Gli organoidi derivati da pazienti gastrici trovano un uso crescente nella ricerca, ma mancano protocolli formali per la generazione di organoidi gastrici umani da digest a singola cellula con densità di semina standardizzata. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per creare in modo affidabile organoidi gastrici da tessuto bioptico ottenuto durante l'endoscopia superiore.
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Articolo metodologico
Costituzione e caratterizzazione di organoidi gastrici derivati da pazienti da biopsie del corpo gastrico benigno e dell'epitelio antrale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi gastrici derivati da pazienti (PDO) offrono uno strumento unico per lo studio della biologia e della patologia gastrica. Di conseguenza, questi DOP trovano un uso crescente in un'ampia gamma di applicazioni di ricerca. Tuttavia, esiste una carenza di approcci pubblicati per la produzione di PDO gastrici da digest di singole cellule, mantenendo una densità di semina cellulare iniziale standardizzata. In questo protocollo, l'enfasi è posta sull'inizio di organoidi gastrici da singole cellule isolate e sulla fornitura di un metodo per il passaggio di organoidi attraverso la frammentazione. È importante sottolineare che il protocollo dimostra che un approccio standardizzato alla densità iniziale di semina cellulare produce costantemente organoidi gastrici da tessuto bioptico benigno e consente una quantificazione standardizzata della crescita degli organoidi. Infine, l'evidenza supporta la nuova osservazione che i PDO gastrici mostrano tassi variabili di formazione e crescita in base al fatto che gli organoidi provengano da biopsie del corpo o dalle regioni antrali dello stomaco. In particolare, è stato rivelato che l'uso del tessuto della biopsia antrale per l'inizio dell'organoide si traduce in un maggior numero di organoidi formati e in una crescita più rapida degli organoidi in un periodo di 20 giorni rispetto agli organoidi generati dalle biopsie del corpo gastrico. Il protocollo qui descritto offre ai ricercatori un metodo tempestivo e riproducibile per generare e lavorare con successo con i PDO gastrici.
Introduzione
Gli organoidi sono strutture cellulari tridimensionali (3D) in miniatura che assomigliano all'architettura e alla funzionalità degli organi da cui sono stati derivati 1,2. Questi modelli coltivati in laboratorio sono creati coltivando cellule staminali o cellule tessuto-specifiche in un ambiente controllato che consente a queste cellule di auto-organizzarsi e differenziarsi in vari tipi di cellule 1,2,3. Uno dei principali vantaggi degli organoidi è la loro capacità di ricapitolare la biologia umana in modo più accurato rispetto alle tradizionali colture cellulari bidimensionali (2D) 1,2,3. In particolare, è stato dimostrato che gli organoidi umani mantengono la diversità genetica del loro tessuto di origine 3,4,5. Gli organoidi offrono un'opportunità unica per studiare lo sviluppo degli organi umani, modellare le malattie e testare potenziali terapie in un ambiente di laboratorio controllato. Inoltre, gli organoidi possono essere derivati da campioni di singoli pazienti, consentendo approcci di medicina personalizzata e il potenziale sviluppo di trattamenti individualizzati 3,6,7.
I ricercatori hanno utilizzato organoidi gastrici umani per studiare vari aspetti della biologia e della patologia gastrica. Esempi importanti includono l'uso di organoidi derivati da pazienti (PDO) per prevedere le risposte alla chemioterapia del cancro gastrico 8,9,10 e modellare la risposta epiteliale all'infezione da Helicobacter pylori 11,12,13. Gli organoidi gastrici umani sono costituiti da vari tipi di cellule presenti nello stomaco, tra cui cellule del collo, cellule della fossa e altre cellule di supporto11,14. Gli organoidi gastrici possono essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) o da cellule staminali direttamente isolate dal tessuto gastrico ottenuto tramite biopsie o da campioni di resezione gastrica11,14. L'isolamento delle cellule staminali gastriche dal tessuto gastrico viene comunemente effettuato isolando e colturando le ghiandole gastriche o digerendo enzimaticamente campioni di tessuto per liberare singole cellule 9,13,15. È importante sottolineare che la differenziazione delle cellule all'interno degli organoidi gastrici generati utilizzando una di queste tecniche ha dimostrato di essere simile13. Il protocollo qui descritto si concentra su un digest a singola cellula.
Gli organoidi rappresentano un'innovazione scientifica che colma il divario tra la coltura cellulare tradizionale e gli organi interi. Man mano che la ricerca in questo campo continua a progredire, gli organoidi sono pronti a contribuire allo sviluppo di trattamenti e terapie più efficaci per un'ampia gamma di applicazioni. Dato il crescente utilizzo di PDO gastriche, c'è una tempestiva necessità di un approccio standardizzato alla loro generazione. Qui viene descritto il protocollo per la generazione di PDO gastrici umane da singole cellule isolate da tessuto bioptico gastrico benigno acquisito durante l'endoscopia superiore. È importante sottolineare che viene determinato un numero standardizzato di singole cellule per la semina per generare in modo affidabile PDO gastrici e consentire la successiva caratterizzazione. Utilizzando questa tecnica, vengono dimostrate differenze affidabili nella formazione e nella crescita degli organoidi generati dalle biopsie del corpo gastrico o dell'antro gastrico.
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Protocollo
Tutto il tessuto umano utilizzato in questo protocollo è stato raccolto da individui che hanno fornito il consenso informato per la raccolta di tessuti attraverso uno studio di raccolta di tessuto gastrico approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della Pennsylvania (IRB #842961). Ai partecipanti a questo studio è stato richiesto di sottoporsi a un'endoscopia superiore come parte delle loro cure di routine, di avere almeno 18 anni ed essere in grado di fornire il consenso informato. Tutte le ricerche condotte hanno aderito alle linee guida stabilite dall'Università della Pennsylvania.
1. Preparazione sperimentale
- Preparare il supporto L-WRN condizionato come descritto in precedenza16. Sebbene non sia obbligatorio, le concentrazioni di Wnt-3A, R-spondina e noggin contenute nei terreni condizionati possono essere controllate utilizzando un kit ELISA disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Preparare gli antibiotici RPMI (RPMI-ABX), gli antibiotici PBS (PBS-ABX), il pbs-ditiotreitolo (PBS-DTT), il tampone di digestione e i terreni organoidi gastrici (vedere la Tabella supplementare 1 per la composizione dettagliata). I terreni organoidi gastrici sono stabili per 1 settimana a 4 °C.
- Pinze per autoclave, forbici per dissezione fine e provette da 1,5 ml.
- Iniziare a scongelare la matrice della membrana basale (Matrigel) sul ghiaccio.
- Iniziare a scongelare il tampone di digestione e la tripsina-EDTA a bagnomaria a 37 °C.
- Impostare un agitatore orbitale dell'incubatrice a 37 °C e 200 giri/min.
2. Isolare singole cellule dal tessuto bioptico
- Raccogliere biopsie gastriche durante un'endoscopia superiore17 seguendo il protocollo clinico istituzionale, che probabilmente prevede l'uso di pinze jumbo. Utilizzare un ago con punta smussata per estrarre campioni di tessuto dalla pinza e posizionarli in una provetta conica da 15 mL contenente terreni RPMI-ABX. Tenere la provetta sul ghiaccio per un rapido trasferimento in laboratorio.
NOTA: Devono essere raccolte almeno 2-4 biopsie. - Lasciare che il tessuto bioptico si depositi sul fondo del tubo conico. Utilizzare una pipetta per aspirare il terreno e lavare le biopsie due volte con 1 mL di tampone PBS-ABX. Non c'è bisogno di centrifugazione, poiché i pezzi di tessuto si depositano naturalmente nel tubo conico.
- Trasferire un minimo di 20 mg di tessuto bioptico in una provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di PBS-DTT.
- Utilizzare forbici per dissezione fine per tagliare il tessuto in pezzi di 1-2 mm o più piccoli.
- Utilizzare una minicentrifuga da tavolo per 15 secondi per aggregare i pezzi di tessuto sul fondo della provetta e aspirare quanto più surnatante possibile. Un piccolo volume residuo di PBS-DTT è accettabile.
- Aggiungere 5 ml di tampone di digestione appena riscaldato in una provetta conica da 50 ml. Per trasferire i piccoli pezzi di tessuto senza perdere tessuto, prelevare 500 μL di tampone di digestione e aggiungerlo alla provetta da 1,5 mL contenente il tessuto. Successivamente, modificare il puntale di un puntale per pipette da 1000 μL con le forbici per aumentare il diametro del puntale, consentendo una facile aspirazione e trasferimento dei pezzi di tessuto nella provetta conica da 50 mL contenente il tampone di digestione.
- Incubare il tampone di digestione e la miscela tissutale a 37 °C per 30 minuti con agitazione orbitale a 200 giri/min.
- Aggiungere 5 mL di tripsina riscaldata con EDTA allo 0,25% al tampone di digestione e incubare per altri 10 minuti a 37 °C con agitazione orbitale a 200 giri/min.
- Neutralizzare il tampone di digestione e la tripsina aggiungendo un volume uguale di terreno DMEM/F12 avanzato (Adv.) e far passare la soluzione attraverso un colino cellulare da 70 μm.
- Pellet le cellule mediante centrifugazione a 1400 x g per 4 min a 4 °C. A seconda delle dimensioni iniziali del tessuto bioptico, un pellet di piccole cellule può essere visibile o meno.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno Adv. DMEM/F12 e contare il numero di cellule vitali utilizzando Trypan Blue e un emocitometro.
- Pellettare nuovamente le cellule mediante centrifugazione a 1400 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.
NOTA: La Figura 1 presenta una rappresentazione schematica del processo di isolamento di singole cellule dal tessuto bioptico.
3. Inclusione di singole cellule in una "cupola" di matrice di membrana basale
- Sulla base del numero contato di cellule vitali, calcolare il volume di matrice di membrana basale necessario per ottenere una concentrazione finale di 105 cellule vitali per 50 μL di matrice di membrana basale.
- Eseguire rapidamente le seguenti operazioni per evitare che la matrice della membrana basale si polimerizzi prima della placcatura. Rimuovere la matrice di membrana basale scongelata dal ghiaccio, aggiungere alle cellule il volume di matrice di membrana basale precedentemente calcolato e mescolare delicatamente pipettando su e giù per circa 10 secondi.
NOTA: È fondamentale evitare di creare bolle durante questa fase. Non diluire la matrice della membrana basale. - Pipettare rapidamente aliquote da 50 μL della miscela matrice/cellula della membrana basale al centro dei singoli pozzetti in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.
- Coprire immediatamente la piastra a 24 pozzetti e, con un unico movimento fluido, capovolgere la piastra. Posizionare la piastra rovesciata in un incubatore per colture tissutali a 37 °C per 35 minuti per consentire la polimerizzazione della matrice della membrana basale.
NOTA: L'inversione della piastra è essenziale per evitare che le cellule affondino sul fondo della piastra e per consentire alla matrice della membrana basale di polimerizzare in una forma "a cupola" 3D. - Aggiungere 500 μL di terreno organoide gastrico preriscaldato a ciascun pozzetto, assicurandosi che la parte superiore di ciascuna "cupola" sia completamente immersa nel terreno. Erogare il materiale lungo il lato di ciascun pozzetto per evitare di disturbare la "cupola".
- Cambiare il supporto ogni 2-3 giorni.
4. Passaggio di routine di organoidi per frammentazione
- Una volta che gli organoidi sono pronti per il passaggio, rimuovere il terreno da ogni pozzetto designato.
NOTA: Per determinare il tempo appropriato per il passaggio, fare riferimento alla sezione Risultati rappresentativi. - Erogare 1 mL di terreno di trattamento DMEM/F12 ghiacciato direttamente su una "cupola" a matrice di membrana basale. Questo dovrebbe prontamente avviare la rottura della "cupola". Continuare ad aspirare ed erogare fino a quando tutti i frammenti della "cupola" si staccano dalla piastra.
- Trasportare sia il terreno che la matrice frammentata della membrana basale al pozzetto successivo, ripetendo questo processo per tutti i pozzetti previsti per il passaggio. Dopo aver smontato la "cupola" finale della matrice della membrana basale, erogare il terreno e la miscela di organoidi e matrice della membrana basale in una provetta da 1,5 mL.
- Collegare un puntale da 1000 μL a una pipetta P1000, quindi inserirlo in un puntale da 200 μL. In questo modo si creerà un puntale della pipetta con un diametro sufficientemente piccolo da frammentare gli organoidi, pur consentendo l'aspirazione di un volume maggiore.
- Pipettare vigorosamente la miscela di organoidi e matrice di membrana basale su e giù circa 25 volte per frammentare gli organoidi in piccoli pezzi.
- Centrifugare la miscela di organoidi frammentata utilizzando una centrifuga da tavolo a 4 °C per 30 s a 2000 x g. Ciò si tradurrà in un pellet di organoidi frammentati separati dalla matrice di membrana basale e dai terreni. Utilizzare una pipetta per aspirare il terreno e il surnatante della matrice della membrana basale. Non utilizzare il vuoto per aspirare il surnatante, poiché il pellet è sciolto.
- Calcolare il volume della matrice di membrana basale appena scongelata necessaria in modo che il numero di pozzetti/cupole sia suddiviso in un rapporto 1:2 (50 μL/cupola). Aggiungere la matrice di membrana basale fresca e pipettare delicatamente su e giù per mescolare, facendo attenzione a non creare bolle.
- Aliquotare rapidamente 50 μL della miscela di frammenti di organoidi e matrice di membrana basale in singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
- Coprire la piastra, capovolgerla e posizionarla in un incubatore per colture tissutali a 37 °C per 35 minuti per consentire la polimerizzazione della matrice della membrana basale.
- Aggiungere 500 μL di terreno organoide gastrico preriscaldato a ciascun pozzetto.
NOTA: La Figura 2 presenta una panoramica schematica del passaggio di organoidi gastrici derivati da pazienti attraverso la frammentazione.
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Risultati
I successivi risultati rappresentativi derivano da biopsie prelevate dall'epitelio benigno sia del corpo gastrico che dell'antro gastrico dello stomaco di cinque diversi pazienti sottoposti a endoscopia superiore. Da due a quattro "cupole"/pozzetti sono stati placcati e analizzati per paziente sia per le biopsie del corpo gastrico che per quelle dell'antro. Gli organoidi sono stati generati con successo dal corpo gastrico e dal tessuto bioptico dell'antro gastrico di tutti e cinque i pazienti. In media, sono stati analiz...
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Discussione
In questo documento, viene delineato un protocollo dettagliato per generare in modo affidabile organoidi gastrici umani da singole cellule isolate da biopsie di epitelio benigno dal corpo gastrico e dall'antro. Le fasi critiche del protocollo ruotano attorno alla temporizzazione e alla gestione della matrice di membrana basale. Per preservare la vitalità, è essenziale avviare il protocollo il prima possibile dopo l'acquisizione del tessuto bioptico. L'obiettivo è quello di iniziare a digerire il tessuto bioptico entro 30...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni rilevanti.
Ringraziamenti
Università della Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & BRCA Program presso il Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R & D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amfotericina B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Ditiotreitolo (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicina | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Linea cellulare | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazolo | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Integratore | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Penna Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R& D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3A Kit ELISA | R& D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Riferimenti
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359(2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255(2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519(2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151(2023).
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