Summary
Gli organoidi derivati da pazienti gastrici trovano un uso crescente nella ricerca, ma mancano protocolli formali per la generazione di organoidi gastrici umani da digest a singola cellula con densità di semina standardizzata. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per creare in modo affidabile organoidi gastrici da tessuto bioptico ottenuto durante l'endoscopia superiore.
Abstract
Gli organoidi gastrici derivati da pazienti (PDO) offrono uno strumento unico per lo studio della biologia e della patologia gastrica. Di conseguenza, questi DOP trovano un uso crescente in un'ampia gamma di applicazioni di ricerca. Tuttavia, esiste una carenza di approcci pubblicati per la produzione di PDO gastrici da digest di singole cellule, mantenendo una densità di semina cellulare iniziale standardizzata. In questo protocollo, l'enfasi è posta sull'inizio di organoidi gastrici da singole cellule isolate e sulla fornitura di un metodo per il passaggio di organoidi attraverso la frammentazione. È importante sottolineare che il protocollo dimostra che un approccio standardizzato alla densità iniziale di semina cellulare produce costantemente organoidi gastrici da tessuto bioptico benigno e consente una quantificazione standardizzata della crescita degli organoidi. Infine, l'evidenza supporta la nuova osservazione che i PDO gastrici mostrano tassi variabili di formazione e crescita in base al fatto che gli organoidi provengano da biopsie del corpo o dalle regioni antrali dello stomaco. In particolare, è stato rivelato che l'uso del tessuto della biopsia antrale per l'inizio dell'organoide si traduce in un maggior numero di organoidi formati e in una crescita più rapida degli organoidi in un periodo di 20 giorni rispetto agli organoidi generati dalle biopsie del corpo gastrico. Il protocollo qui descritto offre ai ricercatori un metodo tempestivo e riproducibile per generare e lavorare con successo con i PDO gastrici.
Introduction
Gli organoidi sono strutture cellulari tridimensionali (3D) in miniatura che assomigliano all'architettura e alla funzionalità degli organi da cui sono stati derivati 1,2. Questi modelli coltivati in laboratorio sono creati coltivando cellule staminali o cellule tessuto-specifiche in un ambiente controllato che consente a queste cellule di auto-organizzarsi e differenziarsi in vari tipi di cellule 1,2,3. Uno dei principali vantaggi degli organoidi è la loro capacità di ricapitolare la biologia umana in modo più accurato rispetto alle tradizionali colture cellulari bidimensionali (2D) 1,2,3. In particolare, è stato dimostrato che gli organoidi umani mantengono la diversità genetica del loro tessuto di origine 3,4,5. Gli organoidi offrono un'opportunità unica per studiare lo sviluppo degli organi umani, modellare le malattie e testare potenziali terapie in un ambiente di laboratorio controllato. Inoltre, gli organoidi possono essere derivati da campioni di singoli pazienti, consentendo approcci di medicina personalizzata e il potenziale sviluppo di trattamenti individualizzati 3,6,7.
I ricercatori hanno utilizzato organoidi gastrici umani per studiare vari aspetti della biologia e della patologia gastrica. Esempi importanti includono l'uso di organoidi derivati da pazienti (PDO) per prevedere le risposte alla chemioterapia del cancro gastrico 8,9,10 e modellare la risposta epiteliale all'infezione da Helicobacter pylori 11,12,13. Gli organoidi gastrici umani sono costituiti da vari tipi di cellule presenti nello stomaco, tra cui cellule del collo, cellule della fossa e altre cellule di supporto11,14. Gli organoidi gastrici possono essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) o da cellule staminali direttamente isolate dal tessuto gastrico ottenuto tramite biopsie o da campioni di resezione gastrica11,14. L'isolamento delle cellule staminali gastriche dal tessuto gastrico viene comunemente effettuato isolando e colturando le ghiandole gastriche o digerendo enzimaticamente campioni di tessuto per liberare singole cellule 9,13,15. È importante sottolineare che la differenziazione delle cellule all'interno degli organoidi gastrici generati utilizzando una di queste tecniche ha dimostrato di essere simile13. Il protocollo qui descritto si concentra su un digest a singola cellula.
Gli organoidi rappresentano un'innovazione scientifica che colma il divario tra la coltura cellulare tradizionale e gli organi interi. Man mano che la ricerca in questo campo continua a progredire, gli organoidi sono pronti a contribuire allo sviluppo di trattamenti e terapie più efficaci per un'ampia gamma di applicazioni. Dato il crescente utilizzo di PDO gastriche, c'è una tempestiva necessità di un approccio standardizzato alla loro generazione. Qui viene descritto il protocollo per la generazione di PDO gastrici umane da singole cellule isolate da tessuto bioptico gastrico benigno acquisito durante l'endoscopia superiore. È importante sottolineare che viene determinato un numero standardizzato di singole cellule per la semina per generare in modo affidabile PDO gastrici e consentire la successiva caratterizzazione. Utilizzando questa tecnica, vengono dimostrate differenze affidabili nella formazione e nella crescita degli organoidi generati dalle biopsie del corpo gastrico o dell'antro gastrico.
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Protocol
Tutto il tessuto umano utilizzato in questo protocollo è stato raccolto da individui che hanno fornito il consenso informato per la raccolta di tessuti attraverso uno studio di raccolta di tessuto gastrico approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della Pennsylvania (IRB #842961). Ai partecipanti a questo studio è stato richiesto di sottoporsi a un'endoscopia superiore come parte delle loro cure di routine, di avere almeno 18 anni ed essere in grado di fornire il consenso informato. Tutte le ricerche condotte hanno aderito alle linee guida stabilite dall'Università della Pennsylvania.
1. Preparazione sperimentale
- Preparare il supporto L-WRN condizionato come descritto in precedenza16. Sebbene non sia obbligatorio, le concentrazioni di Wnt-3A, R-spondina e noggin contenute nei terreni condizionati possono essere controllate utilizzando un kit ELISA disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Preparare gli antibiotici RPMI (RPMI-ABX), gli antibiotici PBS (PBS-ABX), il pbs-ditiotreitolo (PBS-DTT), il tampone di digestione e i terreni organoidi gastrici (vedere la Tabella supplementare 1 per la composizione dettagliata). I terreni organoidi gastrici sono stabili per 1 settimana a 4 °C.
- Pinze per autoclave, forbici per dissezione fine e provette da 1,5 ml.
- Iniziare a scongelare la matrice della membrana basale (Matrigel) sul ghiaccio.
- Iniziare a scongelare il tampone di digestione e la tripsina-EDTA a bagnomaria a 37 °C.
- Impostare un agitatore orbitale dell'incubatrice a 37 °C e 200 giri/min.
2. Isolare singole cellule dal tessuto bioptico
- Raccogliere biopsie gastriche durante un'endoscopia superiore17 seguendo il protocollo clinico istituzionale, che probabilmente prevede l'uso di pinze jumbo. Utilizzare un ago con punta smussata per estrarre campioni di tessuto dalla pinza e posizionarli in una provetta conica da 15 mL contenente terreni RPMI-ABX. Tenere la provetta sul ghiaccio per un rapido trasferimento in laboratorio.
NOTA: Devono essere raccolte almeno 2-4 biopsie. - Lasciare che il tessuto bioptico si depositi sul fondo del tubo conico. Utilizzare una pipetta per aspirare il terreno e lavare le biopsie due volte con 1 mL di tampone PBS-ABX. Non c'è bisogno di centrifugazione, poiché i pezzi di tessuto si depositano naturalmente nel tubo conico.
- Trasferire un minimo di 20 mg di tessuto bioptico in una provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di PBS-DTT.
- Utilizzare forbici per dissezione fine per tagliare il tessuto in pezzi di 1-2 mm o più piccoli.
- Utilizzare una minicentrifuga da tavolo per 15 secondi per aggregare i pezzi di tessuto sul fondo della provetta e aspirare quanto più surnatante possibile. Un piccolo volume residuo di PBS-DTT è accettabile.
- Aggiungere 5 ml di tampone di digestione appena riscaldato in una provetta conica da 50 ml. Per trasferire i piccoli pezzi di tessuto senza perdere tessuto, prelevare 500 μL di tampone di digestione e aggiungerlo alla provetta da 1,5 mL contenente il tessuto. Successivamente, modificare il puntale di un puntale per pipette da 1000 μL con le forbici per aumentare il diametro del puntale, consentendo una facile aspirazione e trasferimento dei pezzi di tessuto nella provetta conica da 50 mL contenente il tampone di digestione.
- Incubare il tampone di digestione e la miscela tissutale a 37 °C per 30 minuti con agitazione orbitale a 200 giri/min.
- Aggiungere 5 mL di tripsina riscaldata con EDTA allo 0,25% al tampone di digestione e incubare per altri 10 minuti a 37 °C con agitazione orbitale a 200 giri/min.
- Neutralizzare il tampone di digestione e la tripsina aggiungendo un volume uguale di terreno DMEM/F12 avanzato (Adv.) e far passare la soluzione attraverso un colino cellulare da 70 μm.
- Pellet le cellule mediante centrifugazione a 1400 x g per 4 min a 4 °C. A seconda delle dimensioni iniziali del tessuto bioptico, un pellet di piccole cellule può essere visibile o meno.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno Adv. DMEM/F12 e contare il numero di cellule vitali utilizzando Trypan Blue e un emocitometro.
- Pellettare nuovamente le cellule mediante centrifugazione a 1400 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.
NOTA: La Figura 1 presenta una rappresentazione schematica del processo di isolamento di singole cellule dal tessuto bioptico.
3. Inclusione di singole cellule in una "cupola" di matrice di membrana basale
- Sulla base del numero contato di cellule vitali, calcolare il volume di matrice di membrana basale necessario per ottenere una concentrazione finale di 105 cellule vitali per 50 μL di matrice di membrana basale.
- Eseguire rapidamente le seguenti operazioni per evitare che la matrice della membrana basale si polimerizzi prima della placcatura. Rimuovere la matrice di membrana basale scongelata dal ghiaccio, aggiungere alle cellule il volume di matrice di membrana basale precedentemente calcolato e mescolare delicatamente pipettando su e giù per circa 10 secondi.
NOTA: È fondamentale evitare di creare bolle durante questa fase. Non diluire la matrice della membrana basale. - Pipettare rapidamente aliquote da 50 μL della miscela matrice/cellula della membrana basale al centro dei singoli pozzetti in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.
- Coprire immediatamente la piastra a 24 pozzetti e, con un unico movimento fluido, capovolgere la piastra. Posizionare la piastra rovesciata in un incubatore per colture tissutali a 37 °C per 35 minuti per consentire la polimerizzazione della matrice della membrana basale.
NOTA: L'inversione della piastra è essenziale per evitare che le cellule affondino sul fondo della piastra e per consentire alla matrice della membrana basale di polimerizzare in una forma "a cupola" 3D. - Aggiungere 500 μL di terreno organoide gastrico preriscaldato a ciascun pozzetto, assicurandosi che la parte superiore di ciascuna "cupola" sia completamente immersa nel terreno. Erogare il materiale lungo il lato di ciascun pozzetto per evitare di disturbare la "cupola".
- Cambiare il supporto ogni 2-3 giorni.
4. Passaggio di routine di organoidi per frammentazione
- Una volta che gli organoidi sono pronti per il passaggio, rimuovere il terreno da ogni pozzetto designato.
NOTA: Per determinare il tempo appropriato per il passaggio, fare riferimento alla sezione Risultati rappresentativi. - Erogare 1 mL di terreno di trattamento DMEM/F12 ghiacciato direttamente su una "cupola" a matrice di membrana basale. Questo dovrebbe prontamente avviare la rottura della "cupola". Continuare ad aspirare ed erogare fino a quando tutti i frammenti della "cupola" si staccano dalla piastra.
- Trasportare sia il terreno che la matrice frammentata della membrana basale al pozzetto successivo, ripetendo questo processo per tutti i pozzetti previsti per il passaggio. Dopo aver smontato la "cupola" finale della matrice della membrana basale, erogare il terreno e la miscela di organoidi e matrice della membrana basale in una provetta da 1,5 mL.
- Collegare un puntale da 1000 μL a una pipetta P1000, quindi inserirlo in un puntale da 200 μL. In questo modo si creerà un puntale della pipetta con un diametro sufficientemente piccolo da frammentare gli organoidi, pur consentendo l'aspirazione di un volume maggiore.
- Pipettare vigorosamente la miscela di organoidi e matrice di membrana basale su e giù circa 25 volte per frammentare gli organoidi in piccoli pezzi.
- Centrifugare la miscela di organoidi frammentata utilizzando una centrifuga da tavolo a 4 °C per 30 s a 2000 x g. Ciò si tradurrà in un pellet di organoidi frammentati separati dalla matrice di membrana basale e dai terreni. Utilizzare una pipetta per aspirare il terreno e il surnatante della matrice della membrana basale. Non utilizzare il vuoto per aspirare il surnatante, poiché il pellet è sciolto.
- Calcolare il volume della matrice di membrana basale appena scongelata necessaria in modo che il numero di pozzetti/cupole sia suddiviso in un rapporto 1:2 (50 μL/cupola). Aggiungere la matrice di membrana basale fresca e pipettare delicatamente su e giù per mescolare, facendo attenzione a non creare bolle.
- Aliquotare rapidamente 50 μL della miscela di frammenti di organoidi e matrice di membrana basale in singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
- Coprire la piastra, capovolgerla e posizionarla in un incubatore per colture tissutali a 37 °C per 35 minuti per consentire la polimerizzazione della matrice della membrana basale.
- Aggiungere 500 μL di terreno organoide gastrico preriscaldato a ciascun pozzetto.
NOTA: La Figura 2 presenta una panoramica schematica del passaggio di organoidi gastrici derivati da pazienti attraverso la frammentazione.
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Representative Results
I successivi risultati rappresentativi derivano da biopsie prelevate dall'epitelio benigno sia del corpo gastrico che dell'antro gastrico dello stomaco di cinque diversi pazienti sottoposti a endoscopia superiore. Da due a quattro "cupole"/pozzetti sono stati placcati e analizzati per paziente sia per le biopsie del corpo gastrico che per quelle dell'antro. Gli organoidi sono stati generati con successo dal corpo gastrico e dal tessuto bioptico dell'antro gastrico di tutti e cinque i pazienti. In media, sono stati analizzati 41 organoidi per "cupola"/pozzetto. Tutte le immagini sono proiezioni z acquisite utilizzando un microscopio confocale e la quantificazione delle dimensioni e della sfericità degli organoidi è stata eseguita utilizzando un software di analisi delle immagini disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).
Gli organoidi sono generalmente identificabili entro 10 giorni dalla semina delle singole cellule (Figura 3A). Entro il 20° giorno, gli organoidi sono grandi e in genere devono essere attraversati. Mentre il numero di organoidi che si formano dopo la semina di una singola cellula può essere in qualche modo variabile, i risultati attesi per il numero di organoidi formati da biopsie gastriche del corpo e antrali sono mostrati nella Figura 3B. Il numero di organoidi corporei e antrali raggiunge il picco al giorno 10 dopo la semina. Sebbene non sia significativo, il numero totale di organoidi inizia a diminuire dal giorno 10 al giorno 15 e dal giorno 15 al giorno 20. Sembra esserci una sottopopolazione di piccoli organoidi che si formano entro il giorno 10 e poi cessano la crescita e muoiono nei 10 giorni successivi, il che spiegherebbe questa tendenza. È importante sottolineare che è stato dimostrato che il numero di organoidi formati dal tessuto della biopsia antrale è significativamente superiore al tessuto bioptico del corpo ai giorni 10, 15 e 20. Il numero di organoidi antrali formati era in media 2 volte superiore al numero di organoidi formati dal corpo.
Nella Figura 3C, sono mostrati i risultati rappresentativi per la crescita degli organoidi dopo la semina di una singola cellula tra il giorno 10 e il giorno 20. Mentre gli organoidi provenienti da biopsie antrali e corporee hanno visto una crescita costante dal giorno 10 al giorno 20, gli organoidi generati dal tessuto della biopsia antrale hanno mostrato un tasso di crescita maggiore rispetto agli organoidi generati dal tessuto bioptico del corpo. In particolare, gli organoidi antrali avevano un'area quasi 4 volte maggiore rispetto agli organoidi corporei al giorno 20.
In diversi pazienti, si osserva tipicamente una diversità di morfologia degli organoidi in ogni singola "cupola"/pozzetto (Figura 4A). Alcuni organoidi sono più rotondi o sferici, mentre altri mostrano una morfologia più irregolare. Tuttavia, in media, la sfericità, una misura di quanto sia sferico un organoide (dove un punteggio di 1 = una sfera perfetta)18, ha mostrato poche variazioni all'interno e tra gli organoidi generati dal corpo o dal tessuto della biopsia antrale (Figura 4B). Pertanto, sebbene ci siano diversi tassi di crescita, in genere non ci sono differenze morfologiche significative tra gli organoidi generati dal tessuto bioptico del corpo gastrico o dell'antro.
Entro il 20° giorno dopo l'iniziazione, gli organoidi gastrici sono in genere pronti per essere passati. Un organoide di grandi dimensioni (≥1500 μm di diametro) o un interno scuro (indicativo di un ampio turnover cellulare) dell'organoide sono segni chiave che gli organoidi devono essere attraversati (Figura 5A). Gli organoidi lasciati andare oltre questo punto possono iniziare a scomporsi in monostrati 2D (Figura 5B) che non si riformano in modo affidabile dopo il passaggio, forse indicando una perdita di vitalità o staminalità. Dopo aver passato e riseminato gli organoidi gastrici utilizzando il protocollo di frammentazione qui descritto, le "cupole" conterranno molti frammenti di organoidi (Figura 5C) che si riorganizzeranno in molti più organoidi e cresceranno molto più rapidamente rispetto alla semina iniziale di singole cellule (Figura 5D). Se la crescita degli organoidi necessita ancora di caratterizzazione e/o standardizzazione al momento del passaggio, gli organoidi gastrici possono invece essere digeriti in singole cellule, come descritto in precedenza19.
Figura 1: Generazione di organoidi gastrici derivati dal paziente. Panoramica schematica che illustra il processo di generazione di organoidi gastrici derivati da pazienti da biopsie di epitelio gastrico benigno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Passaggio di organoidi derivati da pazienti gastrici. Panoramica schematica che illustra il passaggio di organoidi gastrici derivati da pazienti attraverso la frammentazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Formazione e crescita di organoidi gastrici derivati dal paziente. (A) Immagini rappresentative della proiezione z che mostrano la crescita degli organoidi gastrici al giorno 10, 15 e 20 dopo la semina di una singola cellula. Le immagini sono di organoidi generati dal tessuto bioptico del corpo gastrico e dell'antro dello stesso paziente. Barra della scala = 1 mm. (B) Numero medio (±DS) di organoidi del corpo gastrico e dell'antro nei punti temporali indicati dopo la semina a singola cellula. (C) Area media (±SD) (μm2) degli organoidi del corpo gastrico e dell'antro nei punti temporali indicati dopo la semina a singola cellula. n = 5 pazienti per gruppo e punto temporale. * = differenza statisticamente significativa (p ≤ 0,05) nel punto temporale indicato. n.s. = nessuna differenza statisticamente significativa nel punto temporale indicato. Confronti statistici condotti tramite ANOVA a 2 vie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Morfologia degli organoidi derivati dal paziente gastrico. (A) Immagini rappresentative della proiezione z di diverse morfologie di organoidi gastrici da una singola "cupola"/pozzetto di organoidi derivati dal corpo gastrico al giorno 15 dopo la semina a cellula singola. Barra della scala = 200 μm. (B) Sfericità media (±SD) del corpo gastrico e dell'organoide dell'antro (dove un valore di 1 = una sfera perfetta). n = 5 pazienti per gruppo e punto temporale. n.s. = nessuna differenza statisticamente significativa in nessun punto temporale. Confronti statistici condotti tramite ANOVA a 2 vie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Passaggio di organoidi gastrici derivati dal paziente. (A) Immagine rappresentativa di organoidi pronti per essere sottoposti a passaggio al giorno 20 dopo la semina a singola cellula. (B) Immagine rappresentativa degli organoidi in ritardo per il passaggio al giorno 25 dopo la semina a singola cellula. (C) Immagine rappresentativa di organoidi frammentati dopo la risemina (Passaggio 1 - Giorno 0). (D) Immagine rappresentativa della crescita degli organoidi nell'arco di 5 giorni dopo la risemina (Passaggio 1 - Giorno 5). Tutte le immagini sono proiezioni z. Barre di scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella supplementare 1: Soluzioni e ricette dei terreni. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
In questo documento, viene delineato un protocollo dettagliato per generare in modo affidabile organoidi gastrici umani da singole cellule isolate da biopsie di epitelio benigno dal corpo gastrico e dall'antro. Le fasi critiche del protocollo ruotano attorno alla temporizzazione e alla gestione della matrice di membrana basale. Per preservare la vitalità, è essenziale avviare il protocollo il prima possibile dopo l'acquisizione del tessuto bioptico. L'obiettivo è quello di iniziare a digerire il tessuto bioptico entro 30 minuti dall'esecuzione della biopsia. Anche la gestione della matrice della membrana basale può essere impegnativa. Quando viene scongelato sul ghiaccio, rimane un liquido; tuttavia, a temperature superiori a 4 °C, polimerizza. Pertanto, il trasferimento rapido della matrice della membrana basale dal ghiaccio alla miscelazione con singole cellule o frammenti di organoidi per la placcatura di "cupole" deve essere eseguito tempestivamente, poiché inizia a polimerizzare entro un minuto. Una volta polimerizzato in una provetta, non può essere aspirato in un puntale di pipetta. In tal caso, il tubo può essere posto sul ghiaccio fino a quando il Matrigel non si depolimerizza di nuovo in un liquido. Quando si esegue delicatamente il pipettaggio su e giù per mescolare singole cellule o frammenti di organoidi con la matrice della membrana basale, è anche fondamentale evitare la creazione di bolle. Mentre le bolle in una "cupola" della matrice di membrana basale non sembrano ostacolare la formazione e la crescita degli organoidi, possono ostruire la visualizzazione. Inoltre, dopo aver aliquotato la miscela matrice/cellula della membrana basale nel pozzetto o nei pozzetti di una piastra di coltura cellulare, la piastra deve essere capovolta e posta in un incubatore. Questo passaggio è fondamentale per consentire alla matrice di membrana basale di polimerizzare in una forma "a cupola" 3D e impedire alle singole cellule o ai frammenti di organoidi di affondare sul fondo della piastra.
Utilizzando questo protocollo, gli organoidi gastrici possono essere identificati entro 10 giorni dalla semina di una singola cellula. L'esperienza mostra che pochissimi nuovi organoidi gastrici si formano oltre il giorno 10 e, in effetti, il numero complessivo di organoidi può diminuire leggermente dal giorno 10-20. Questo è vero per gli organoidi generati sia dal corpo gastrico che dall'antro. Tuttavia, il numero totale di organoidi formati dalle biopsie antrali gastriche è significativamente superiore a quello delle biopsie gastriche del corpo. Inoltre, la crescita degli organoidi antrali supera di gran lunga gli organoidi del corpo tra i giorni 10-20 dopo la semina di una singola cellula. Questa differenza può essere attribuita a variazioni nella sensibilità Wnt. Uno studio recente ha dimostrato che i PDO del corpo gastrico mostrano una crescita migliore con una minore attivazione di Wnt, mentre i PDO dell'antro gastrico prosperano con una maggiore attivazione di Wnt20. La posizione delle biopsie gastriche utilizzate per generare PDO gastriche non è tipicamente specificata in letteratura. Tali differenze dovrebbero essere prese in considerazione in studi futuri che utilizzino PDO gastrici generate da biopsie gastriche di diverse aree dello stomaco.
Un altro aspetto cruciale di questo protocollo è la creazione di un numero standardizzato di singole cellule da seminare per "cupola"/pozzetto per generare in modo affidabile PDO gastrici. Mentre uno studio precedente riportava un numero standardizzato di ghiandole gastriche da seminare per la generazione di DOP, nessuno studio precedente che utilizzava un metodo di digestione a singola cellula ha menzionato il numero di cellule seminate o se il numero era coerente tra le diverse linee di DOP. La mancata standardizzazione del numero di cellule seminate può comportare la semina di un numero molto variabile di cellule staminali per "cupola"/pozzetto. Poiché le cellule staminali sono la fonte primaria di formazione di organoidi gastrici, ciò potrebbe portare a tassi variabili di formazione e crescita di organoidi. Pertanto, l'utilizzo di un numero non standardizzato di singole cellule potrebbe confondere le interpretazioni dei confronti di formazione o crescita tra diverse linee di PDO gastrico. Qui, è dimostrato che la standardizzazione del numero di cellule seminate a10-5 cellule per "cupola"/pozzetto genera in modo affidabile PDO gastrici da biopsie sia del corpo che delle regioni antrali dello stomaco.
Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso di tessuto fresco per biopsia gastrica. Di conseguenza, il successo di questo protocollo può variare quando si utilizzano tessuti congelati o conservati con altri mezzi. Inoltre, non ci sono dati su quanto a lungo le biopsie fresche mantengano la vitalità, poiché il tessuto bioptico viene processato il prima possibile dopo la rimozione dallo stomaco di un paziente. Presumibilmente, più a lungo il tessuto fresco rimane prima della lavorazione, meno cellule vitali verranno isolate.
Il passaggio di PDO gastrici tramite frammentazione, come descritto in questo protocollo, fornisce un metodo semplice per il passaggio di routine. Mentre i PDO gastrici sono stati passati con successo fino a 4 volte utilizzando questa tecnica, non ci sono stati tentativi di determinare quante volte possono essere passati mantenendo una crescita e una vitalità costanti. Alcuni rapporti indicano che la crescita degli organoidi gastrici può rallentare dopo 5 o più passaggi21,22, mentre altri hanno osservato una crescita affidabile fino a 10 passaggi23.
Il terreno organoide gastrico utilizzato in questo protocollo contiene Wnt-3A, noggin e R-spondina derivati da terreni condizionati di cellule L-WRN. Per produrre i mezzi condizionati, viene utilizzato un protocollo descritto da Miyoshi e Stappenbeck16. In alternativa, Wnt-3A, noggin e R-spondina possono essere acquistati separatamente come proteine ricombinanti. L'acquisto separato dei singoli componenti è l'ideale per evitare potenziali effetti batch che possono verificarsi quando si utilizzano terreni condizionati da celle L-WRN. Tuttavia, l'acquisto delle proteine ricombinanti è costoso e può essere proibitivo per i ricercatori che lavorano spesso con gli organoidi.
Dato il crescente uso di PDO gastrici in varie applicazioni, è opportuno e necessario stabilire approcci standardizzati per la generazione di PDO gastriche benigne. Il protocollo qui descritto offre un metodo affidabile per le indagini future che utilizzano PDO gastriche. Nella nostra esperienza, questo protocollo ha generato con successo organoidi da biopsie di mucosa gastrica benigna oltre il 90% delle volte.
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Disclosures
Gli autori non hanno divulgazioni rilevanti.
Acknowledgments
Università della Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & BRCA Program presso il Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
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