Summary
Gastrisk patientafledte organoider finder stigende anvendelse i forskning, men formelle protokoller til generering af humane gastriske organoider fra enkeltcellefordøjelser med standardiseret såtæthed mangler. Denne protokol præsenterer en detaljeret metode til pålideligt at skabe gastriske organoider fra biopsivæv opnået under øvre endoskopi.
Abstract
Gastrisk patientafledte organoider (PDO'er) tilbyder et unikt værktøj til at studere gastrisk biologi og patologi. Derfor finder disse BOB'er stigende anvendelse i en bred vifte af forskningsapplikationer. Der findes imidlertid mangel på offentliggjorte tilgange til fremstilling af gastriske BDO'er fra enkeltcellefordøjelser, samtidig med at der opretholdes en standardiseret indledende cellesåningstæthed. I denne protokol lægges der vægt på initiering af gastriske organoider fra isolerede enkeltceller og tilvejebringelse af en metode til overførsel af organoider gennem fragmentering. Det er vigtigt, at protokollen viser, at en standardiseret tilgang til den indledende cellesåningstæthed konsekvent giver gastriske organoider fra godartet biopsivæv og muliggør standardiseret kvantificering af organoidvækst. Endelig understøtter beviser den nye observation, at gastriske BDO'er viser varierende dannelses- og væksthastigheder baseret på, om organoiderne stammer fra biopsier i kroppen eller antrale områder i maven. Specifikt afsløres det, at brugen af antralbiopsivæv til organoidinitiering resulterer i et større antal dannede organoider og hurtigere organoidvækst over en 20-dages periode sammenlignet med organoider genereret fra biopsier i mavekroppen. Protokollen beskrevet heri tilbyder efterforskere en rettidig og reproducerbar metode til succesfuldt at generere og arbejde med gastriske BOB'er.
Introduction
Organoider er miniature tredimensionelle (3D) cellulære strukturer, der ligner arkitekturen og funktionaliteten af de organer, hvorfra de blev afledt 1,2. Disse laboratoriedyrkede modeller er skabt ved at dyrke stamceller eller vævsspecifikke celler i et kontrolleret miljø, der gør det muligt for disse celler at selvorganisere og differentiere sig til forskellige celletyper 1,2,3. En af de vigtigste fordele ved organoider er deres evne til at rekapitulere menneskelig biologi tættere end traditionelle todimensionelle (2D) cellekulturer 1,2,3. Især har humane organoider vist sig at opretholde den genetiske mangfoldighed af deres oprindelsesvæv 3,4,5. Organoider giver en unik mulighed for at studere menneskelig organudvikling, modellere sygdomme og teste potentielle behandlinger i en kontrolleret laboratorieindstilling. Desuden kan organoider udledes af individuelle patientprøver, hvilket muliggør personaliserede medicinmetoder og den potentielle udvikling af individualiserede behandlinger 3,6,7.
Forskere har brugt humane gastriske organoider til at undersøge forskellige aspekter af gastrisk biologi og patologi. Fremtrædende eksempler omfatter brugen af patientafledte organoider (PDO'er) til at forudsige gastrisk kræft kemoterapi respons 8,9,10 og model epitelresponset på Helicobacter pylori infektion 11,12,13. Humane gastriske organoider består af forskellige celletyper, der findes i maven, herunder nakkeceller, pitceller og andre støtteceller11,14. Gastriske organoider kan enten genereres fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) eller stamceller direkte isoleret fra gastrisk væv opnået via biopsier eller fra gastriske resektionsprøver11,14. Isolering af gastriske stamceller fra mavevæv udføres almindeligvis ved at isolere og dyrke mavekirtler eller enzymatisk fordøje vævsprøver for at frigøre enkeltceller 9,13,15. Det er vigtigt, at differentieringen af celler inden for gastriske organoider genereret ved hjælp af en af disse teknikker har vist sig at være ens13. Protokollen beskrevet heri fokuserer på en enkeltcellefordøjelse.
Organoider repræsenterer en videnskabelig innovation, der bygger bro mellem traditionel cellekultur og hele organer. Da forskningen på området fortsætter med at udvikle sig, er organoider klar til at bidrage til udviklingen af mere effektive behandlinger og terapier til en bred vifte af applikationer. I betragtning af den stigende udnyttelse af gastriske BDO'er er der et rettidigt behov for en standardiseret tilgang til deres generation. Her beskrives protokollen til generering af humane gastriske BDO'er fra enkeltceller isoleret fra godartet gastrisk biopsivæv erhvervet under øvre endoskopi. Det er vigtigt og unikt, at et standardiseret antal enkeltceller bestemmes til såning for pålideligt at generere gastriske BDO'er og muliggøre efterfølgende karakterisering. Ved hjælp af denne teknik demonstreres pålidelige forskelle i dannelsen og væksten af organoider genereret fra biopsier af enten mavekroppen eller gastrisk antrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt humant væv, der anvendes i denne protokol, blev indsamlet fra personer, der gav informeret samtykke til vævsindsamling gennem en gastrisk vævsindsamlingsundersøgelse godkendt af University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB # 842961). Deltagerne i denne undersøgelse skulle gennemgå en øvre endoskopi som en del af deres rutinemæssige pleje, være mindst 18 år gammel og være i stand til at give informeret samtykke. Al udført forskning overholdt retningslinjerne fra University of Pennsylvania.
1. Eksperimentel forberedelse
- Forbered konditionerede L-WRN-medier som tidligere beskrevet16. Selvom det ikke er obligatorisk, kan koncentrationerne af Wnt-3A, R-spondin og noggin indeholdt i de konditionerede medier kontrolleres ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt ELISA-sæt efter producentens anvisninger (se materialetabellen).
- Forbered RPMI-antibiotika (RPMI-ABX), PBS-antibiotika (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), fordøjelsesbuffer og gastrisk organoidmedier (se supplerende tabel 1 for detaljeret sammensætning). Gastrisk organoid media er stabil i 1 uge ved 4 °C.
- Autoklave tang, fin dissektion saks og 1,5 ml rør.
- Begynd at optø kældermembranmatrixen (Matrigel) på is.
- Optøningen af fordøjelsesbufferen og trypsin-EDTA påbegyndes i et 37 °C vandbad.
- Indstil en inkubatororbitalryster til 37 °C og 200 o / min.
2. Isolering af enkeltceller fra biopsivævet
- Indsamle gastriske biopsier under en øvre endoskopi17 efter den institutionelle kliniske protokol, sandsynligvis involverer brug af jumbo tang. Brug en stump nål til at udtrække vævsprøver fra tangen og læg dem i et 15 ml konisk rør indeholdende RPMI-ABX-medier. Hold røret på is for hurtig overførsel til laboratoriet.
BEMÆRK: Der skal som minimum indsamles 2-4 biopsier. - Lad biopsivævet sætte sig i bunden af det koniske rør. Brug en pipette til at aspirere mediet og vask biopsierne to gange med 1 ml PBS-ABX-buffer. Der er ikke behov for centrifugering, da vævsstykkerne sætter sig naturligt i det koniske rør.
- Overfør mindst 20 mg biopsivæv til et 1,5 ml rør indeholdende 1 ml PBS-DTT.
- Brug en fin dissektionssaks til at skære vævet i stykker, der er 1-2 mm eller mindre.
- Brug en minicentrifuge på bordpladen i 15 sekunder til at samle vævsstykker i rørets bund og aspirere så meget supernatant som muligt. Et lille restvolumen PBS-DTT er acceptabelt.
- Tilsæt 5 ml friskopvarmet fordøjelsesbuffer til et 50 ml konisk rør. For at overføre de små vævsstykker uden at miste væv, skal du tage 500 μL af fordøjelsesbufferen og tilføje den til 1,5 ml røret, der indeholder vævet. Derefter ændres spidsen af en 1000 μL pipettespids med en saks for at øge spidsens diameter, hvilket muliggør nem aspiration og overførsel af vævsstykker til det 50 ml koniske rør, der indeholder fordøjelsesbufferen.
- Nedbrydningsbufferen og vævsblandingen inkuberes ved 37 °C i 30 minutter med orbitalomrystning ved 200 omdr./min.
- Tilsæt 5 ml opvarmet trypsin med 0,25% EDTA til fordøjelsesbufferen og inkuber i yderligere 10 minutter ved 37 °C med orbitalomrystning ved 200 omdr./min.
- Neutraliser fordøjelsesbufferen og trypsin ved at tilsætte et tilsvarende volumen Advanced (Adv.) DMEM/F12 media og før opløsningen gennem en 70 μm cellesi.
- Pillecellerne centrifugeres ved 1400 x g i 4 minutter ved 4 °C. Afhængigt af den oprindelige størrelse af biopsivævet kan en lille cellepille muligvis ikke være synlig.
- Resuspender cellepillen i 1 ml Adv. DMEM / F12 medier og tæl antallet af levedygtige celler ved hjælp af Trypan Blue og et hæmocytometer.
- Pellet cellerne igen ved centrifugering ved 1400 x g i 4 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten.
BEMÆRK: Figur 1 viser en skematisk gengivelse af processen til isolering af enkeltceller fra biopsivævet.
3. Indlejring af enkeltceller i en kældermembranmatrix "kuppel"
- Baseret på det tællede antal levedygtige celler beregnes volumenet af kældermembranmatrix, der kræves for at opnå en endelig koncentration på 105 levedygtige celler pr. 50 μL kældermembranmatrix.
- Udfør følgende hurtigt for at forhindre, at kældermembranmatrixen polymeriseres inden plettering. Fjern den optøede kældermembranmatrix fra is, tilsæt det tidligere beregnede volumen af kældermembranmatrix til cellerne, og bland forsigtigt ved pipettering op og ned i ca. 10 sekunder.
BEMÆRK: Det er afgørende at undgå at skabe bobler under dette trin. Fortynd ikke kældermembranmatrixen. - 50 μL alikvoter af kældermembranmatrixen/celleblandingen pipetteres hurtigt ind i midten af de enkelte brønde i en vævskulturplade med 24 brønde.
- Dæk straks pladen med 24 brønde til, og vend pladen på hovedet i en enkelt jævn bevægelse. Den omvendte plade anbringes i en 37 °C vævskulturinkubator i 35 minutter for at lade kældermembranmatrixen polymerisere.
BEMÆRK: Invertering af pladen er afgørende for at forhindre cellerne i at synke til bunden af pladen og for at gøre det muligt for kældermembranmatrixen at polymerisere til en 3D "kuppel" -form. - Tilsæt 500 μL forvarmede gastriske organoidmedier til hver brønd, og sørg for, at toppen af hver "kuppel" er helt nedsænket i mediet. Fordel mediet ned ad siden af hver brønd for at undgå at forstyrre "kuplen".
- Skift mediet hver 2-3 dage.
4. Rutinemæssig overførsel af organoider via fragmentering
- Når organoiderne er klar til passering, skal du fjerne medierne fra hver udpeget brønd.
BEMÆRK: For at bestemme det passende tidspunkt for bestået henvises til afsnittet Repræsentative resultater. - Dispenser 1 ml iskold Adv. DMEM/F12-medie direkte på en kældermembranmatrix "kuppel". Dette bør let indlede opløsningen af "kuplen". Fortsæt med at aspirere og dispensere, indtil alle fragmenter af "kuplen" løsner sig fra pladen.
- Transporter både mediet og den fragmenterede kældermembranmatrix til den næste brønd, og gentag denne proces for alle brønde, der er planlagt til passage. Efter demontering af den endelige kældermembranmatrix "kuppel" dispenseres mediet og blandingen af organoider og kældermembranmatrix i et 1,5 ml rør.
- Fastgør en 1000 μL spids til en P1000 pipette, og indsæt derefter denne spids i en 200 μL spids. Dette vil skabe en pipettespids med en lille nok diameter til at fragmentere organoiderne, mens den stadig tillader aspiration af et større volumen.
- Blandingen af organoider og kældermembranmatrix pipetteres kraftigt op og ned ca. 25 gange for at fragmentere organoiderne i små stykker.
- Den fragmenterede organoidblanding centrifugeres ved hjælp af en bordcentrifuge ved 4 °C i 30 s ved 2000 x g. Dette vil resultere i en pellet af fragmenterede organoider adskilt fra kældermembranmatrixen og medierne. Brug en pipette til at aspirere mediet og kældermembranmatrixsupernatanten. Brug ikke vakuum til at opsuge supernatanten, da pelleten er løs.
- Beregn mængden af nyoptøet kældermembranmatrix, der kræves, så antallet af brønde/kupler deles i forholdet 1:2 (50 μL/kuppel). Tilsæt den friske kældermembranmatrix og pipette forsigtigt op og ned for at blande, idet du sørger for at undgå at skabe bobler.
- Der alikvotes hurtigt 50 μL af blandingen af organoidfragmenter og kældermembranmatrix i individuelle brønde i en plade med 24 brønde.
- Dæk pladen, vend den på hovedet, og læg den i en 37 °C vævskulturinkubator i 35 minutter for at lade kældermembranmatrixen polymerisere.
- Tilsæt 500 μL forvarmede gastriske organoidmedier til hver brønd.
BEMÆRK: Figur 2 viser en skematisk oversigt over overførslen af gastriske patientafledte organoider gennem fragmentering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De efterfølgende repræsentative resultater stammer fra biopsier taget fra det godartede epitel i både mavekroppen og gastrisk antrumregioner i maven hos fem forskellige patienter, der gennemgår øvre endoskopi. To til fire "kupler" / brønde blev belagt og analyseret pr. Patient for både gastrisk krop og antrum biopsier. Organoider blev med succes genereret fra mavekroppen og gastrisk antrumbiopsivæv fra alle fem patienter. I gennemsnit blev 41 organoider analyseret pr. "kuppel" / brønd. Alle billeder er z-projektioner erhvervet ved hjælp af et konfokalmikroskop, og kvantificeringen af organoidstørrelse og sfæricitet blev udført ved hjælp af kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware (se materialetabel).
Organoider kan generelt identificeres inden for 10 dage efter såning af enkeltceller (figur 3A). På dag 20 er organoiderne store og skal typisk passeres. Mens antallet af organoider, der danner post-enkeltcellesåning, kan være noget variabelt, er forventede resultater for antallet af organoider dannet af krops- og antrale gastriske biopsier vist i figur 3B. Antallet af krops- og antralorganoider topper på dag 10 efter såning. Selvom det ikke er signifikant, begynder det samlede antal organoider at falde fra dag 10 til dag 15 og dag 15 til dag 20. Der ser ud til at være en underpopulation af små organoider, der dannes på dag 10 og derefter ophører med at vokse og dør i løbet af de følgende 10 dage, hvilket ville forklare denne tendens. Det er vigtigt, at det er vist, at antallet af organoider dannet af antralbiopsivæv er signifikant højere end biopsivæv fra kroppen på dag 10, 15 og 20. Antallet af dannede antrale organoider var i gennemsnit 2 gange højere end antallet af organoider dannet fra kroppen.
I figur 3C vises repræsentative resultater for organoidvækst efter enkeltcellesåning mellem dag 10 og dag 20. Mens organoider fra både antral- og kropsbiopsier oplevede stabil vækst fra dag 10 til 20, viste organoider genereret fra antralbiopsivæv en større vækstrate sammenlignet med organoider genereret fra kropsbiopsivæv. Især antrale organoider havde næsten et 4 gange større areal end kropsorganoider på dag 20.
På tværs af forskellige patienter observeres typisk en mangfoldighed af organoid morfologi i en enkelt "kuppel" / brønd (figur 4A). Nogle organoider er mere runde eller sfæriske, mens andre viste en mere uregelmæssig morfologi. Imidlertid viste sfæricitet, en måling af, hvor sfærisk en organoid er (hvor en score på 1 = en perfekt kugle)18, i gennemsnit ringe variation inden for og mellem organoider genereret fra krops- eller antralbiopsivæv (figur 4B). Derfor, selv om der er forskellige vækstrater, er der typisk ingen signifikante morfologiske forskelle mellem organoider genereret fra biopsivæv i mavekroppen eller antrum.
På dag 20 efter initiering er gastriske organoider typisk klar til at blive passeret. En stor organoid størrelse (≥1500 μm i diameter) eller et mørkt indre (tyder på omfattende cellulær omsætning) af organoid er nøgletegn på, at organoider skal passeres (figur 5A). Organoider, der er tilbage til at gå ud over dette punkt, kan begynde at bryde ned i 2D-monolag (figur 5B), der ikke pålideligt omdanner organoider efter passering, hvilket måske indikerer et tab af levedygtighed eller stamme. Efter passage og gensåning af gastriske organoider ved hjælp af fragmenteringsprotokollen beskrevet heri, vil "kuplerne" indeholde mange organoidfragmenter (figur 5C), der vil omorganisere sig til mange flere organoider og vokse meget hurtigere sammenlignet med den oprindelige såning af enkeltceller (figur 5D). Hvis organoidvækst stadig har brug for karakterisering og / eller standardisering på tidspunktet for passering, kan gastriske organoider i stedet fordøjes til enkeltceller, som tidligere beskrevet19.
Figur 1: Generering af gastriske patientafledte organoider. Skematisk oversigt, der viser processen med at generere gastriske patientafledte organoider fra biopsier af godartet gastrisk epitel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Passaging af gastriske patientafledte organoider. Skematisk oversigt, der illustrerer overførslen af gastriske patientafledte organoider gennem fragmentering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Gastrisk patientafledt organoiddannelse og vækst. (A) Repræsentative z-projektionsbilleder, der viser væksten af gastriske organoider på dag 10, 15 og 20 efter såning af enkeltceller. Billeder er af organoider genereret fra gastrisk krop og antrum biopsi væv fra den samme patient. Skalabjælke = 1 mm. (B) Gennemsnitlig (±SD) antal gastriske krops- og antrumorganoider på angivne tidspunkter efter såning af encellede. (C) Gennemsnitligt (±SD) areal (μm2) af gastrisk krop og antrumorganoider på angivne tidspunkter efter såning af encellede. n = 5 patienter pr. gruppe og tidspunkt. * = statistisk signifikant forskel (p ≤ 0,05) ved det angivne tidspunkt. n.s. = ingen statistisk signifikant forskel på det angivne tidspunkt. Statistiske sammenligninger udført via 2-vejs ANOVA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Gastrisk patientafledt organoidmorfologi. (A) Repræsentative z-projektionsbilleder af forskellige gastriske organoidmorfologier fra en individuel "kuppel"/brønd af gastriske kropsafledte organoider på dag 15 efter såning af en celle. Skalabjælke = 200 μm. (B) Gennemsnitlig (±SD) gastrisk krop og antrum organoid sfæricitet (hvor en værdi på 1 = en perfekt kugle). n = 5 patienter pr. gruppe og tidspunkt. n.s. = ingen statistisk signifikant forskel på noget tidspunkt. Statistiske sammenligninger udført via 2-vejs ANOVA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Gastrisk patientafledt organoid-passaging. (A) Repræsentativt billede af organoider, der er klar til at blive passeret på dag 20 efter såning af en celle. (B) Repræsentativt billede af organoider, der er forsinket til passage på dag 25 efter såning af en celle. (C) Repræsentativt billede af fragmenterede organoider efter gensåning (passage 1 - dag 0). (D) Repræsentativt billede af organoidvækst over 5 dage efter gensåning (passage 1 - dag 5). Alle billeder er z-projektioner. Vægtstænger = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Løsninger og medieopskrifter. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri skitseres en detaljeret protokol til pålidelig generering af humane gastriske organoider fra enkeltceller isoleret fra biopsier af godartet epitel fra mavekroppen og antrum. Kritiske trin i protokollen drejer sig om timing samt håndtering af kældermembranmatrixen. For at bevare levedygtigheden er det vigtigt at indlede protokollen så hurtigt som muligt efter erhvervelse af biopsivævet. Målet er at begynde at fordøje biopsivævet inden for 30 minutter efter, at biopsien er udført. Håndtering af kældermembranmatrixen kan også være udfordrende. Når det optøes på is, forbliver det en væske; ved temperaturer over 4 °C polymeriserer den imidlertid. Derfor skal hurtig overførsel af kældermembranmatrixen fra is til blanding med enkeltceller eller organoidfragmenter til plettering af "kupler" ske straks, da den begynder at polymerisere inden for et minut. Når det først er polymeriseret i et rør, kan det ikke suges ind i en pipettespids. Hvis dette sker, kan røret placeres på is, indtil Matrigel depolymeriserer tilbage til en væske. Når du forsigtigt pipetterer op og ned for at blande enkeltceller eller organoide fragmenter med kældermembranmatrixen, er det også afgørende at undgå at skabe bobler. Mens bobler i en kældermembranmatrix "kuppel" ikke synes at hindre organoiddannelse og vækst, kan de hindre visualisering. Efter aliquotering af kældermembranmatrixen / celleblandingen i brønden (e) på en cellekulturplade skal pladen desuden vendes og placeres i en inkubator. Dette trin er afgørende for at tillade kældermembranmatrixen at polymerisere til en 3D "kuppel" -form og forhindre enkeltcellerne eller organoidfragmenterne i at synke til bunden af pladen.
Ved hjælp af denne protokol kan gastriske organoider identificeres inden for 10 dage efter enkeltcellesåning. Erfaringen viser, at meget få nye gastriske organoider dannes efter dag 10, og faktisk kan det samlede antal organoider falde lidt fra dag 10-20. Dette gælder for organoider genereret fra både mavekroppen og antrummet. Imidlertid er det samlede antal organoider dannet af gastriske antrale biopsier signifikant højere end fra gastriske kropsbiopsier. Desuden overgår væksten af antrale organoider i høj grad kroppens organoider mellem dag 10-20 efter enkeltcellesåning. Denne forskel kan tilskrives variationer i Wnt-følsomheden. En nylig undersøgelse viste, at gastrisk krop BDO'er udviser bedre vækst med lavere Wnt-aktivering, mens gastrisk antrum BDO'er trives med højere Wnt-aktivering20. Placeringen af gastriske biopsier, der anvendes til at generere gastriske BDO'er, er typisk ikke specificeret i litteraturen. Sådanne forskelle bør overvejes i fremtidige undersøgelser ved hjælp af gastriske BDO'er genereret fra gastriske biopsier af forskellige maveområder.
Et andet afgørende aspekt af denne protokol er etableringen af et standardiseret antal enkeltceller til frø pr. "kuppel" / brønd til pålideligt generering af gastriske BDO'er. Mens en tidligere undersøgelse rapporterede et standardiseret antal mavekirtler til frø til BOB-generering, har ingen tidligere undersøgelser ved hjælp af en enkelt cellefordøjelsesmetode nævnt antallet af celler, der er podet, eller hvis antallet var konsistent på tværs af forskellige BOB-linjer. Manglende standardisering af antallet af frøede celler kan resultere i, at et meget variabelt antal stamceller podes pr. "kuppel" / brønd. Da stamceller er den primære kilde til gastrisk organoiddannelse, kan dette føre til variable hastigheder af organoiddannelse og vækst. Derfor kan brug af et ikke-standardiseret antal enkeltceller forvirre fortolkninger af dannelses- eller vækstsammenligninger på tværs af forskellige gastriske BOB-linjer. Her demonstreres det, at standardisering af antallet af celler podet til 105 celler pr. "kuppel" / brønd pålideligt genererer gastriske BDO'er fra biopsier af både kroppen og antrale regioner i maven.
Denne protokol blev optimeret til brug af frisk gastrisk biopsivæv. Derfor kan succesen med denne protokol variere, når der anvendes frosset væv eller væv konserveret på anden måde. Derudover er der ingen data om, hvor længe friske biopsier opretholder levedygtighed, da biopsivævet behandles så hurtigt som muligt efter fjernelse fra patientens mave. Formodentlig, jo længere det friske væv sidder før behandling, jo færre levedygtige celler vil blive isoleret.
Passaging gastrisk BDO'er via fragmentering, som beskrevet i denne protokol, giver en nem metode til rutinemæssig passering. Mens gastriske BDO'er er blevet passeret med succes op til 4 gange ved hjælp af denne teknik, har der ikke været forsøg på at bestemme, hvor mange gange de kan passeres, samtidig med at der opretholdes stabil vækst og levedygtighed. Nogle rapporter tyder på, at væksten af gastriske organoider kan aftage efter 5 eller flere passager21,22, mens andre har observeret pålidelig vækst i op til 10 passager23.
De gastriske organoidmedier, der anvendes i denne protokol, indeholder Wnt-3A, noggin og R-spondin afledt af konditionerede medier af L-WRN-celler. Til fremstilling af de konditionerede medier anvendes en protokol beskrevet af Miyoshi og Stappenbeck16. Alternativt kan Wnt-3A, noggin og R-spondin købes separat som rekombinante proteiner. Det er ideelt at købe de enkelte komponenter separat for at undgå potentielle batcheffekter, der kan opstå ved brug af konditionerede medier fra L-WRN-celler. Men at købe de rekombinante proteiner er dyrt og kan være uoverkommeligt for forskere, der ofte arbejder med organoider.
I betragtning af den stigende anvendelse af gastriske BDO'er i forskellige applikationer er det rettidigt og nødvendigt at etablere standardiserede tilgange til generering af godartede gastriske BOB'er. Den her beskrevne protokol tilbyder en pålidelig metode til fremtidige undersøgelser ved hjælp af gastriske BDO'er. Efter vores erfaring har denne protokol med succes genereret organoider fra biopsier af godartet maveslimhinde over 90% af tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante oplysninger.
Acknowledgments
University of Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men &; BRCA-program på Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H.
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S.
- Zhao, Z., et al.
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
