Summary
गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड अनुसंधान में बढ़ते उपयोग को पाते हैं, फिर भी मानकीकृत सीडिंग घनत्व के साथ एकल-कोशिका डाइजेस्ट से मानव गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए औपचारिक प्रोटोकॉल की कमी है। यह प्रोटोकॉल ऊपरी एंडोस्कोपी के दौरान प्राप्त बायोप्सी ऊतक से गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड को मज़बूती से बनाने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (पीडीओ) गैस्ट्रिक जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करते हैं। नतीजतन, इन पीडीओ अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में बढ़ते उपयोग पाते हैं। हालांकि, प्रकाशित दृष्टिकोण की कमी एक मानकीकृत प्रारंभिक सेल बोया घनत्व को बनाए रखते हुए एकल सेल डाइजेस्ट से गैस्ट्रिक पीडीओ के उत्पादन के लिए मौजूद है. इस प्रोटोकॉल में, पृथक एकल कोशिकाओं से गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड की दीक्षा और विखंडन के माध्यम से ऑर्गेनोइड को पारित करने के लिए एक विधि के प्रावधान पर जोर दिया गया है। महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल दर्शाता है कि प्रारंभिक सेल बोने घनत्व के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण लगातार सौम्य बायोप्सी ऊतक से गैस्ट्रिक organoids पैदावार और organoid विकास के मानकीकृत मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. अंत में, सबूत उपन्यास अवलोकन का समर्थन करते हैं कि गैस्ट्रिक पीडीओ गठन और विकास की अलग-अलग दरों को प्रदर्शित करते हैं कि क्या ऑर्गेनोइड शरीर की बायोप्सी या पेट के एंट्रल क्षेत्रों से उत्पन्न होते हैं। विशेष रूप से, यह पता चला है कि ऑर्गेनॉइड दीक्षा के लिए एंट्रल बायोप्सी ऊतक के उपयोग के परिणामस्वरूप गैस्ट्रिक बॉडी की बायोप्सी से उत्पन्न ऑर्गेनोइड की तुलना में 20 दिनों की अवधि में अधिक संख्या में ऑर्गेनोइड का गठन होता है और अधिक तेजी से ऑर्गेनॉइड विकास होता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को गैस्ट्रिक पीडीओ के साथ सफलतापूर्वक उत्पन्न करने और काम करने के लिए एक समय पर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीका प्रदान करता है।
Introduction
ऑर्गेनोइड लघु त्रि-आयामी (3 डी) सेलुलर संरचनाएं हैं जो उन अंगों की वास्तुकला और कार्यक्षमता से मिलती जुलती हैं जिनसे वे 1,2 प्राप्त हुए थे। इन प्रयोगशाला विकसित मॉडल एक नियंत्रित वातावरण में स्टेम कोशिकाओं या ऊतक-विशिष्ट कोशिकाओं की खेती करके बनाए जाते हैं जो इन कोशिकाओं को विभिन्न सेल प्रकारों 1,2,3में आत्म-व्यवस्थित और अंतर करने की अनुमति देता है। ऑर्गेनोइड के प्रमुख लाभों में से एक पारंपरिक द्वि-आयामी (2 डी) सेल संस्कृतियों 1,2,3 की तुलना में मानव जीव विज्ञान को अधिक बारीकी से पुन: व्यवस्थित करने की उनकी क्षमता है। विशेष रूप से, मानव ऑर्गेनोइड को उनके मूल 3,4,5 के ऊतक की आनुवंशिक विविधता को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। ऑर्गेनोइड मानव अंग विकास, मॉडल रोगों का अध्ययन करने और नियंत्रित प्रयोगशाला सेटिंग में संभावित चिकित्सा विज्ञान का परीक्षण करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड व्यक्तिगत रोगी के नमूनों से प्राप्त किए जा सकते हैं, व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण और व्यक्तिगत उपचार 3,6,7 के संभावित विकास को सक्षम करते हैं।
शोधकर्ताओं ने गैस्ट्रिक जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए मानव गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड का उपयोग किया है। प्रमुख उदाहरणों में गैस्ट्रिक कैंसर कीमोथेरेपी प्रतिक्रियाओं 8,9,10 की भविष्यवाणी करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (पीडीओ) का उपयोग शामिल है और हेलिकोबैक्टर पाइलोरी संक्रमण 11,12,13के लिए उपकला प्रतिक्रिया का मॉडल है। मानव गैस्ट्रिक organoids गर्दन कोशिकाओं, गड्ढे कोशिकाओं, और अन्य सहायक कोशिकाओं11,14 सहित पेट में पाया विभिन्न सेल प्रकार के होते हैं. गैस्ट्रिक organoids या तो प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (IPSC) या स्टेम कोशिकाओं सीधे बायोप्सी के माध्यम से या गैस्ट्रिक लकीर नमूनों11,14 के माध्यम से प्राप्त गैस्ट्रिक ऊतक से अलग से उत्पन्न किया जा सकता है. गैस्ट्रिक ऊतक से गैस्ट्रिक स्टेम कोशिकाओं का अलगाव आमतौर पर गैस्ट्रिक ग्रंथियों को अलग करने और संवर्धन या एंजाइमेटिक रूप से एकल कोशिकाओं 9,13,15 को मुक्त करने के लिए ऊतक के नमूनों को पचाने के द्वारा किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, इन तकनीकों में से किसी एक का उपयोग कर उत्पन्न गैस्ट्रिक organoids के भीतर कोशिकाओं के भेदभाव समान13 होना दिखाया गया है. इस के साथ वर्णित प्रोटोकॉल एक एकल कोशिका डाइजेस्ट पर केंद्रित है.
ऑर्गेनोइड एक वैज्ञानिक नवाचार का प्रतिनिधित्व करते हैं जो पारंपरिक सेल संस्कृति और पूरे अंगों के बीच की खाई को पाटता है। जैसे-जैसे क्षेत्र में अनुसंधान प्रगति जारी है, ऑर्गेनोइड अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अधिक प्रभावी उपचार और उपचार के विकास में योगदान करने के लिए तैयार हैं। गैस्ट्रिक पीडीओ के बढ़ते उपयोग को देखते हुए, उनकी पीढ़ी के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण की समय पर आवश्यकता है। यहां, ऊपरी एंडोस्कोपी के दौरान अधिग्रहित सौम्य गैस्ट्रिक बायोप्सी ऊतक से अलग एकल कोशिकाओं से मानव गैस्ट्रिक पीडीओ उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से और विशिष्ट रूप से, एकल कोशिकाओं की एक मानकीकृत संख्या को गैस्ट्रिक पीडीओ को मज़बूती से उत्पन्न करने और बाद के लक्षण वर्णन की अनुमति देने के लिए सीडिंग के लिए निर्धारित किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, गैस्ट्रिक बॉडी या गैस्ट्रिक एंट्रम की बायोप्सी से उत्पन्न ऑर्गेनोइड के गठन और विकास में विश्वसनीय अंतर प्रदर्शित किए जाते हैं।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी मानव ऊतक उन व्यक्तियों से एकत्र किए गए थे जिन्होंने पेंसिल्वेनिया संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी # # 842961) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित गैस्ट्रिक ऊतक संग्रह अध्ययन के माध्यम से ऊतक संग्रह के लिए सूचित सहमति प्रदान की थी। इस अध्ययन में प्रतिभागियों को अपनी नियमित देखभाल के हिस्से के रूप में ऊपरी एंडोस्कोपी से गुजरना आवश्यक था, कम से कम 18 वर्ष का होना चाहिए, और सूचित सहमति प्रदान करने में सक्षम होना चाहिए। किए गए सभी शोधों ने पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों का पालन किया।
1. प्रायोगिक तैयारी
- वातानुकूलित L-WRN मीडिया तैयार के रूप में पहले16 वर्णित है. हालांकि अनिवार्य नहीं है, वातानुकूलित मीडिया में निहित Wnt-3A, R-spondin, और noggin की सांद्रता को निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा किट का उपयोग करके जांचा जा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
- आरपीएमआई-एंटीबायोटिक्स (आरपीएमआई-एबीएक्स), पीबीएस-एंटीबायोटिक्स (पीबीएस-एबीएक्स), पीबीएस-डाइथियोथ्रेइटोल (पीबीएस-डीटीटी), पाचन बफर, और गैस्ट्रिक ऑर्गेनॉइड मीडिया तैयार करें (विस्तार संरचना के लिए पूरक तालिका 1 देखें)। गैस्ट्रिक ऑर्गेनॉइड मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए स्थिर है।
- आटोक्लेव संदंश, ठीक विच्छेदन कैंची, और 1.5 एमएल ट्यूबों.
- बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (मैट्रिगेल) विगलन शुरू.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पाचन बफर और Trypsin-EDTA विगलन शुरू.
- 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम के लिए एक इनक्यूबेटर कक्षीय प्रकार के बरतन सेट.
2. बायोप्सी ऊतक से एकल कोशिकाओं को अलग करना
- संस्थागत नैदानिक प्रोटोकॉल के बाद एक ऊपरी एंडोस्कोपी17 के दौरान गैस्ट्रिक बायोप्सी लीजिए, संभावना जंबो संदंश के उपयोग को शामिल. संदंश से ऊतक के नमूने निकालने के लिए एक कुंद इत्तला दे दी सुई का उपयोग करें और उन्हें आरपीएमआई-एबीएक्स मीडिया युक्त 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें। प्रयोगशाला में तेजी से हस्तांतरण के लिए ट्यूब को बर्फ पर रखें।
नोट: कम से कम, 2-4 बायोप्सी एकत्र की जानी चाहिए। - बायोप्सी ऊतक शंक्वाकार ट्यूब के तल पर बसने के लिए अनुमति दें. मीडिया महाप्राण और पीबीएस एबीएक्स बफर के 1 एमएल के साथ दो बार बायोप्सी धोने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें. सेंट्रीफ्यूजेशन की कोई आवश्यकता नहीं है, क्योंकि ऊतक के टुकड़े शंक्वाकार ट्यूब में स्वाभाविक रूप से बस जाते हैं।
- बायोप्सी ऊतक के एक न्यूनतम 20 मिलीग्राम एक 1.5 एमएल ट्यूब जिसमें पीबीएस-डीटीटी के 1 एमएल युक्त स्थानांतरण.
- ठीक विच्छेदन कैंची का प्रयोग करें टुकड़े है कि 1-2 मिमी या छोटे हैं में ऊतक में कटौती.
- ट्यूब के तल पर ऊतक के टुकड़ों को एकत्र करने के लिए 15 एस के लिए एक टेबलटॉप मिनीसेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें और जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करें। पीबीएस-डीटीटी की एक छोटी अवशिष्ट मात्रा स्वीकार्य है।
- एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए ताजा गर्म पाचन बफर के 5 एमएल जोड़ें. ऊतक खोने के बिना छोटे ऊतक के टुकड़े स्थानांतरित करने के लिए, पाचन बफर के 500 माइक्रोन लें और इसे ऊतक युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में जोड़ें। अगला, टिप के व्यास को बढ़ाने के लिए कैंची के साथ एक 1000 माइक्रोन पिपेट टिप की नोक को संशोधित करें, जिससे पाचन बफर युक्त 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ऊतक के टुकड़ों की आसान आकांक्षा और हस्तांतरण की अनुमति मिलती है।
- 200 आरपीएम पर कक्षीय झटकों के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पाचन बफर और ऊतक मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
- पाचन बफर में 0.25% EDTA के साथ गर्म ट्रिप्सिन के 5 एमएल जोड़ें और 200 आरपीएम पर कक्षीय झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- उन्नत (Adv.) DMEM/F12 मीडिया की एक बराबर मात्रा जोड़कर पाचन बफर और ट्रिप्सिन को बेअसर करें और 70 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर के माध्यम से समाधान पास करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिन के लिए 1400 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें। बायोप्सी ऊतक के प्रारंभिक आकार के आधार पर, एक छोटा सेल गोली दिखाई दे सकता है या नहीं भी हो सकता है।
- Adv. DMEM/F12 मीडिया के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और ट्रिपैन ब्लू और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिन के लिए 1400 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से कोशिकाओं को फिर से गोली दें और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
नोट: चित्रा 1 बायोप्सी ऊतक से एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रस्तुत करता है।
3. एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स "गुंबद" में एकल कोशिकाओं को एम्बेड करना
- व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती संख्या के आधार पर, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 50 माइक्रोन प्रति 105 व्यवहार्य कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की मात्रा की गणना करें।
- चढ़ाना से पहले पोलीमराइज़िंग से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को रोकने के लिए निम्नलिखित तेजी से करें। बर्फ से पिघले तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स निकालें, कोशिकाओं के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की पहले की गणना की मात्रा जोड़ें, और धीरे लगभग 10 एस के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण.
नोट: इस चरण के दौरान बुलबुले बनाने से बचना महत्वपूर्ण है। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को पतला न करें। - एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में व्यक्तिगत कुओं के केंद्र में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स/सेल मिश्रण के तेजी से विंदुक 50 माइक्रोन aliquots.
- तुरंत 24 अच्छी तरह से थाली को कवर और, एक ही चिकनी गति में, उल्टा थाली फ्लिप. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को पोलीमराइज़ करने की अनुमति देने के लिए 35 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में उलटा प्लेट रखें।
नोट: प्लेट को उलटना कोशिकाओं को प्लेट के नीचे डूबने से रोकने के लिए और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को 3 डी "गुंबद" आकार में पोलीमराइज़ करने में सक्षम करने के लिए आवश्यक है। - प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्व गर्म गैस्ट्रिक organoid मीडिया के 500 माइक्रोन जोड़ें, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक "गुंबद" के शीर्ष मीडिया में पूरी तरह से डूबा हुआ है. "गुंबद" को परेशान करने से बचने के लिए मीडिया को प्रत्येक कुएं के किनारे से नीचे की ओर फैलाएं।
- हर 2-3 दिनों में मीडिया बदलें।
4. विखंडन के माध्यम से ऑर्गेनोइड का नियमित पासिंग
- एक बार जब ऑर्गेनोइड पासिंग के लिए तैयार हो जाते हैं, तो प्रत्येक नामित कुएं से मीडिया को हटा दें।
नोट: पासिंग के लिए उपयुक्त समय निर्धारित करने के लिए, कृपया प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें। - बर्फ-ठंडे Adv. DMEM/F12 मीडिया के 1 एमएल को सीधे बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स "गुंबद" पर फैलाएं। यह आसानी से "गुंबद" के टूटने की शुरुआत करनी चाहिए। तब तक आकांक्षा और वितरण जारी रखें जब तक कि "गुंबद" के सभी टुकड़े प्लेट से अलग न हो जाएं।
- अगले कुएं के लिए मीडिया और खंडित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स दोनों परिवहन, पारित करने के लिए स्लेट किए गए सभी कुओं के लिए इस प्रक्रिया को दोहराते हुए। अंतिम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स "गुंबद" को अलग करने के बाद, मीडिया और ऑर्गेनोइड और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के मिश्रण को 1.5 एमएल ट्यूब में फैलाएं।
- एक P1000 विंदुक के लिए एक 1000 माइक्रोन टिप संलग्न करें, और फिर एक 200 माइक्रोन टिप में इस टिप डालें. यह ऑर्गेनोइड को टुकड़े करने के लिए एक छोटे से पर्याप्त व्यास के साथ एक विंदुक टिप बनाएगा, जबकि अभी भी एक बड़ी मात्रा की आकांक्षा की अनुमति देगा।
- ऑर्गेनोइड और बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स के मिश्रण को सख्ती से पिपेट करें और ऑर्गेनोइड को छोटे टुकड़ों में टुकड़े करने के लिए लगभग 25 बार नीचे करें।
- 2000 x ग्राम पर 30 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर टेबलटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करके खंडित ऑर्गेनॉइड मिश्रण को अपकेंद्रित्र। इसके परिणामस्वरूप तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और मीडिया से अलग खंडित ऑर्गेनोइड की एक गोली होगी। मीडिया और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करने के लिए एक वैक्यूम का उपयोग न करें, गोली ढीली है के रूप में.
- हौसले पिघले तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की मात्रा की गणना करें ताकि कुओं/गुंबदों की संख्या 1: 2 अनुपात (50 माइक्रोन / गुंबद) पर विभाजित हो। ताजा तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ें और धीरे मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे विंदुक, बुलबुले बनाने से बचने के लिए ख्याल रखना.
- तेजी से विभाज्य एक 24 अच्छी तरह से थाली के अलग-अलग कुओं में organoid टुकड़े और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के मिश्रण के 50 माइक्रोन.
- प्लेट को कवर करें, इसे उल्टा फ्लिप करें, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को पोलीमराइज़ करने की अनुमति देने के लिए 35 मिनट के लिए इसे 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पूर्व गर्म गैस्ट्रिक organoid मीडिया के 500 माइक्रोन जोड़ें.
नोट: चित्रा 2 विखंडन के माध्यम से गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड के गुजरने का एक योजनाबद्ध अवलोकन प्रस्तुत करता है।
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Representative Results
बाद के प्रतिनिधि परिणाम ऊपरी एंडोस्कोपी से गुजरने वाले पांच अलग-अलग रोगियों के पेट के गैस्ट्रिक बॉडी और गैस्ट्रिक एंट्रम क्षेत्रों दोनों के सौम्य उपकला से ली गई बायोप्सी से प्राप्त होते हैं। दो से चार "गुंबदों" / कुओं चढ़ाया और दोनों गैस्ट्रिक शरीर और एंट्रम बायोप्सी के लिए प्रति रोगी विश्लेषण किया गया. सभी पांच रोगियों से गैस्ट्रिक बॉडी और गैस्ट्रिक एंट्रम बायोप्सी ऊतक से ऑर्गेनोइड सफलतापूर्वक उत्पन्न हुए थे। औसतन, 41 ऑर्गेनोइड का विश्लेषण प्रति "गुंबद" / सभी छवियों z- अनुमानों एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अधिग्रहित कर रहे हैं, और organoid आकार और गोलाकार की मात्रा का ठहराव व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था.
ऑर्गेनोइड आम तौर पर एकल कोशिकाओं(चित्रा 3ए)के बीजारोपण के बाद 10 दिनों के भीतर पहचाने जाने योग्य होते हैं। 20 दिन तक, ऑर्गेनोइड बड़े होते हैं और आमतौर पर उन्हें पारित करने की आवश्यकता होती है। जबकि पोस्ट सिंगल-सेल सीडिंग बनाने वाले ऑर्गेनोइड्स की संख्या कुछ हद तक परिवर्तनशील हो सकती है, शरीर और एंट्रल गैस्ट्रिक बायोप्सी से बनने वाले ऑर्गेनोइड की संख्या के लिए अपेक्षित परिणाम चित्रा 3 बी में दिखाए गए हैं। शरीर और एंट्रल ऑर्गेनोइड की संख्या 10 दिन के बाद बोने पर चरम पर होती है। जबकि महत्वपूर्ण नहीं है, ऑर्गेनोइड की कुल संख्या दिन 10 से दिन 15 और दिन 15 से दिन 20 तक घटने लगती है। छोटे ऑर्गेनोइड की एक उप-जनसंख्या प्रतीत होती है जो दिन 10 तक बनती है और फिर विकास को रोक देती है और अगले 10 दिनों में मर जाती है, जो इस प्रवृत्ति की व्याख्या करेगी। महत्वपूर्ण रूप से, यह दिखाया गया है कि एंट्रल बायोप्सी ऊतक से बनने वाले ऑर्गेनोइड की संख्या 10, 15 और 20 दिनों में शरीर से बायोप्सी ऊतक की तुलना में काफी अधिक है। गठित एंट्रल ऑर्गेनोइड की संख्या शरीर से बनने वाले ऑर्गेनोइड की संख्या से औसतन 2 गुना अधिक थी।
चित्रा 3 सी में, दिन 10 और दिन 20 के बीच एकल कोशिका बोने के बाद ऑर्गेनॉइड विकास के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं। जबकि एंट्रल और बॉडी बायोप्सी दोनों के ऑर्गेनोइड ने दिन 10 से 20 तक लगातार वृद्धि देखी, एंट्रल बायोप्सी ऊतक से उत्पन्न ऑर्गेनोइड ने शरीर बायोप्सी ऊतक से उत्पन्न ऑर्गेनोइड की तुलना में अधिक वृद्धि दर प्रदर्शित की। विशेष रूप से, एंट्रल ऑर्गेनोइड में 20 दिन में शरीर के ऑर्गेनोइड की तुलना में लगभग 4 गुना अधिक क्षेत्र था।
विभिन्न रोगियों के पार, ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान की विविधता आमतौर पर किसी भी एकल "गुंबद" / कुछ ऑर्गेनोइड अधिक गोल या गोलाकार होते हैं जबकि अन्य अधिक अनियमित आकारिकी प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, औसतन, गोलाकारता, एक ऑर्गेनॉइड कितना गोलाकार है (जहां 1 = एक पूर्ण क्षेत्र)18का एक स्कोर, शरीर या एंट्रल बायोप्सी ऊतक(चित्रा 4बी)से उत्पन्न ऑर्गेनोइड के भीतर और बीच में थोड़ा बदलाव दिखाता है। इसलिए, हालांकि अलग-अलग विकास दर हैं, आमतौर पर गैस्ट्रिक बॉडी या एंट्रम के बायोप्सी ऊतक से उत्पन्न ऑर्गेनोइड के बीच कोई महत्वपूर्ण रूपात्मक अंतर नहीं होता है।
दीक्षा के बाद 20 दिन तक, गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड आमतौर पर पारित होने के लिए तैयार होते हैं। ऑर्गेनॉइड का एक बड़ा ऑर्गेनॉइड आकार (व्यास में ≥1500 माइक्रोन) या एक गहरा इंटीरियर (व्यापक सेलुलर टर्नओवर का विचारोत्तेजक) महत्वपूर्ण संकेत हैं कि ऑर्गेनोइड को पारित करने की आवश्यकता है(चित्रा 5ए)। इस बिंदु से परे जाने के लिए छोड़े गए ऑर्गेनोइड 2 डी मोनोलेयर्स (चित्रा 5 बी) में टूटना शुरू कर सकते हैं जो गुजरने के बाद मज़बूती से ऑर्गेनोइड को फिर से नहीं बनाते हैं, शायद व्यवहार्यता या स्टेमनेस के नुकसान का संकेत देते हैं। यहां वर्णित विखंडन प्रोटोकॉल का उपयोग करके गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड को पारित करने और फिर से बोने के बाद, "गुंबदों" में कई ऑर्गेनॉइड टुकड़े (चित्रा 5सी) शामिल होंगे जो खुद को कई और ऑर्गेनोइड में पुनर्गठित करेंगे और एकल कोशिकाओं(चित्रा 5डी)के प्रारंभिक बीजारोपण की तुलना में बहुत तेज़ी से बढ़ेंगे। यदि ऑर्गेनॉइड विकास को अभी भी गुजरने के समय लक्षण वर्णन और / या मानकीकरण की आवश्यकता है, तो गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड को इसके बजाय एकल कोशिकाओं में पचाया जा सकता है, जैसा कि पहले19 वर्णित है।
चित्रा 1: गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड की पीढ़ी। योजनाबद्ध अवलोकन सौम्य गैस्ट्रिक उपकला की बायोप्सी से गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने की प्रक्रिया को दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड का पासिंग। विखंडन के माध्यम से गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड के गुजरने को दर्शाते हुए योजनाबद्ध अवलोकन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड गठन और विकास। (ए) प्रतिनिधि जेड-प्रोजेक्शन छवियां दिन 10, 15, और 20 पोस्ट-सिंगल-सेल सीडिंग में गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड के विकास को प्रदर्शित करती हैं। छवियां गैस्ट्रिक बॉडी से उत्पन्न ऑर्गेनोइड और एक ही रोगी से एंट्रम बायोप्सी ऊतक की हैं। स्केल बार = 1 मिमी। (बी) गैस्ट्रिक बॉडी और एंट्रम ऑर्गेनोइड की औसत (±एसडी) संख्या, संकेतित टाइमपॉइंट्स पोस्ट-सिंगल-सेल सीडिंग पर। (सी) गैस्ट्रिक बॉडी का माध्य (±एसडी) क्षेत्र (माइक्रोन2) और संकेतित समय-बिंदुओं पर एंट्रम ऑर्गेनोइड एकल-कोशिका सीडिंग के बाद। n = प्रति समूह और टाइमपॉइंट 5 रोगी। * = संकेतित समय बिंदु पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर (p ≤ 0.05)। एनएस = संकेतित समय बिंदु पर कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। 2-तरफा एनोवा के माध्यम से आयोजित सांख्यिकीय तुलना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड आकारिकी। (ए) दिन 15 पोस्ट-सिंगल-सेल सीडिंग में गैस्ट्रिक बॉडी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड के एक व्यक्तिगत "गुंबद" / अच्छी तरह से विभिन्न गैस्ट्रिक ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान की प्रतिनिधि जेड-प्रोजेक्शन छवियां। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (बी) माध्य (±एसडी) गैस्ट्रिक बॉडी और एंट्रम ऑर्गेनॉइड स्फेरिसिटी (जहां 1 = एक पूर्ण क्षेत्र का मान)। n = प्रति समूह और टाइमपॉइंट 5 रोगी। एनएस = किसी भी समय बिंदु पर कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं। 2-तरफा एनोवा के माध्यम से आयोजित सांख्यिकीय तुलना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड पासिंग। (ए) दिन 20 के बाद एकल कोशिका बोने पर पारित होने के लिए तैयार organoids की प्रतिनिधि छवि. (बी)दिन 25 के बाद एकल सेल सीडिंग में पारित करने के लिए अतिदेय organoids की प्रतिनिधि छवि. (सी) पुन: बीजारोपण के बाद खंडित ऑर्गेनोइड की प्रतिनिधि छवि (मार्ग 1 - दिन 0)। (डी)रीबीडिंग के बाद 5 दिनों में ऑर्गेनॉइड विकास की प्रतिनिधि छवि (मार्ग 1 - दिन 5)। सभी इमेज z-प्रोजेक्शन हैं। स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक तालिका 1: समाधान और मीडिया व्यंजनों। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इसमें, गैस्ट्रिक बॉडी और एंट्रम से सौम्य उपकला की बायोप्सी से अलग एकल कोशिकाओं से मानव गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड को मज़बूती से उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल रेखांकित किया गया है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम समय के साथ-साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को संभालने के आसपास घूमते हैं। व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए, बायोप्सी ऊतक प्राप्त करने के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रोटोकॉल शुरू करना आवश्यक है। उद्देश्य के भीतर बायोप्सी ऊतक पचाने शुरू करने के लिए है 30 प्रदर्शन किया जा रहा के मिनट. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को संभालना भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है। जब बर्फ पर पिघलाया जाता है, तो यह एक तरल रहता है; हालांकि, 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर, यह पोलीमराइज़ करता है। इसलिए, "गुंबदों" चढ़ाना के लिए एकल कोशिकाओं या ऑर्गेनॉइड टुकड़ों के साथ मिश्रण करने के लिए बर्फ से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को तेजी से स्थानांतरित करना तुरंत किया जाना चाहिए, क्योंकि यह एक मिनट के भीतर पोलीमराइज़ करना शुरू कर देता है। एक बार जब यह एक ट्यूब में बहुलक हो जाता है, तो इसे विंदुक टिप में महाप्राण नहीं किया जा सकता है। यदि ऐसा होता है, तो ट्यूब को बर्फ पर रखा जा सकता है जब तक कि मैट्रिगेल वापस तरल में बदल न जाए। जब तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ एकल कोशिकाओं या ऑर्गेनॉइड टुकड़ों को मिश्रण करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पाइपिंग करते हैं, तो बुलबुले बनाने से बचना भी महत्वपूर्ण है। जबकि एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स "गुंबद" में बुलबुले ऑर्गेनॉइड गठन और विकास में बाधा नहीं लगते हैं, वे दृश्य में बाधा डाल सकते हैं। इसके अतिरिक्त, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स / सेल मिश्रण को सेल कल्चर प्लेट के कुएं (ओं) में एलिकोट करने के बाद, प्लेट को उल्टा किया जाना चाहिए और इनक्यूबेटर में रखा जाना चाहिए। यह कदम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को 3 डी "गुंबद" आकार में पोलीमराइज़ करने और एकल कोशिकाओं या ऑर्गेनॉइड टुकड़ों को प्लेट के नीचे डूबने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड को एकल सेल सीडिंग के 10 दिनों के भीतर पहचाना जा सकता है। अनुभव से पता चलता है कि बहुत कम नए गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड दिन 10 से परे बनते हैं, और वास्तव में, ऑर्गेनोइड की कुल संख्या 10-20 दिन से थोड़ी कम हो सकती है। यह गैस्ट्रिक बॉडी और एंट्रम दोनों से उत्पन्न ऑर्गेनोइड के लिए सच है। हालांकि, गैस्ट्रिक एंट्रल बायोप्सी से बनने वाले ऑर्गेनोइड की कुल संख्या गैस्ट्रिक बॉडी बायोप्सी की तुलना में काफी अधिक है। इसके अलावा, एंट्रल ऑर्गेनोइड की वृद्धि एकल कोशिका बोने के बाद 10-20 दिनों के बीच शरीर के ऑर्गेनोइड को पार कर जाती है। इस अंतर को Wnt संवेदनशीलता में भिन्नता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि गैस्ट्रिक बॉडी पीडीओ कम डब्ल्यूएनटी सक्रियण के साथ बेहतर विकास प्रदर्शित करते हैं, जबकि गैस्ट्रिक एंट्रम पीडीओ उच्च डब्ल्यूएनटी सक्रियण20 के साथ पनपते हैं। गैस्ट्रिक पीडीओ उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली गैस्ट्रिक बायोप्सी का स्थान आमतौर पर साहित्य में निर्दिष्ट नहीं होता है। विभिन्न पेट क्षेत्रों के गैस्ट्रिक बायोप्सी से उत्पन्न गैस्ट्रिक पीडीओ का उपयोग करके भविष्य के अध्ययनों में इस तरह के मतभेदों पर विचार किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू मज़बूती से गैस्ट्रिक पीडीओ पैदा करने के लिए "गुंबद" / अच्छी तरह से बीज करने के लिए एकल कोशिकाओं की एक मानकीकृत संख्या की स्थापना है. जबकि पिछले अध्ययन ने पीडीओ पीढ़ी के लिए बीज के लिए गैस्ट्रिक ग्रंथियों की एक मानकीकृत संख्या की सूचना दी थी, एकल सेल डाइजेस्ट विधि का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययनों में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या का उल्लेख नहीं किया गया है या यदि संख्या विभिन्न पीडीओ लाइनों में सुसंगत थी। वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या मानकीकृत करने में विफल रहने से स्टेम कोशिकाओं की अत्यधिक परिवर्तनशील संख्या प्रति "गुंबद" / चूंकि स्टेम सेल गैस्ट्रिक ऑर्गेनॉइड गठन का प्राथमिक स्रोत हैं, इससे ऑर्गेनॉइड गठन और विकास की परिवर्तनशील दर हो सकती है। इसलिए, एकल कोशिकाओं की एक गैर-मानकीकृत संख्या का उपयोग विभिन्न गैस्ट्रिक पीडीओ लाइनों में गठन या विकास की तुलना की व्याख्याओं को भ्रमित कर सकता है। यहां, यह प्रदर्शित किया गया है कि "गुंबद" प्रति 105 कोशिकाओं के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या को मानकीकृत करना / अच्छी तरह से पेट के शरीर और एंट्रल क्षेत्रों दोनों की बायोप्सी से गैस्ट्रिक पीडीओ उत्पन्न करता है।
इस प्रोटोकॉल ताजा गैस्ट्रिक बायोप्सी ऊतक के उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था. नतीजतन, इस प्रोटोकॉल की सफलता जमे हुए ऊतक या ऊतक अन्य माध्यमों से संरक्षित का उपयोग करते समय भिन्न हो सकते हैं. इसके अतिरिक्त, इस बात पर कोई डेटा नहीं है कि ताजा बायोप्सी कितनी देर तक व्यवहार्यता बनाए रखती है, क्योंकि रोगी के पेट से हटाने के बाद बायोप्सी ऊतक को जल्द से जल्द संसाधित किया जाता है। संभवतः, प्रसंस्करण से पहले ताजा ऊतक जितना अधिक समय तक बैठता है, उतनी ही कम व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग किया जाएगा।
विखंडन के माध्यम से गैस्ट्रिक पीडीओ पासिंग, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, नियमित पासिंग के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है। जबकि गैस्ट्रिक पीडीओ को इस तकनीक का उपयोग करके 4 बार सफलतापूर्वक पारित किया गया है, यह निर्धारित करने का कोई प्रयास नहीं किया गया है कि स्थिर विकास और व्यवहार्यता बनाए रखते हुए उन्हें कितनी बार पारित किया जा सकता है। कुछ रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड की वृद्धि 5 या अधिक मार्ग21,22 के बाद धीमी हो सकती है, जबकि अन्य ने 10 मार्ग23 तक विश्वसनीय वृद्धि देखी है।
इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त गैस्ट्रिक ऑर्गेनॉइड मीडिया में Wnt-3A, नोगिन और R-स्पोंडिन शामिल हैं जो L-WRN कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया से प्राप्त होते हैं। वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन करने के लिए, Miyoshi और Stappenbeck द्वारा वर्णित एक प्रोटोकॉल16 प्रयोग किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, Wnt-3A, नोगिन और R-स्पोंडिन को पुनः संयोजक प्रोटीन के रूप में अलग से खरीदा जा सकता है। अलग-अलग घटकों को अलग से खरीदना संभावित बैच प्रभावों से बचने के लिए आदर्श है जो एल-डब्ल्यूआरएन कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करते समय उत्पन्न हो सकते हैं। हालांकि, पुनः संयोजक प्रोटीन खरीदना महंगा है और उन शोधकर्ताओं के लिए लागत-निषेधात्मक हो सकता है जो अक्सर ऑर्गेनोइड के साथ काम करते हैं।
विभिन्न अनुप्रयोगों में गैस्ट्रिक पीडीओ के बढ़ते उपयोग को देखते हुए, सौम्य गैस्ट्रिक पीडीओ पैदा करने के लिए मानकीकृत दृष्टिकोण स्थापित करना समय पर और आवश्यक है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल गैस्ट्रिक पीडीओ का उपयोग भविष्य की जांच के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है. हमारे अनुभव में, इस प्रोटोकॉल ने 90% से अधिक समय में सौम्य गैस्ट्रिक म्यूकोसा की बायोप्सी से सफलतापूर्वक ऑर्गेनोइड उत्पन्न किए हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास कोई प्रासंगिक खुलासा नहीं है।
Acknowledgments
यूनिवर्सिटी ऑफ पेंसिल्वेनिया जीनोमिक मेडिसिन T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK) के लिए Basser Center में पुरुष और BRCA कार्यक्रम।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
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