Summary
Gastrisk pasientavledede organoider finner økende bruk i forskning, men formelle protokoller for generering av humane gastriske organoider fra enkeltcellefordøyelser med standardisert såtetthet mangler. Denne protokollen presenterer en detaljert metode for pålitelig å lage mageorganoider fra biopsivev oppnådd under øvre endoskopi.
Abstract
Gastrisk pasientavledede organoider (PUD) tilbyr et unikt verktøy for å studere gastrisk biologi og patologi. Disse PUD-ene blir derfor stadig mer brukt i en lang rekke forskningsapplikasjoner. Imidlertid eksisterer det mangel på publiserte tilnærminger for å produsere gastriske PUDer fra enkeltcellefordøyelser samtidig som man opprettholder en standardisert innledende cellesåingstetthet. I denne protokollen legges det vekt på initiering av mageorganoider fra isolerte enkeltceller og tilveiebringelse av en metode for passering av organoider gjennom fragmentering. Det er viktig at protokollen viser at en standardisert tilnærming til den opprinnelige cellesåingstettheten konsekvent gir gastriske organoider fra godartet biopsivev og muliggjør standardisert kvantifisering av organoidvekst. Endelig støtter bevis den nye observasjonen at gastriske PUDer viser varierende dannelses- og veksthastigheter basert på om organoider stammer fra biopsier i kroppen eller antralområdene i magen. Spesielt er det avslørt at bruken av antralbiopsivev for organoid initiering resulterer i et større antall organoider dannet og raskere organoidvekst over en 20-dagers periode sammenlignet med organoider generert fra biopsier i magelegemet. Protokollen beskrevet her gir etterforskere en rettidig og reproduserbar metode for vellykket generering og arbeid med gastrisk PUD.
Introduction
Organoider er miniatyr tredimensjonale (3D) cellulære strukturer som ligner arkitekturen og funksjonaliteten til organene de ble avledet fra 1,2. Disse lab-dyrkede modellene er opprettet ved å dyrke stamceller eller vevsspesifikke celler i et kontrollert miljø som gjør at disse cellene kan organisere seg selv og differensiere i forskjellige celletyper 1,2,3. En av de viktigste fordelene med organoider er deres evne til å rekapitulere menneskelig biologi nærmere enn tradisjonelle todimensjonale (2D) cellekulturer 1,2,3. Spesielt har menneskelige organoider vist seg å opprettholde det genetiske mangfoldet av deres opprinnelsesvev 3,4,5. Organoider tilbyr en unik mulighet til å studere menneskelig organutvikling, modellsykdommer og teste potensielle terapier i en kontrollert laboratorieinnstilling. Videre kan organoider utledes fra individuelle pasientprøver, noe som muliggjør personlig medisintilnærming og potensiell utvikling av individualiserte behandlinger 3,6,7.
Forskere har brukt humane gastriske organoider til å undersøke ulike aspekter av gastrisk biologi og patologi. Fremtredende eksempler inkluderer bruk av pasientavledede organoider (PUD) for å forutsi cellegiftrespons i magekreft 8,9,10 og modellere epitelresponsen på Helicobacter pylori-infeksjon 11,12,13. Humane gastriske organoider består av forskjellige celletyper som finnes i magen, inkludert nakkeceller, pitceller og andre støttende celler11,14. Gastrisk organoider kan enten genereres fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) eller stamceller direkte isolert fra magevev oppnådd via biopsier eller fra gastriske reseksjonsprøver11,14. Isoleringen av magestamceller fra magevev gjøres vanligvis ved å isolere og dyrke magekjertler eller enzymatisk fordøye vevsprøver for å frigjøre enkeltceller 9,13,15. Det er viktig at differensieringen av celler i gastrisk organoider generert ved hjelp av en av disse teknikkene har vist seg å være lik13. Protokollen beskrevet her fokuserer på en enkeltcellefordøye.
Organoider representerer en vitenskapelig innovasjon som bygger bro mellom tradisjonell cellekultur og hele organer. Etter hvert som forskningen på feltet fortsetter å utvikle seg, er organoider klare til å bidra til utvikling av mer effektive behandlinger og terapier for et bredt spekter av applikasjoner. Gitt den økende bruken av gastrisk PUD, er det et rettidig behov for en standardisert tilnærming til deres generasjon. Her beskrives protokollen for generering av humane gastriske PUDer fra enkeltceller isolert fra godartet gastrisk biopsivev oppnådd under øvre endoskopi. Viktig og unikt er et standardisert antall enkeltceller bestemt for såing for pålitelig å generere gastriske PUDer og tillate etterfølgende karakterisering. Ved hjelp av denne teknikken demonstreres pålitelige forskjeller i dannelsen og veksten av organoider generert fra biopsier av enten magelegemet eller magesekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt menneskelig vev som ble brukt i denne protokollen ble samlet inn fra personer som ga informert samtykke til vevsinnsamling gjennom en magevevsinnsamlingsstudie godkjent av University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB # 842961). Deltakerne i denne studien måtte gjennomgå en øvre endoskopi som en del av deres rutinemessige omsorg, være minst 18 år og kunne gi informert samtykke. All forskning utført fulgte retningslinjene fastsatt av University of Pennsylvania.
1. Eksperimentell forberedelse
- Forbered betingede L-WRN-medier som tidligere beskrevet16. Selv om det ikke er obligatorisk, kan konsentrasjonene av Wnt-3A, R-spondin og noggin inneholdt i det kondisjonerte mediet kontrolleres ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
- Forbered RPMI-antibiotika (RPMI-ABX), PBS-antibiotika (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), fordøyelsesbuffer og mageorganoidmedier (se tilleggstabell 1 for detaljert sammensetning). Gastrisk organoid media er stabil i 1 uke ved 4 °C.
- Autoklavtang, fin disseksjonsaks og 1,5 ml rør.
- Begynn å tine kjellermembranmatrisen (Matrigel) på is.
- Begynn å tine fordøyelsesbufferen og Trypsin-EDTA i et vannbad på 37 °C.
- Sett en inkubator orbital shaker til 37 ° C og 200 o / min.
2. Isolere enkeltceller fra biopsivevet
- Samle gastrisk biopsier under en øvre endoskopi17 etter den institusjonelle kliniske protokollen, sannsynligvis med bruk av jumbotang. Bruk en stump nål til å trekke ut vevsprøver fra tangen og plasser dem i et 15 ml konisk rør som inneholder RPMI-ABX-medier. Hold røret på is for rask overføring til laboratoriet.
MERK: Minimum 2-4 biopsier bør samles. - La biopsivevet slå seg ned på bunnen av det koniske røret. Bruk en pipette til å aspirere mediet og vask biopsiene to ganger med 1 ml PBS-ABX-buffer. Det er ikke behov for sentrifugering, da vevstykkene legger seg naturlig i det koniske røret.
- Overfør minst 20 mg biopsivev til et 1,5 ml rør inneholdende 1 ml PBS-DTT.
- Bruk fin disseksjonssaks til å kutte vevet i biter som er 1-2 mm eller mindre.
- Bruk en bordplate minisentrifuge i 15 s for å samle vevstykker på rørets bunn og aspirere så mye supernatant som mulig. Et lite restvolum av PBS-DTT er akseptabelt.
- Tilsett 5 ml fersk oppvarmet fordøyelsesbuffer til et 50 ml konisk rør. For å overføre de små vevstykkene uten å miste vev, ta 500 μL av fordøyelsesbufferen og legg den til 1,5 ml røret som inneholder vevet. Deretter modifiserer du spissen på en 1000 μL pipettespiss med saks for å øke spissens diameter, noe som muliggjør enkel aspirasjon og overføring av vevsstykker til det 50 ml koniske røret som inneholder fordøyelsesbufferen.
- Inkuber fordøyelsesbufferen og vevsblandingen ved 37 °C i 30 minutter med orbital risting ved 200 o / min.
- Tilsett 5 ml oppvarmet trypsin med 0,25% EDTA til fordøyelsesbufferen og inkuber i ytterligere 10 minutter ved 37 °C med orbital risting ved 200 o / min.
- Nøytraliser fordøyelsesbufferen og trypsinet ved å tilsette et likt volum av Advanced (Adv.) DMEM / F12 media og pass løsningen gjennom en 70 μm cellesil.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 1400 x g i 4 minutter ved 4 °C. Avhengig av den opprinnelige størrelsen på biopsi vev, en liten celle pellet kan eller ikke kan være synlig.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml Adv. DMEM/F12 media og tell antall levedyktige celler ved hjelp av Trypan Blue og et hemocytometer.
- Pellet cellene igjen gjennom sentrifugering ved 1400 x g i 4 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten.
MERK: Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av prosessen for isolering av enkeltceller fra biopsivevet.
3. Embedding enkeltceller i en kjellermembranmatrise "kuppel"
- Basert på det telte antall levedyktige celler, beregne volumet av kjellermembranmatrise som kreves for å oppnå en endelig konsentrasjon på 105 levedyktige celler per 50 μL kjellermembranmatrise.
- Utfør følgende raskt for å forhindre at kjellermembranmatrisen polymeriseres før plating. Fjern den tinte kjellermembranmatrisen fra is, tilsett det tidligere beregnede volumet av kjellermembranmatrise til cellene, og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned i ca. 10 s.
MERK: Det er viktig å unngå å skape bobler i løpet av dette trinnet. Ikke fortynn matrisen av kjellermembranen. - Raskt pipette 50 μL alikoter av kjellermembranmatrisen / celleblandingen inn i midten av individuelle brønner i en 24-brønns vevskulturplate.
- Dekk umiddelbart til 24-brønnsplaten, og snu platen opp ned i en enkelt jevn bevegelse. Plasser den omvendte platen i en 37 ° C vevskulturinkubator i 35 minutter for å la kjellermembranmatrisen polymerisere.
MERK: Invertering av platen er viktig for å forhindre at cellene synker til bunnen av platen og for å gjøre det mulig for kjellermembranmatrisen å polymerisere til en 3D "kuppel" -form. - Tilsett 500 μL forvarmet gastrisk organoidmedium til hver brønn, slik at toppen av hver "kuppel" er helt nedsenket i mediet. Dispenser media ned på siden av hver brønn for å unngå å forstyrre "kuppelen".
- Bytt media hver 2-3 dag.
4. Rutinemessig overføring av organoider via fragmentering
- Når organoidene er klare for passasje, fjern mediet fra hver utpekte brønn.
MERK: For å bestemme riktig tidspunkt for passasje, vennligst se avsnittet Representative resultater. - Dispenser 1 ml iskaldt Adv. DMEM/F12-medium direkte på en kjellermembranmatrise "kuppel". Dette bør lett initiere oppbrudd av "kuppelen". Fortsett å aspirere og dispensere til alle fragmenter av "kuppelen" løsner fra platen.
- Transporter både media og den fragmenterte membranmatrisen i kjelleren til neste brønn, og gjenta denne prosessen for alle brønner som er planlagt passert. Etter demontering av den endelige kjellermembranmatrisen "kuppel", dispenser mediet og blandingen av organoider og kjellermembranmatrise i et 1,5 ml rør.
- Fest en spiss på 1000 μL til en P1000-pipette, og sett deretter spissen inn i en spiss på 200 μL. Dette vil skape en pipettespiss med liten nok diameter til å fragmentere organoidene samtidig som det tillater aspirasjon av et større volum.
- Kraftig pipette blandingen av organoider og kjellermembranmatrise opp og ned ca. 25 ganger for å fragmentere organoidene i små biter.
- Sentrifuge den fragmenterte organoidblandingen ved hjelp av en bordplatesentrifuge ved 4 °C i 30 s ved 2000 x g. Dette vil resultere i en pellet av fragmenterte organoider separert fra kjellermembranmatrisen og mediet. Bruk en pipette til å aspirere mediet og kjellermembranmatrisesupernatanten. Ikke bruk vakuum til å aspirere supernatanten, da pelleten er løs.
- Beregn nødvendig volum av nytint kjellermembranmatrise slik at antall brønner/kupler fordeles i forholdet 1:2 (50 μL/kuppel). Tilsett den ferske membranmatrisen i kjelleren og pipetter forsiktig opp og ned for å blande, pass på at det ikke dannes bobler.
- Raskt aliquot 50 μL av blandingen av organoidfragmenter og kjellermembranmatrise i individuelle brønner på en 24-brønnplate.
- Dekk platen, snu den opp ned og legg den i en 37 °C vevskulturinkubator i 35 minutter for å la kjellermembranmatrisen polymerisere.
- Tilsett 500 μL forvarmet gastrisk organoid media til hver brønn.
MERK: Figur 2 presenterer en skjematisk oversikt over passering av gastrisk pasientderiverte organoider gjennom fragmentering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De påfølgende representative resultatene er avledet fra biopsier tatt fra det godartede epitelet av både magelegemet og mage-antrum-regionene i magen hos fem forskjellige pasienter som gjennomgår øvre endoskopi. To til fire "kupler"/brønner ble belagt og analysert per pasient for både magelegeme- og antrumbiopsier. Organoider ble vellykket generert fra magelegemet og gastrisk antrumbiopsivev fra alle fem pasientene. I gjennomsnitt ble 41 organoider analysert per "kuppel"/brønn. Alle bildene er z-projeksjoner ervervet ved hjelp av et konfokalmikroskop, og kvantifiseringen av organoidstørrelse og sfærisitet ble utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare (se materialfortegnelse).
Organoider er generelt identifiserbare innen 10 dager etter såing av enkeltceller (figur 3A). Ved dag 20 er organoider store og må vanligvis passeres. Mens antall organoider som dannes etter enkeltcellesåing kan være noe varierende, er forventede resultater for antall organoider dannet fra kropps- og antralgastriske gastriske biopsier vist i figur 3B. Antall kropps- og antralorganoider topper seg på dag 10 etter såing. Selv om det ikke er signifikant, begynner det totale antallet organoider å synke fra dag 10 til dag 15 og dag 15 til dag 20. Det ser ut til å være en underpopulasjon av små organoider som dannes ved dag 10 og deretter opphører veksten og dør av i løpet av de følgende 10 dagene, noe som vil forklare denne trenden. Det er viktig at det er vist at antall organoider dannet fra antralbiopsivev er betydelig høyere enn biopsivev fra kroppen på dagene 10, 15 og 20. Antallet antralorganoider dannet var i gjennomsnitt 2 ganger høyere enn antall organoider dannet fra kroppen.
I figur 3C er representative resultater for organoidvekst etter encellesåing mellom dag 10 og dag 20 vist. Mens organoider fra både antral- og kroppsbiopsier så jevn vekst fra dag 10 til 20, viste organoider generert fra antralbiopsivev en større veksthastighet sammenlignet med organoider generert fra kroppsbiopsivev. Spesielt hadde antralorganoider nesten et 4 ganger større område enn kroppsorganoider på dag 20.
På tvers av forskjellige pasienter observeres et mangfold av organoid morfologi vanligvis i en enkelt "kuppel" / brønn (figur 4A). Noen organoider er mer runde eller sfæriske, mens andre viste en mer uregelmessig morfologi. I gjennomsnitt viste imidlertid sfærisitet, en måling av hvor sfærisk en organoid er (der en skår på 1 = en perfekt kule)18, liten variasjon innenfor og mellom organoider generert fra kropps- eller antralbiopsivev (figur 4B). Derfor, selv om det er forskjellige vekstrater, er det vanligvis ingen signifikante morfologiske forskjeller mellom organoider generert fra biopsivev i magesekken eller antrum.
Ved dag 20 etter initiering er gastriske organoider vanligvis klare til å bli passert. En stor organoid størrelse (≥1500 μm i diameter) eller et mørkt indre (noe som tyder på omfattende cellulær omsetning) av organoid er viktige tegn på at organoider må passeres (figur 5A). Organoider som er igjen for å gå utover dette punktet, kan begynne å bryte ned i 2D-monolag (figur 5B) som ikke pålitelig omdanner organoider etter passering, noe som kanskje indikerer tap av levedyktighet eller stamme. Etter å ha passert og sådd gastrisk organoider ved hjelp av fragmenteringsprotokollen beskrevet her, vil "kuplene" inneholde mange organoidfragmenter (figur 5C) som vil omorganisere seg til mange flere organoider og vokse mye raskere sammenlignet med den første såingen av enkeltceller (figur 5D). Hvis organoid vekst fortsatt trenger karakterisering og / eller standardisering på tidspunktet for passasje, kan mageorganoider i stedet fordøyes til enkeltceller, som tidligere beskrevet19.
Figur 1 Generering av gastrisk pasientderiverte organoider. Skjematisk oversikt som viser prosessen med å generere gastrisk pasientavledede organoider fra biopsier av godartet mageepitel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Passering av gastrisk pasientderiverte organoider. Skjematisk oversikt som illustrerer passering av gastrisk pasientavledede organoider gjennom fragmentering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gastrisk pasientavledet organoiddannelse og vekst. (A) Representative z-projeksjonsbilder som viser veksten av mageorganoider ved dag 10, 15 og 20 etter enkeltcellesåing. Bilder er av organoider generert fra mage kropp og antrum biopsi vev fra samme pasient. Skalastang = 1 mm. (B) Gjennomsnittlig (±SD) antall magelegeme- og antrumorganoider ved angitte tidspunkter etter enkeltcellesåing. (C) Gjennomsnittlig (±SD) område (μm2) av magelegeme- og antrumorganoider ved angitte tidspunkter etter enkeltcellesåing. n = 5 pasienter per gruppe og tidspunkt. * = statistisk signifikant forskjell (p ≤ 0,05) ved angitt tidspunkt. n.s. = ingen statistisk signifikant forskjell ved angitt tidspunkt. Statistiske sammenligninger utført via 2-veis ANOVA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gastrisk pasientderivert organoid morfologi. (A) Representative z-projeksjonsbilder av forskjellige gastriske organoidmorfologier fra en individuell "kuppel"/brønn av gastrisk legeme-avledede organoider ved dag 15 etter enkeltcellesåing. Skala bar = 200 μm. (B) Gjennomsnittlig (±SD) magelegeme og antrum organoid sphericity (hvor en verdi på 1 = en perfekt sfære). n = 5 pasienter per gruppe og tidspunkt. n.s. = ingen statistisk signifikant forskjell på noe tidspunkt. Statistiske sammenligninger utført via 2-veis ANOVA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Gastrisk pasientderivert organoidpassasje. (A) Representativt bilde av organoider klare til å bli passert på dag 20 etter enkeltcellesåing. (B) Representativt bilde av organoider forsinket for passering på dag 25 etter enkeltcellesåing. (C) Representativt bilde av fragmenterte organoider etter reseeding (passasje 1 - dag 0). (D) Representativt bilde av organoid vekst over 5 dager etter reseeding (passasje 1 - dag 5). Alle bildene er z-projeksjoner. Skalastenger = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Løsninger og medieoppskrifter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er en detaljert protokoll for pålitelig generering av humane gastriske organoider fra enkeltceller isolert fra biopsier av godartet epitel fra magelegemet og antrum skissert. Kritiske trinn i protokollen dreier seg om timing samt håndtering av kjellermembranmatrisen. For å bevare levedyktigheten er det viktig å starte protokollen så snart som mulig etter å ha anskaffet biopsivevet. Målet er å begynne å fordøye biopsivevet innen 30 minutter etter at biopsien er utført. Håndtering av kjellermembranmatrisen kan også være utfordrende. Når den tines på is, forblir den en væske; Ved temperaturer over 4 °C polymeriserer den imidlertid. Derfor må rask overføring av kjellermembranmatrisen fra is til blanding med enkeltceller eller organoidfragmenter for plating av "kupler" gjøres omgående, da den begynner å polymerisere innen ett minutt. Når den har polymerisert i et rør, kan den ikke aspireres inn i en pipettespiss. Hvis dette skjer, kan slangen legges på is til Matrigel depolymeriseres tilbake til en væske. Når du forsiktig pipetterer opp og ned for å blande enkeltceller eller organoidfragmenter med membranmatrisen i kjelleren, er det også viktig å unngå å skape bobler. Mens bobler i en kjellermembranmatrise "kuppel" ikke ser ut til å hindre organoiddannelse og vekst, kan de hindre visualisering. I tillegg, etter aliquoting av kjellermembranmatrisen / celleblandingen i brønnen (e) på en cellekulturplate, må platen inverteres og plasseres i en inkubator. Dette trinnet er avgjørende for å la kjellermembranmatrisen polymerisere til en 3D "kuppel" -form og forhindre at enkeltcellene eller organoidfragmentene synker til bunnen av platen.
Ved hjelp av denne protokollen kan gastriske organoider identifiseres innen 10 dager etter enkeltcellesåing. Erfaring viser at svært få nye gastriske organoider dannes utover dag 10, og faktisk kan det totale antallet organoider reduseres litt fra dag 10-20. Dette gjelder for organoider generert fra både magesekken og antrum. Imidlertid er det totale antall organoider dannet fra gastrale antralbiopsier signifikant høyere enn fra magekroppsbiopsier. Videre overgår veksten av antralorganoider i stor grad kroppens organoider mellom dag 10-20 etter enkeltcellesåing. Denne forskjellen kan tilskrives variasjoner i Wnt-følsomhet. En nylig studie viste at magelegeme-PUD viser bedre vekst med lavere Wnt-aktivering, mens gastrisk antrum PUD trives med høyere Wnt-aktivering20. Plasseringen av gastriske biopsier som brukes til å generere gastrisk PUD er vanligvis ikke spesifisert i litteraturen. Slike forskjeller bør vurderes i fremtidige studier ved bruk av gastrisk PUD generert fra gastriske biopsier av forskjellige mageområder.
Et annet viktig aspekt ved denne protokollen er etableringen av et standardisert antall enkeltceller til frø per "kuppel" / brønn for pålitelig generering av gastrisk PUD. Mens en tidligere studie rapporterte et standardisert antall magekjertler til frø for PUD-generasjon, har ingen tidligere studier ved hjelp av en enkeltcellefordøyemetode nevnt antall celler som ble sådd eller om tallet var konsistent over forskjellige PUD-linjer. Unnlatelse av å standardisere antall celler sådd kan resultere i et svært variabelt antall stamceller blir sådd per "kuppel" / brønn. Siden stamceller er den primære kilden til gastrisk organoiddannelse, kan dette føre til varierende organoiddannelse og vekst. Derfor kan bruk av et ikke-standardisert antall enkeltceller forvirre tolkninger av dannelses- eller vekstsammenligninger på tvers av forskjellige gastriske PUD-linjer. Her er det demonstrert at standardisering av antall celler sådd til 105 celler per "kuppel" / brønn pålitelig genererer gastrisk PUD fra biopsier av både kroppen og antralregionene i magen.
Denne protokollen ble optimalisert for bruk av ferskt gastrisk biopsivev. Følgelig kan suksessen til denne protokollen variere ved bruk av frosset vev eller vev bevart på annen måte. I tillegg er det ingen data om hvor lenge friske biopsier opprettholder levedyktighet, da biopsivevet behandles så snart som mulig etter fjerning fra pasientens mage. Formentlig, jo lenger det friske vevet sitter før behandling, jo færre levedyktige celler vil bli isolert.
Passering av gastrisk PUD via fragmentering, som beskrevet i denne protokollen, gir en enkel metode for rutinemessig passering. Mens gastriske PUDer har blitt passert opptil 4 ganger ved hjelp av denne teknikken, har det ikke vært noen forsøk på å bestemme hvor mange ganger de kan passeres samtidig som de opprettholder jevn vekst og levedyktighet. Noen rapporter indikerer at veksten av mageorganoider kan avta etter 5 eller flere passasjer21,22, mens andre har observert pålitelig vekst i opptil 10 passasjer23.
De gastriske organoidmediene som brukes i denne protokollen inneholder Wnt-3A, noggin og R-spondin avledet fra betingede medier av L-WRN-celler. For å produsere det betingede mediet brukes en protokoll beskrevet av Miyoshi og Stappenbeck16. Alternativt kan Wnt-3A, noggin og R-spondin kjøpes separat som rekombinante proteiner. Innkjøp av de enkelte komponentene separat er ideelt for å unngå potensielle batcheffekter som kan oppstå ved bruk av betingede medier fra L-WRN-celler. Imidlertid er det dyrt å kjøpe de rekombinante proteinene og kan være kost-uoverkommelig for forskere som ofte jobber med organoider.
Gitt den økende bruken av gastriske PUDer i ulike applikasjoner, er det rettidig og nødvendig å etablere standardiserte tilnærminger for å generere godartede gastriske PUDer. Protokollen beskrevet her gir en pålitelig metode for fremtidige undersøkelser ved bruk av gastrisk PUD. Etter vår erfaring har denne protokollen vellykket generert organoider fra biopsier av godartet mageslimhinne over 90% av tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante avsløringer.
Acknowledgments
University of Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men &; BRCA-programmet ved Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H.
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S.
- Zhao, Z., et al.
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
