العضوية المشتقة من مريض المعدة (PDOs) أداة فريدة لدراسة بيولوجيا المعدة وعلم الأمراض. وبالتالي ، تجد PDOs هذه استخداما متزايدا في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية. ومع ذلك ، يوجد نقص في الأساليب المنشورة لإنتاج PDOs المعدة من هضم خلية واحدة مع الحفاظ على كثافة أولية موحدة لبذر الخلية. في هذا البروتوكول ، ينصب التركيز على بدء عضويات المعدة من الخلايا المفردة المعزولة وتوفير طريقة لتمرير الكائنات العضوية من خلال التجزئة. الأهم من ذلك ، يوضح البروتوكول أن النهج الموحد لكثافة بذر الخلايا الأولية ينتج باستمرار عضويات معدية من أنسجة الخزعة الحميدة ويسمح بالقياس الكمي الموحد لنمو الأعضاء. أخيرا ، تدعم الأدلة الملاحظة الجديدة القائلة بأن PDOs في المعدة تظهر معدلات متفاوتة من التكوين والنمو بناء على ما إذا كانت الكائنات العضوية تنشأ من خزعات الجسم أو المناطق الغارية في المعدة. على وجه التحديد ، تم الكشف عن أن استخدام أنسجة الخزعة الغارية لبدء العضوية يؤدي إلى تكوين عدد أكبر من الكائنات العضوية ونمو عضوي أسرع على مدى فترة 20 يوما مقارنة بالمواد العضوية الناتجة عن خزعات جسم المعدة. يوفر البروتوكول الموصوف هنا للمحققين طريقة قابلة للتكرار وفي الوقت المناسب لتوليد PDOs المعدة والعمل معها بنجاح.
Introduction
Organoids هي هياكل خلوية مصغرة ثلاثية الأبعاد (3D) تشبه بنية ووظائف الأعضاء التي اشتقت منها 1,2. يتم إنشاء هذه النماذج المزروعة في المختبر عن طريق زراعة الخلايا الجذعية أو الخلايا الخاصة بالأنسجة في بيئة خاضعة للرقابة تسمح لهذه الخلايا بالتنظيم الذاتي والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا1،2،3. واحدة من المزايا الرئيسية للعضويات هي قدرتها على تلخيص البيولوجيا البشرية بشكل أوثق من ثقافات الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D)1،2،3. على وجه الخصوص ، ثبت أن الكائنات العضوية البشرية تحافظ على التنوع الجيني لأنسجتها الأصلية3،4،5. توفر الكائنات العضوية فرصة فريدة لدراسة تطور الأعضاء البشرية ، والأمراض النموذجية ، واختبار العلاجات المحتملة في بيئة معملية خاضعة للرقابة. علاوة على ذلك ، يمكن اشتقاق المواد العضوية من عينات المرضى الفردية ، مما يتيح مناهج الطب الشخصي والتطوير المحتمل للعلاجات الفردية3،6،7.
استخدم الباحثون عضويات المعدة البشرية للتحقيق في جوانب مختلفة من بيولوجيا المعدة وعلم الأمراض. تشمل الأمثلة البارزة استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) للتنبؤ باستجابات العلاج الكيميائي لسرطان المعدة8،9،10 ونمذجة الاستجابة الظهارية لعدوى هيليكوباكتر بيلوري 11،12،13. تتكون عضويات المعدة البشرية من أنواع مختلفة من الخلايا الموجودة في المعدة ، بما في ذلك خلايا الرقبة وخلايا الحفرة والخلايا الداعمة الأخرى11,14. يمكن إنشاء عضويات المعدة إما من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) أو الخلايا الجذعية المعزولة مباشرة من أنسجة المعدة التي تم الحصول عليها عن طريق الخزعات أو من عينات استئصال المعدة11،14. عادة ما يتم عزل الخلايا الجذعية المعدية عن أنسجة المعدة عن طريق عزل وزراعة الغدد المعدية أو هضم عينات الأنسجة إنزيميا لتحرير الخلايا المفردة9،13،15. الأهم من ذلك ، أن تمايز الخلايا داخل عضويات المعدة المتولدة باستخدام أي من هذه التقنيات قد ثبت أنهمماثل 13. يركز البروتوكول الموصوف هنا على هضم خلية واحدة.
تمثل الكائنات العضوية ابتكارا علميا يسد الفجوة بين زراعة الخلايا التقليدية والأعضاء بأكملها. مع استمرار تقدم البحث في هذا المجال ، تستعد الكائنات العضوية للمساهمة في تطوير علاجات وعلاجات أكثر فعالية لمجموعة واسعة من التطبيقات. بالنظر إلى الاستخدام المتزايد ل PDOs المعدة ، هناك حاجة في الوقت المناسب لنهج موحد لتوليدها. هنا ، يتم وصف بروتوكول توليد PDOs المعدة البشرية من الخلايا المفردة المعزولة من أنسجة خزعة المعدة الحميدة المكتسبة أثناء التنظير العلوي. الأهم من ذلك والفريد ، يتم تحديد عدد موحد من الخلايا المفردة للبذر لتوليد PDOs المعدة بشكل موثوق والسماح بالتوصيف اللاحق. باستخدام هذه التقنية ، يتم إظهار اختلافات موثوقة في تكوين ونمو المواد العضوية الناتجة عن خزعات جسم المعدة أو غار المعدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع جميع الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول من الأفراد الذين قدموا موافقة مستنيرة لجمع الأنسجة من خلال دراسة جمع أنسجة المعدة المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بنسلفانيا (IRB # 842961). طلب من المشاركين في هذه الدراسة الخضوع لتنظير علوي كجزء من رعايتهم الروتينية ، وأن يكونوا على الأقل 18 عاما ، وأن يكونوا قادرين على تقديم موافقة مستنيرة. التزمت جميع الأبحاث التي أجريت بالمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة بنسلفانيا.
1. التحضير التجريبي
- قم بإعداد وسائط L-WRN المشروطة كما هو موضح سابقا16. على الرغم من أنها ليست إلزامية ، يمكن التحقق من تركيزات Wnt-3A و R-spondin و noggin الموجودة في الوسائط المكيفة باستخدام مجموعات ELISA المتاحة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- تحضير RPMI-ANTIBIOTICS (RPMI-ABX) ، PBS-ANTIBIOTICS (PBS-ABX) ، PBS-DITHIOTHREITOL (PBS-DTT) ، عازلة الهضم ، ووسائط عضوية معدية (انظر الجدول التكميلي 1 للحصول على تركيبة مفصلة). وسائل الإعلام العضوية في المعدة مستقرة لمدة 1 أسبوع عند 4 °C.
- ملقط الأوتوكلاف ومقص تشريح دقيق وأنابيب سعة 1.5 مل.
- ابدأ في إذابة مصفوفة الغشاء القاعدي (Matrigel) على الجليد.
- ابدأ بإذابة محلول الهضم و Trypsin-EDTA في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
- اضبط شاكر الحاضنة المداري على 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
2. عزل الخلايا المفردة من نسيج الخزعة
- اجمع خزعات المعدة أثناء التنظير العلوي17 باتباع البروتوكول السريري المؤسسي ، والذي من المحتمل أن يتضمن استخدام ملقط جامبو. استخدم إبرة ذات رأس غير حاد لاستخراج عينات الأنسجة من الملقط ووضعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على وسائط RPMI-ABX. احتفظ بالأنبوب على الثلج لنقله بسرعة إلى المختبر.
ملاحظة: على الأقل ، يجب جمع 2-4 خزعات. - اسمح لنسيج الخزعة بالاستقرار في قاع الأنبوب المخروطي. استخدم ماصة لشفط الوسائط وغسل الخزعات مرتين باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت PBS-ABX. ليست هناك حاجة للطرد المركزي ، حيث تستقر قطع الأنسجة بشكل طبيعي في الأنبوب المخروطي.
- نقل ما لا يقل عن 20 ملغ من أنسجة الخزعة إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على 1 مل من PBS-DTT.
- استخدم مقص تشريح دقيق لتقطيع الأنسجة إلى قطع بحجم 1-2 مم أو أصغر.
- استخدم جهاز طرد مركزي صغير منضدية لمدة 15 ثانية لتجميع قطع الأنسجة في قاع الأنبوب ونضح أكبر قدر ممكن من المواد الطافية. حجم صغير متبقي من PBS-DTT مقبول.
- أضف 5 مل من محلول الهضم الدافئ حديثا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. لنقل قطع الأنسجة الصغيرة دون فقدان الأنسجة ، خذ 500 ميكرولتر من محلول الهضم وأضفه إلى أنبوب 1.5 مل الذي يحتوي على الأنسجة. بعد ذلك ، قم بتعديل طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر بالمقص لزيادة قطر الطرف ، مما يسمح بسهولة شفط ونقل قطع الأنسجة إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على مخزن الهضم.
- احتضان محلول الهضم ومزيج الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز المداري عند 200 دورة في الدقيقة.
- أضف 5 مل من التربسين الدافئ مع 0.25٪ EDTA إلى مخزن الهضم واحتضانه لمدة 10 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز الحجاج عند 200 دورة في الدقيقة.
- قم بتحييد المخزن المؤقت للهضم والتربسين عن طريق إضافة حجم متساو من وسائط DMEM / F12 المتقدمة (Adv.) وتمرير المحلول عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
- حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1400 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. اعتمادا على الحجم الأولي لنسيج الخزعة ، قد تكون أو لا تكون حبيبات الخلايا الصغيرة مرئية.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسائط Adv. DMEM / F12 واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام Trypan Blue ومقياس الدم.
- قم بإذابة الخلايا مرة أخرى من خلال الطرد المركزي عند 1400 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية.
ملاحظة: يقدم الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا لعملية عزل الخلايا المفردة من نسيج الخزعة.
3. تضمين خلايا مفردة في مصفوفة غشاء القاعدية "قبة"
- بناء على العدد المحسوب للخلايا القابلة للحياة ، احسب حجم مصفوفة الغشاء القاعدي المطلوبة لتحقيق تركيز نهائي قدره 105 خلايا قابلة للحياة لكل 50 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي.
- قم بإجراء ما يلي بسرعة لمنع مصفوفة الغشاء القاعدي من البلمرة قبل الطلاء. قم بإزالة مصفوفة الغشاء القاعدي المذاب من الجليد ، وأضف الحجم المحسوب مسبقا لمصفوفة الغشاء القاعدي إلى الخلايا ، واخلطها برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لمدة 10 ثوان تقريبا.
ملاحظة: من الضروري تجنب إنشاء فقاعات أثناء هذه الخطوة. لا تخفف مصفوفة الغشاء القاعدي. - ماصة سريعة 50 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي / خليط الخلية في وسط الآبار الفردية في لوحة زراعة الأنسجة 24 بئرا.
- قم على الفور بتغطية اللوحة المكونة من 24 بئرا ، وبحركة واحدة سلسة ، اقلب اللوحة رأسا على عقب. ضع اللوحة المقلوبة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي بالبلمرة.
ملاحظة: يعد عكس اللوحة أمرا ضروريا لمنع الخلايا من الغرق في قاع اللوحة ولتمكين مصفوفة الغشاء القاعدي من البلمرة إلى شكل "قبة" 3D. - أضف 500 ميكرولتر من الوسائط العضوية المعدة التي تم تسخينها مسبقا إلى كل بئر ، مما يضمن غمر الجزء العلوي من كل "قبة" بالكامل في الوسائط. قم بتوزيع الوسائط أسفل جانب كل بئر لتجنب إزعاج "القبة".
- قم بتغيير الوسائط كل 2-3 أيام.
4. المرور الروتيني للعضويات عن طريق التجزئة
- بمجرد أن تصبح المواد العضوية جاهزة للتمرير ، قم بإزالة الوسائط من كل بئر معين.
ملاحظة: لتحديد الوقت المناسب للمرور ، يرجى الرجوع إلى قسم النتائج التمثيلية. - قم بتوزيع 1 مل من وسائط Adv. DMEM / F12 الباردة مباشرة على "قبة" مصفوفة الغشاء القاعدي. هذا يجب أن يبدأ بسهولة تفكك "القبة". استمر في الشفط والاستغناء حتى تنفصل جميع شظايا "القبة" عن اللوحة.
- نقل كل من الوسائط ومصفوفة الغشاء القاعدي المجزأة إلى البئر التالي ، مع تكرار هذه العملية لجميع الآبار المقرر مرورها. بعد تفكيك "قبة" مصفوفة الغشاء القاعدي النهائية ، قم بتوزيع الوسائط وخليط المواد العضوية ومصفوفة الغشاء القاعدي في أنبوب سعة 1.5 مل.
- قم بتوصيل طرف 1000 ميكرولتر بماصة P1000 ، ثم أدخل هذا الطرف في طرف 200 ميكرولتر. سيؤدي ذلك إلى إنشاء طرف ماصة بقطر صغير بما يكفي لتفتيت المواد العضوية مع السماح بطموح حجم أكبر.
- ماصة بقوة خليط من المواد العضوية ومصفوفة الغشاء القاعدي صعودا وهبوطا حوالي 25 مرة لتجزئة المواد العضوية إلى قطع صغيرة.
- أجهزة الطرد المركزي الخليط العضوي المجزأ باستخدام جهاز طرد مركزي منضدية عند 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية عند 2000 × جم. سيؤدي ذلك إلى حبيبات من المواد العضوية المجزأة مفصولة عن مصفوفة الغشاء القاعدي والوسائط. استخدم ماصة لشفط الوسائط وطاف مصفوفة الغشاء القاعدي. لا تستخدم فراغا لاستنشاق المادة الطافية ، لأن الحبيبات فضفاضة.
- احسب حجم مصفوفة غشاء القاع المذابة حديثا المطلوبة بحيث يتم تقسيم عدد الآبار / القباب بنسبة 1: 2 (50 ميكرولتر / قبة). أضف مصفوفة غشاء القاع الطازجة وماصة بلطف لأعلى ولأسفل للخلط ، مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات.
- قم بسرعة بتقسام 50 ميكرولتر من خليط الشظايا العضوية ومصفوفة الغشاء القاعدي في آبار فردية من صفيحة 24 بئرا.
- قم بتغطية اللوحة ، اقلبها رأسا على عقب ، وضعها في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي بالبلمرة.
- أضف 500 ميكرولتر من الوسائط العضوية المعدة الدافئة مسبقا إلى كل بئر.
ملاحظة: يقدم الشكل 2 نظرة عامة تخطيطية على مرور الكائنات العضوية المشتقة من مريض المعدة من خلال التجزئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتائج التمثيلية اللاحقة مستمدة من الخزعات المأخوذة من ظهارة حميدة لكل من جسم المعدة ومناطق غار المعدة في معدة خمسة مرضى مختلفين يخضعون للتنظير العلوي. تم طلاء اثنين إلى أربعة "قباب" / آبار وتحليلها لكل مريض لكل من خزعات جسم المعدة والغار. تم إنشاء المواد العضوية بنجاح من جسم المعدة وأنسجة خزعة غار المعدة من جميع المرضى الخمسة. في المتوسط ، تم تحليل 41 عضويا لكل "قبة" / بئر. جميع الصور عبارة عن إسقاطات z تم الحصول عليها باستخدام مجهر متحد البؤر ، وتم إجراء القياس الكمي لحجم العضو العضوي والكروية باستخدام برنامج تحليل الصور المتاح تجاريا (انظر جدول المواد).
يمكن التعرف على المواد العضوية بشكل عام في غضون 10 أيام بعد بذر الخلايا المفردة (الشكل 3 أ). بحلول اليوم 20 ، تكون المواد العضوية كبيرة وعادة ما تحتاج إلى المرور. في حين أن عدد الكائنات العضوية التي تكون بعد البذر أحادي الخلية يمكن أن يكون متغيرا إلى حد ما ، فإن النتائج المتوقعة لعدد الكائنات العضوية المتكونة من خزعات المعدة في الجسم والغار موضحة في الشكل 3 ب. يبلغ عدد الكائنات العضوية في الجسم والغار ذروته في اليوم 10 بعد البذر. على الرغم من أنه ليس مهما ، إلا أن العدد الإجمالي للعضويات يبدأ في الانخفاض من اليوم 10 إلى اليوم 15 واليوم 15 إلى اليوم 20. يبدو أن هناك مجموعة فرعية من الكائنات العضوية الصغيرة التي تتشكل بحلول اليوم 10 ثم تتوقف عن النمو وتموت خلال الأيام العشرة التالية ، وهو ما يفسر هذا الاتجاه. الأهم من ذلك ، تبين أن عدد الكائنات العضوية المتكونة من أنسجة الخزعة الغارية أعلى بكثير من أنسجة الخزعة من الجسم في الأيام 10 و 15 و 20. كان عدد الكائنات العضوية الغارية التي تشكلت في المتوسط أعلى بمقدار 2 أضعاف من عدد الكائنات العضوية المتكونة من الجسم.
في الشكل 3C ، يتم عرض النتائج التمثيلية لنمو الكائنات العضوية بعد البذر أحادي الخلية بين اليوم 10 واليوم 20. بينما شهدت الكائنات العضوية من كل من خزعات الغار والجسم نموا مطردا من اليوم 10 إلى 20 ، أظهرت الكائنات العضوية الناتجة عن أنسجة الخزعة الغارية معدل نمو أكبر مقارنة بالمواد العضوية الناتجة عن أنسجة خزعة الجسم. على وجه الخصوص ، كان للعضويات الغارية مساحة أكبر بنحو 4 أضعاف من عضويات الجسم في اليوم 20.
عبر المرضى المختلفين ، لوحظ عادة تنوع مورفولوجيا عضوي في أي "قبة" / بئر واحدة (الشكل 4 أ). بعض الكائنات العضوية أكثر استدارة أو كروية بينما أظهر البعض الآخر مورفولوجيا أكثر انتظاما. ومع ذلك ، في المتوسط ، أظهرت الكروية ، وهي قياس لمدى كروية العضو (حيث درجة 1 = كرة مثالية)18 ، اختلافا طفيفا داخل وبين الكائنات العضوية المتولدة من أنسجة خزعة الجسم أو الغار (الشكل 4 ب). لذلك ، على الرغم من وجود معدلات نمو مختلفة ، لا توجد عادة اختلافات مورفولوجية كبيرة بين الكائنات العضوية الناتجة عن أنسجة الخزعة في جسم المعدة أو الغار.
بحلول اليوم 20 بعد البدء ، تكون عضويات المعدة جاهزة عادة للمرور. يعد الحجم العضوي الكبير (قطره ≥1500 ميكرومتر) أو الجزء الداخلي الداكن (الذي يشير إلى دوران خلوي واسع النطاق) للعضو من العلامات الرئيسية على ضرورة مرور المواد العضوية (الشكل 5 أ). قد تبدأ الكائنات العضوية المتبقية لتجاوز هذه النقطة في الانهيار إلى طبقات أحادية 2D (الشكل 5B) التي لا تعيد تشكيل المواد العضوية بشكل موثوق بعد المرور ، وربما تشير إلى فقدان الجدوى أو الجذعية. بعد تمرير وإعادة بذر عضويات المعدة باستخدام بروتوكول التجزئة الموصوف هنا ، ستحتوي "القباب" على العديد من الأجزاء العضوية (الشكل 5C) التي ستعيد تنظيم نفسها في العديد من الكائنات العضوية وتنمو بسرعة أكبر بكثير مقارنة بالبذر الأولي للخلايا المفردة (الشكل 5 د). إذا كان نمو الأعضاء لا يزال بحاجة إلى توصيف و / أو توحيد في وقت المرور ، فيمكن بدلا من ذلك هضم عضويات المعدة إلى خلايا مفردة ، كما هو موضح سابقا19.
الشكل 1: توليد عضويات مشتقة من مريض المعدة. نظرة عامة تخطيطية تصور عملية توليد المواد العضوية المشتقة من مريض المعدة من خزعات ظهارة المعدة الحميدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تمرير العضويات المشتقة من مريض المعدة. نظرة عامة تخطيطية توضح مرور المواد العضوية المشتقة من مريض المعدة من خلال التجزئة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تكوين ونمو عضويات مشتقة من مريض المعدة. (أ) صور إسقاط Z تمثيلية تعرض نمو عضويات المعدة في اليوم 10 و15 و20 بعد البذر أحادي الخلية. الصور هي من المواد العضوية الناتجة عن جسم المعدة وأنسجة خزعة الغار من نفس المريض. شريط المقياس = 1 مم. (B) متوسط (±SD) عدد أجسام المعدة وعضويات الغار في النقاط الزمنية المحددة بعد البذر أحادي الخلية. (ج) متوسط (±SD) مساحة (ميكرومتر2) من جسم المعدة وعضويات الغار في نقاط زمنية محددة بعد البذر أحادي الخلية. ن = 5 مرضى لكل مجموعة ونقطة زمنية. * = فرق ذو دلالة إحصائية (p ≤ 0.05) في النقطة الزمنية المشار إليها. n.s. = لا يوجد فرق ذو دلالة إحصائية في النقطة الزمنية المشار إليها. المقارنات الإحصائية التي أجريت عبر 2-way ANOVA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مورفولوجيا العضو المشتق من مريض المعدة. (أ) صور إسقاط z تمثيلية لأشكال عضوية معدية مختلفة من "قبة" / بئر من الكائنات العضوية المشتقة من جسم المعدة في اليوم 15 بعد البذر أحادي الخلية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) متوسط (±SD) جسم المعدة والكروية العضوية الغار (حيث القيمة 1 = كرة مثالية). ن = 5 مرضى لكل مجموعة ونقطة زمنية. n.s. = لا يوجد فرق ذو دلالة إحصائية في أي نقطة زمنية. المقارنات الإحصائية التي أجريت عبر 2-way ANOVA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تمرير العضو العضوي المشتق من مريض المعدة. (أ) صورة تمثيلية للعضويات الجاهزة للمرور في اليوم 20 بعد البذر أحادي الخلية. (ب) صورة تمثيلية للعضويات المتأخرة للمرور في اليوم 25 بعد البذر أحادي الخلية. (ج) صورة تمثيلية للعضويات المجزأة بعد إعادة البذر (المقطع 1 - اليوم 0). (د) صورة تمثيلية لنمو الأعضاء على مدى 5 أيام بعد إعادة البذر (المقطع 1 - اليوم 5). جميع الصور عبارة عن إسقاطات z. قضبان المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول التكميلي 1: الحلول والوصفات الإعلامية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، يتم تحديد بروتوكول مفصل لتوليد عضويات المعدة البشرية بشكل موثوق من خلايا مفردة معزولة من خزعات ظهارة حميدة من جسم المعدة والغار. تدور الخطوات الحاسمة في البروتوكول حول التوقيت وكذلك التعامل مع مصفوفة الغشاء القاعدي. للحفاظ على الجدوى ، من الضروري بدء البروتوكول في أقرب وقت ممكن بعد الحصول على نسيج الخزعة. الهدف هو البدء في هضم أنسجة الخزعة في غضون 30 دقيقة من إجراء الخزعة. يمكن أن يكون التعامل مع مصفوفة الغشاء القاعدي أمرا صعبا أيضا. عندما يذوب على الجليد ، يبقى سائلا. ومع ذلك ، عند درجات حرارة أعلى من 4 درجات مئوية ، فإنه يتبلمر. لذلك ، يجب أن يتم نقل مصفوفة الغشاء القاعدي بسرعة من الجليد للخلط مع الخلايا المفردة أو الشظايا العضوية لطلاء "القباب" على الفور ، حيث تبدأ في البلمرة في غضون دقيقة واحدة. بمجرد أن يتم بلمرته في أنبوب ، لا يمكن استنشاقه في طرف ماصة. في حالة حدوث ذلك ، يمكن وضع الأنبوب على الجليد حتى يتبلمر Matrigel مرة أخرى إلى سائل. عند السحب برفق لأعلى ولأسفل لخلط الخلايا المفردة أو الشظايا العضوية مع مصفوفة الغشاء القاعدي ، من الضروري أيضا تجنب إنشاء فقاعات. في حين أن الفقاعات في مصفوفة الغشاء القاعدي "قبة" لا يبدو أنها تعيق تكوين العضوية ونموها ، إلا أنها يمكن أن تعيق التصور. بالإضافة إلى ذلك ، بعد اقتباس مصفوفة الغشاء القاعدي / خليط الخلية في بئر (آبار) لوحة زراعة الخلايا ، يجب قلب اللوحة ووضعها في حاضنة. هذه الخطوة ضرورية للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي بالبلمرة في شكل "قبة" 3D ومنع الخلايا المفردة أو الشظايا العضوية من الغرق في أسفل اللوحة.
باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحديد عضويات المعدة في غضون 10 أيام من بذر الخلية الواحدة. تظهر التجربة أن عددا قليلا جدا من الكائنات العضوية الجديدة في المعدة تتشكل بعد اليوم العاشر ، وفي الواقع ، قد ينخفض العدد الإجمالي للعضويات بشكل طفيف من اليوم 10-20. هذا صحيح بالنسبة للعضويات المتولدة من كل من جسم المعدة والغار. ومع ذلك ، فإن العدد الإجمالي للعضويات التي تشكلت من خزعات غار المعدة أعلى بكثير من خزعات الجسم المعدية. علاوة على ذلك ، فإن نمو الكائنات العضوية الغارية يفوق بشكل كبير عضويات الجسم بين الأيام 10-20 بعد بذر الخلية الواحدة. يمكن أن يعزى هذا الاختلاف إلى الاختلافات في حساسية Wnt. أظهرت دراسة حديثة أن PDOs في جسم المعدة تظهر نموا أفضل مع انخفاض تنشيط Wnt ، في حين أن PDOs غار المعدة تزدهر مع تنشيط Wnt أعلى20. لا يتم تحديد موقع خزعات المعدة المستخدمة لإنشاء PDOs في المعدة عادة في الأدبيات. يجب مراعاة هذه الاختلافات في الدراسات المستقبلية باستخدام PDOs المعدة الناتجة عن خزعات المعدة في مناطق المعدة المختلفة.
جانب آخر مهم من هذا البروتوكول هو إنشاء عدد موحد من الخلايا المفردة للبذر لكل "قبة" / بئر لتوليد PDOs المعدة بشكل موثوق. في حين أن دراسة سابقة أبلغت عن عدد موحد من الغدد المعدية لبذرها لتوليد PDO ، لم تذكر أي دراسات سابقة باستخدام طريقة هضم خلية واحدة عدد الخلايا المصنفة أو ما إذا كان العدد ثابتا عبر خطوط PDO المختلفة. يمكن أن يؤدي الفشل في توحيد عدد الخلايا المصنفة إلى عدد متغير للغاية من الخلايا الجذعية التي يتم زرعها لكل "قبة" / بئر. نظرا لأن الخلايا الجذعية هي المصدر الرئيسي لتكوين عضويات المعدة ، فقد يؤدي ذلك إلى معدلات متغيرة من تكوين الأعضاء ونموها. لذلك ، فإن استخدام عدد غير موحد من الخلايا المفردة يمكن أن يربك تفسيرات مقارنات التكوين أو النمو عبر خطوط PDO المعدة المختلفة. هنا ، ثبت أن توحيد عدد الخلايا المصنفة إلى 105 خلايا لكل "قبة" / بئر يولد PDOs المعدة بشكل موثوق من خزعات كل من الجسم والمناطق الغارية في المعدة.
تم تحسين هذا البروتوكول لاستخدام أنسجة خزعة المعدة الطازجة. وبالتالي ، قد يختلف نجاح هذا البروتوكول عند استخدام الأنسجة المجمدة أو الأنسجة المحفوظة بوسائل أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، لا توجد بيانات حول المدة التي تحافظ فيها الخزعات الطازجة على صلاحيتها ، حيث تتم معالجة أنسجة الخزعة في أسرع وقت ممكن بعد إزالتها من معدة المريض. من المفترض أنه كلما طالت مدة بقاء الأنسجة الطازجة قبل المعالجة ، قل عدد الخلايا القابلة للحياة.
يوفر تمرير PDOs في المعدة عن طريق التجزئة ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، طريقة سهلة للمرور الروتيني. في حين تم تمرير PDOs المعدة بنجاح حتى 4 مرات باستخدام هذه التقنية ، لم تكن هناك محاولات لتحديد عدد المرات التي يمكن تمريرها مع الحفاظ على نمو مطرد وقابلية للحياة. تشير بعض التقارير إلى أن نمو عضويات المعدة قد يتباطأ بعد 5 ممرات أو أكثر21,22 ، بينما لاحظ البعض الآخر نموا موثوقا به لما يصل إلى 10 ممرات23.
تحتوي الوسائط العضوية في المعدة المستخدمة في هذا البروتوكول على Wnt-3A و noggin و R-spondin المشتقة من الوسائط المكيفة لخلايا L-WRN. لإنتاج الوسائط المشروطة ، يتم استخدام بروتوكول وصفه Miyoshi و Stappenbeck16. بدلا من ذلك ، يمكن شراء Wnt-3A و noggin و R-spondin بشكل منفصل كبروتينات مؤتلفة. يعد شراء المكونات الفردية بشكل منفصل مثاليا لتجنب تأثيرات الدفعات المحتملة التي قد تنشأ عند استخدام الوسائط المكيفة من خلايا L-WRN. ومع ذلك ، فإن شراء البروتينات المؤتلفة مكلف وقد يكون باهظ التكلفة للباحثين الذين يعملون بشكل متكرر مع المواد العضوية.
نظرا للاستخدام المتزايد ل PDOs المعدة في تطبيقات مختلفة ، فقد حان الوقت ومن الضروري إنشاء مناهج موحدة لتوليد PDOs المعدة الحميدة. يقدم البروتوكول الموضح هنا طريقة موثوقة للتحقيقات المستقبلية باستخدام PDOs المعدة. في تجربتنا ، نجح هذا البروتوكول في توليد مواد عضوية من خزعات الغشاء المخاطي الحميد في المعدة أكثر من 90٪ من الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات ذات صلة.
Acknowledgments
جامعة بنسلفانيا الطب الجينومي T32 HG009495 (KHB) ، NCI R21 CA267949 (BWK) ، برنامج الرجال و BRCA في مركز باسر ل BRCA (KHB ، BWK) ، جائزة منحة مؤسسة عائلة DeGregorio (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H.
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S.
- Zhao, Z., et al.
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
