Summary
Los organoides gástricos derivados de pacientes encuentran un uso cada vez mayor en la investigación, sin embargo, faltan protocolos formales para generar organoides gástricos humanos a partir de digestión de una sola célula con densidad de siembra estandarizada. Este protocolo presenta un método detallado para crear organoides gástricos de forma fiable a partir de tejido de biopsia obtenido durante la endoscopia superior.
Abstract
Los organoides gástricos derivados del paciente (PDO) ofrecen una herramienta única para estudiar la biología y la patología gástrica. En consecuencia, estas DOP se utilizan cada vez más en una amplia gama de aplicaciones de investigación. Sin embargo, existe una escasez de enfoques publicados para producir PDO gástricas a partir de digestión de una sola célula, manteniendo al mismo tiempo una densidad de siembra celular inicial estandarizada. En este protocolo, se hace hincapié en la iniciación de organoides gástricos a partir de células individuales aisladas y en la provisión de un método para el paso de organoides a través de la fragmentación. Es importante destacar que el protocolo demuestra que un enfoque estandarizado para la densidad inicial de siembra celular produce organoides gástricos a partir de tejido de biopsia benigna y permite la cuantificación estandarizada del crecimiento de organoides. Por último, la evidencia apoya la nueva observación de que las PDO gástricas muestran tasas variables de formación y crecimiento en función de si los organoides se originan en biopsias del cuerpo o en regiones antrales del estómago. Específicamente, se revela que el uso de tejido de biopsia antral para la iniciación de organoides da como resultado un mayor número de organoides formados y un crecimiento más rápido de organoides durante un período de 20 días en comparación con los organoides generados a partir de biopsias del cuerpo gástrico. El protocolo descrito en este documento ofrece a los investigadores un método oportuno y reproducible para generar y trabajar con éxito con PDO gástricas.
Introduction
Los organoides son estructuras celulares tridimensionales (3D) en miniatura que se asemejan a la arquitectura y funcionalidad de los órganos de los que se derivaron 1,2. Estos modelos cultivados en laboratorio se crean mediante el cultivo de células madre o células específicas de tejido en un entorno controlado que permite que estas células se autoorganicen y se diferencien en varios tipos de células 1,2,3. Una de las principales ventajas de los organoides es su capacidad para recapitular la biología humana más de cerca que los cultivos celulares bidimensionales (2D) tradicionales 1,2,3. En particular, se ha demostrado que los organoides humanos mantienen la diversidad genética de su tejido de origen 3,4,5. Los organoides ofrecen una oportunidad única para estudiar el desarrollo de los órganos humanos, modelar enfermedades y probar posibles terapias en un entorno de laboratorio controlado. Además, los organoides pueden derivarse de muestras individuales de pacientes, lo que permite enfoques de medicina personalizada y el desarrollo potencial de tratamientos individualizados 3,6,7.
Los investigadores han utilizado organoides gástricos humanos para investigar varios aspectos de la biología y la patología gástrica. Ejemplos destacados incluyen el uso de organoides derivados del paciente (PDO) para predecir las respuestas a la quimioterapia del cáncer gástrico 8,9,10 y modelar la respuesta epitelial a la infección por Helicobacter pylori 11,12,13. Los organoides gástricos humanos consisten en varios tipos de células que se encuentran en el estómago, incluidas las células del cuello, las células de la fosa y otras células de soporte11,14. Los organoides gástricos pueden generarse a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) o células madre aisladas directamente del tejido gástrico obtenido mediante biopsias o de muestras de resección gástrica11,14. El aislamiento de las células madre gástricas del tejido gástrico se realiza comúnmente mediante el aislamiento y cultivo de glándulas gástricas o la digestión enzimática de muestras de tejido para liberar células individuales 9,13,15. Es importante destacar que la diferenciación de las células dentro de los organoides gástricos generados mediante cualquiera de estas técnicas ha demostrado ser similar13. El protocolo descrito en este documento se centra en un resumen de una sola célula.
Los organoides representan una innovación científica que cierra la brecha entre el cultivo celular tradicional y los órganos completos. A medida que la investigación en el campo continúa progresando, los organoides están preparados para contribuir al desarrollo de tratamientos y terapias más efectivos para una amplia gama de aplicaciones. Dada la creciente utilización de las DOP gástricas, existe una necesidad oportuna de un enfoque estandarizado para su generación. En este trabajo se describe el protocolo para la generación de PDOs gástricos humanos a partir de células individuales aisladas de tejido de biopsia gástrica benigna adquirido durante la endoscopia alta. De manera importante y única, se determina un número estandarizado de células individuales para la siembra con el fin de generar de manera confiable PDO gástricas y permitir la caracterización posterior. Utilizando esta técnica, se demuestran diferencias confiables en la formación y crecimiento de organoides generados a partir de biopsias del cuerpo gástrico o del antro gástrico.
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Protocol
Todo el tejido humano utilizado en este protocolo se recolectó de personas que dieron su consentimiento informado para la recolección de tejido a través de un estudio de recolección de tejido gástrico aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania (IRB #842961). Los participantes en este estudio debían someterse a una endoscopia superior como parte de su atención de rutina, tener al menos 18 años de edad y ser capaces de proporcionar un consentimiento informado. Todas las investigaciones realizadas se adhirieron a las pautas establecidas por la Universidad de Pensilvania.
1. Preparación experimental
- Prepare los medios L-WRN acondicionados como se describió anteriormente16. Aunque no es obligatorio, las concentraciones de Wnt-3A, R-espondina y cabeza contenidas en los medios acondicionados se pueden verificar utilizando un kit ELISA disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
- Prepare antibióticos RPMI (RPMI-ABX), antibióticos PBS (PBS-ABX), DITIOTRITOL PBS (PPS-TTT), TAMPÓN DIGESTIVO Y MEDIOS ORGANOIDES GÁSTRICOS (consulte la Tabla Suplementaria 1 para obtener información detallada sobre la composición). El medio organoide gástrico es estable durante 1 semana a 4 °C.
- Pinzas de autoclave, tijeras de disección fina y tubos de 1,5 ml.
- Comience a descongelar la matriz de la membrana basal (Matrigel) en hielo.
- Comience a descongelar el tampón de digestión y la tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 °C.
- Ajuste un agitador orbital de incubadora a 37 °C y 200 rpm.
2. Aislar células individuales del tejido de la biopsia
- Recolectar biopsias gástricas durante una endoscopia alta17 siguiendo el protocolo clínico institucional, probablemente con el uso de pinzas jumbo. Utilice una aguja de punta roma para extraer muestras de tejido de las pinzas y colóquelas en un tubo cónico de 15 ml que contenga medios RPMI-ABX. Mantenga el tubo en hielo para una rápida transferencia al laboratorio.
NOTA: Como mínimo, se deben recolectar de 2 a 4 biopsias. - Deje que el tejido de la biopsia se asiente en el fondo del tubo cónico. Utilice una pipeta para aspirar el medio y lave las biopsias dos veces con 1 ml de tampón PBS-ABX. No hay necesidad de centrifugación, ya que las piezas de tejido se depositan naturalmente en el tubo cónico.
- Transfiera un mínimo de 20 mg de tejido de biopsia a un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de PBS-DTT.
- Use tijeras de disección finas para cortar el tejido en pedazos de 1 a 2 mm o menos.
- Utilice una minicentrífuga de mesa durante 15 s para agregar piezas de tejido en el fondo del tubo y aspirar la mayor cantidad posible de sobrenadante. Un pequeño volumen residual de PBS-TDT es aceptable.
- Agregue 5 ml de tampón de digestión recién calentado a un tubo cónico de 50 ml. Para transferir los pequeños trozos de tejido sin perder tejido, tome 500 μL del tampón de digestión y agréguelo al tubo de 1,5 mL que contiene el tejido. A continuación, modifique la punta de una punta de pipeta de 1000 μL con unas tijeras para aumentar el diámetro de la punta, lo que permite una fácil aspiración y transferencia de piezas de tejido al tubo cónico de 50 ml que contiene el tampón de digestión.
- Incubar el tampón de digestión y la mezcla de tejidos a 37 °C durante 30 min con agitación orbital a 200 rpm.
- Añadir 5 ml de tripsina calentada con EDTA al 0,25% al tampón de digestión e incubar durante 10 min más a 37 °C con agitación orbital a 200 rpm.
- Neutralice el tampón de digestión y la tripsina añadiendo un volumen igual de medios DMEM/F12 avanzados (Adv.) y pase la solución a través de un filtro celular de 70 μm.
- Granular las células por centrifugación a 1400 x g durante 4 min a 4 °C. Dependiendo del tamaño inicial del tejido de la biopsia, un gránulo de células pequeñas puede o no ser visible.
- Vuelva a suspender el gránulo de células en 1 ml de medio ADV. DMEM/F12 y cuente el número de células viables con azul de tripano y un hemocitómetro.
- Vuelva a granular las células mediante centrifugación a 1400 x g durante 4 min a 4 °C y retire el sobrenadante.
NOTA: La Figura 1 presenta una representación esquemática del proceso de aislamiento de células individuales del tejido de la biopsia.
3. Incrustación de células individuales en una "cúpula" de matriz de membrana basal
- Con base en el número contado de células viables, calcule el volumen de matriz de membrana basal requerido para lograr una concentración final de 105 células viables por cada 50 μL de matriz de membrana basal.
- Realice lo siguiente rápidamente para evitar que la matriz de la membrana basal se polimerice antes de enchapar. Retire la matriz de la membrana basal descongelada del hielo, agregue el volumen de la matriz de la membrana basal previamente calculado a las celdas y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante aproximadamente 10 s.
NOTA: Es crucial evitar la creación de burbujas durante este paso. No diluir la matriz de la membrana basal. - Pipetear rápidamente 50 μL de alícuotas de la mezcla de matriz de membrana basal/célula en el centro de pocillos individuales en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
- Cubra inmediatamente la placa de 24 pocillos y, con un solo movimiento suave, voltee la placa boca abajo. Coloque la placa invertida en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante 35 minutos para permitir que la matriz de la membrana basal se polimerice.
NOTA: La inversión de la placa es esencial para evitar que las células se hundan en el fondo de la placa y para permitir que la matriz de la membrana basal se polimerice en forma de "cúpula" 3D. - Agregue 500 μL de medio organoide gástrico precalentado a cada pocillo, asegurándose de que la parte superior de cada "cúpula" esté completamente sumergida en el medio. Dispense el medio por el costado de cada pocillo para evitar perturbar la "cúpula".
- Cambie los medios cada 2-3 días.
4. Pase rutinario de organoides por fragmentación
- Una vez que los organoides estén listos para el paseo, retire el medio de cada pocillo designado.
NOTA: Para determinar el tiempo apropiado para la aprobación, consulte la sección Resultados representativos. - Dispense 1 ml de medio Adv. DMEM/F12 helado directamente sobre una "cúpula" de matriz de membrana basal. Esto debería iniciar fácilmente la ruptura de la "cúpula". Continúe aspirando y dispensando hasta que todos los fragmentos de la "cúpula" se desprendan de la placa.
- Transportar tanto el medio como la matriz fragmentada de la membrana basal al siguiente pozo, repitiendo este proceso para todos los pozos programados para el paso. Después de desmontar la "cúpula" final de la matriz de la membrana basal, dispense el medio y la mezcla de organoides y la matriz de la membrana basal en un tubo de 1,5 ml.
- Coloque una punta de 1000 μL en una pipeta P1000 y, a continuación, inserte esta punta en una punta de 200 μL. Esto creará una punta de pipeta con un diámetro lo suficientemente pequeño como para fragmentar los organoides y, al mismo tiempo, permitir la aspiración de un volumen mayor.
- Pipetear vigorosamente la mezcla de organoides y la matriz de la membrana basal hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 25 veces para fragmentar los organoides en trozos pequeños.
- Centrifugar la mezcla de organoides fragmentados con una centrífuga de mesa a 4 °C durante 30 s a 2000 x g. Esto dará como resultado un gránulo de organoides fragmentados separados de la matriz y el medio de la membrana basal. Utilice una pipeta para aspirar el medio y el sobrenadante de la matriz de la membrana basal. No utilice un vacío para aspirar el sobrenadante, ya que el gránulo está suelto.
- Calcule el volumen de matriz de membrana basal recién descongelada requerido para que el número de pozos/domos se divida en una proporción de 1:2 (50 μL/domo). Agregue la matriz fresca de la membrana basal y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar, teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas.
- Alicuar rápidamente 50 μL de la mezcla de fragmentos de organoides y matriz de membrana basal en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
- Cubra la placa, déle la vuelta y colóquela en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante 35 minutos para permitir que la matriz de la membrana basal se polimerice.
- Agregue 500 μL de medio organoide gástrico precalentado a cada pocillo.
NOTA: La Figura 2 presenta una descripción esquemática del paso de organoides gástricos derivados de pacientes a través de la fragmentación.
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Representative Results
Los resultados representativos posteriores se derivan de biopsias tomadas del epitelio benigno de las regiones del cuerpo gástrico y del antro gástrico del estómago de cinco pacientes diferentes sometidos a endoscopia alta. Se sembraron de dos a cuatro "domos"/pocillos y se analizaron por paciente para biopsias de cuerpo gástrico y antro. Los organoides se generaron con éxito a partir del cuerpo gástrico y del tejido de biopsia del antro gástrico de los cinco pacientes. En promedio, se analizaron 41 organoides por "domo"/pocillo. Todas las imágenes son proyecciones z adquiridas con un microscopio confocal, y la cuantificación del tamaño y la esfericidad de los organoides se realizó utilizando un software de análisis de imágenes disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales).
Los organoides son generalmente identificables dentro de los 10 días posteriores a la siembra de células individuales (Figura 3A). Para el día 20, los organoides son grandes y, por lo general, necesitan ser evacuados. Si bien el número de organoides que se forman después de la siembra de una sola célula puede ser algo variable, los resultados esperados para el número de organoides formados a partir de biopsias gástricas corporales y antrales se muestran en la Figura 3B. El número de organoides corporales y antrales alcanza su punto máximo en el día 10 después de la siembra. Si bien no es significativo, el número total de organoides comienza a disminuir del día 10 al día 15 y del día 15 al día 20. Parece haber una subpoblación de pequeños organoides que se forman en el día 10 y luego dejan de crecer y mueren durante los siguientes 10 días, lo que explicaría esta tendencia. Es importante destacar que se muestra que el número de organoides formados a partir del tejido de la biopsia antral es significativamente mayor que el tejido de la biopsia del cuerpo a los días 10, 15 y 20. El número de organoides antrales formados fue, en promedio, 2 veces mayor que el número de organoides formados a partir del cuerpo.
En la Figura 3C, se muestran los resultados representativos del crecimiento de organoides después de la siembra de una sola célula entre el día 10 y el día 20. Mientras que los organoides de las biopsias antrales y corporales experimentaron un crecimiento constante desde el día 10 hasta el 20, los organoides generados a partir del tejido de la biopsia antral mostraron una mayor tasa de crecimiento en comparación con los organoides generados a partir del tejido de la biopsia del cuerpo. En particular, los organoides antrales tenían un área casi 4 veces mayor que los organoides corporales en el día 20.
En diferentes pacientes, se observa típicamente una diversidad de morfología organoide en cualquier "cúpula"/pocillo (Figura 4A). Algunos organoides son más redondos o esféricos, mientras que otros muestran una morfología más irregular. Sin embargo, en promedio, la esfericidad, una medida de cuán esférico es un organoide (donde una puntuación de 1 = una esfera perfecta)18, mostró poca variación dentro y entre los organoides generados a partir del tejido de la biopsia corporal o antral (Figura 4B). Por lo tanto, aunque existen diferentes tasas de crecimiento, normalmente no hay diferencias morfológicas significativas entre los organoides generados a partir del tejido de la biopsia del cuerpo gástrico o del antro.
Para el día 20 después de la iniciación, los organoides gástricos suelen estar listos para ser pasados. Un tamaño de organoide grande (≥1500 μm de diámetro) o un interior oscurecido (sugestivo de un extenso recambio celular) del organoide son signos clave de que los organoides necesitan ser transitados (Figura 5A). Los organoides que se dejan ir más allá de este punto pueden comenzar a descomponerse en monocapas 2D (Figura 5B) que no vuelven a formar organoides de manera confiable después del paso, lo que tal vez indique una pérdida de viabilidad o tallo. Después de pasar y resembrar organoides gástricos utilizando el protocolo de fragmentación descrito en este documento, las "cúpulas" contendrán muchos fragmentos de organoides (Figura 5C) que se reorganizarán en muchos más organoides y crecerán mucho más rápidamente en comparación con la siembra inicial de células individuales (Figura 5D). Si el crecimiento de organoides aún necesita caracterización y/o estandarización en el momento del paso, los organoides gástricos pueden ser digeridos en células individuales, como se describió anteriormente19.
Figura 1: Generación de organoides gástricos derivados de pacientes. Resumen esquemático que representa el proceso de generación de organoides gástricos derivados de pacientes a partir de biopsias de epitelio gástrico benigno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pasaje de organoides gástricos derivados de pacientes. Resumen esquemático que ilustra el paso de organoides gástricos derivados de pacientes a través de la fragmentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Formación y crecimiento de organoides gástricos derivados del paciente. (A) Imágenes representativas de proyección z que muestran el crecimiento de organoides gástricos en los días 10, 15 y 20 después de la siembra de una sola célula. Las imágenes son de organoides generados a partir del tejido de la biopsia del cuerpo gástrico y el antro del mismo paciente. Barra de escala = 1 mm. (B) Número medio (±DE) de organoides del cuerpo gástrico y del antro en los puntos de tiempo indicados después de la siembra de una sola célula. (C) Área media (±DE) (μm2) de organoides del cuerpo gástrico y del antro en los puntos de tiempo indicados después de la siembra de una sola célula. n = 5 pacientes por grupo y punto temporal. * = diferencia estadísticamente significativa (p ≤ 0,05) en el punto temporal indicado. n.d. = sin diferencia estadísticamente significativa en el momento indicado. Comparaciones estadísticas realizadas mediante ANOVA de 2 vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Morfología del organoide gástrico derivado del paciente. (A) Imágenes representativas de proyección z de diferentes morfologías de organoides gástricos de un "domo" / pocillo individual de organoides derivados del cuerpo gástrico en el día 15 después de la siembra de una sola célula. Barra de escala = 200 μm. (B) Media (±DE) de la esfericidad del organoide gástrico del cuerpo gástrico y del antro (donde un valor de 1 = una esfera perfecta). n = 5 pacientes por grupo y punto temporal. N.D. = sin diferencias estadísticamente significativas en ningún momento. Comparaciones estadísticas realizadas mediante ANOVA de 2 vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Pase de organoides gástrico derivado del paciente. (A) Imagen representativa de organoides listos para ser pasados en el día 20 después de la siembra de una sola célula. (B) Imagen representativa de los organoides atrasados para la pasada en el día 25 después de la siembra de una sola célula. (C) Imagen representativa de organoides fragmentados después de la resiembra (Paso 1 - Día 0). (D) Imagen representativa del crecimiento de organoides durante 5 días después de la resiembra (Paso 1 - Día 5). Todas las imágenes son proyecciones z. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla complementaria 1: Soluciones y recetas de medios. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En este trabajo se describe un protocolo detallado para generar de forma fiable organoides gástricos humanos a partir de células individuales aisladas de biopsias de epitelio benigno del cuerpo gástrico y el antro. Los pasos críticos en el protocolo giran en torno al tiempo, así como al manejo de la matriz de la membrana basal. Para preservar la viabilidad, es fundamental iniciar el protocolo lo antes posible después de adquirir el tejido de la biopsia. El objetivo es comenzar a digerir el tejido de la biopsia dentro de los 30 minutos posteriores a la realización de la biopsia. El manejo de la matriz de la membrana basal también puede ser un desafío. Cuando se descongela en hielo, permanece líquido; sin embargo, a temperaturas superiores a 4 °C, se polimeriza. Por lo tanto, la transferencia rápida de la matriz de la membrana basal del hielo a la mezcla con células individuales o fragmentos de organoides para la siembra de "cúpulas" debe hacerse rápidamente, ya que comienza a polimerizarse en un minuto. Una vez que se ha polimerizado en un tubo, no se puede aspirar en una punta de pipeta. Si esto ocurre, el tubo se puede colocar en hielo hasta que el Matrigel se despolimerice de nuevo en un líquido. Al pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar células individuales o fragmentos de organoides con la matriz de la membrana basal, también es crucial evitar la creación de burbujas. Si bien las burbujas en una "cúpula" de la matriz de la membrana basal no parecen obstaculizar la formación y el crecimiento de organoides, pueden obstruir la visualización. Además, después de alícuota de la mezcla de matriz de membrana basal/célula en los pocillos de una placa de cultivo celular, la placa debe invertirse y colocarse en una incubadora. Este paso es fundamental para permitir que la matriz de la membrana basal se polimerice en forma de "cúpula" 3D y evitar que las células individuales o los fragmentos de organoides se hundan en el fondo de la placa.
Con este protocolo, los organoides gástricos se pueden identificar dentro de los 10 días posteriores a la siembra de una sola célula. La experiencia muestra que se forman muy pocos organoides gástricos nuevos más allá del día 10 y, de hecho, el número total de organoides puede disminuir ligeramente entre el día 10 y el 20. Esto es cierto para los organoides generados tanto en el cuerpo gástrico como en el antro. Sin embargo, el número total de organoides formados a partir de biopsias antrales gástricas es significativamente mayor que el de biopsias de cuerpos gástricos. Además, el crecimiento de los organoides antrales supera con creces a los organoides corporales entre los días 10 y 20 después de la siembra de una sola célula. Esta diferencia puede atribuirse a variaciones en la sensibilidad Wnt. Un estudio reciente demostró que las DOP del cuerpo gástrico exhiben un mejor crecimiento con una menor activación de Wnt, mientras que las PDO de antro gástrico prosperan con una mayor activación de Wnt20. La localización de las biopsias gástricas utilizadas para generar PDO gástricas no suele especificarse en la literatura. Tales diferencias deben ser consideradas en futuros estudios que utilicen PDOs gástricas generadas a partir de biopsias gástricas de diferentes áreas del estómago.
Otro aspecto crucial de este protocolo es el establecimiento de un número estandarizado de células individuales para sembrar por "domo"/pocillo para generar de forma fiable las DOP gástricas. Si bien un estudio anterior informó un número estandarizado de glándulas gástricas para sembrar para la generación de PDO, ningún estudio anterior que utilizara un método de digestión de una sola célula ha mencionado el número de células sembradas o si el número era consistente en diferentes líneas de PDO. Si no se estandariza el número de células sembradas, se puede sembrar un número muy variable de células madre por "domo"/pocillo. Dado que las células madre son la principal fuente de formación de organoides gástricos, esto podría conducir a tasas variables de formación y crecimiento de organoides. Por lo tanto, la utilización de un número no estandarizado de células individuales podría confundir las interpretaciones de las comparaciones de formación o crecimiento en diferentes líneas de PDO gástricas. Aquí, se demuestra que la estandarización del número de células sembradas a 105 células por "domo"/pocillo genera de forma fiable PDO gástricas a partir de biopsias tanto del cuerpo como de las regiones antrales del estómago.
Este protocolo fue optimizado para el uso de tejido fresco de biopsia gástrica. En consecuencia, el éxito de este protocolo puede variar cuando se utiliza tejido congelado o tejido conservado por otros medios. Además, no hay datos sobre cuánto tiempo mantienen la viabilidad las biopsias frescas, ya que el tejido de la biopsia se procesa lo antes posible después de la extracción del estómago del paciente. Presumiblemente, cuanto más tiempo permanezca el tejido fresco antes del procesamiento, menos células viables se aislarán.
El paso de las PDO gástricas a través de la fragmentación, como se describe en este protocolo, proporciona un método fácil para el paso de rutina. Si bien las DOP gástricas se han pasado con éxito hasta 4 veces utilizando esta técnica, no ha habido intentos de determinar cuántas veces se pueden pasar mientras se mantiene un crecimiento y viabilidad constantes. Algunos relatos indican que el crecimiento de los organoides gástricos puede disminuir después de 5 o más pasadas21,22, mientras que otros han observado un crecimiento confiable de hasta 10 pasadas23.
Los medios organoides gástricos utilizados en este protocolo contienen Wnt-3A, noggin y R-espondina derivados de medios acondicionados de células L-WRN. Para producir los medios condicionados, se utiliza un protocolo descrito por Miyoshi y Stappenbeck16. Alternativamente, Wnt-3A, noggin y R-spondin se pueden comprar por separado como proteínas recombinantes. La compra de los componentes individuales por separado es ideal para evitar los posibles efectos de lote que pueden surgir al utilizar medios acondicionados de celdas L-WRN. Sin embargo, comprar las proteínas recombinantes es caro y puede tener un costo prohibitivo para los investigadores que trabajan con frecuencia con organoides.
Dado el creciente uso de las DOP gástricas en diversas aplicaciones, es oportuno y necesario establecer enfoques estandarizados para la generación de DOP gástricas benignas. El protocolo aquí descrito ofrece un método confiable para futuras investigaciones utilizando PDO gástricas. En nuestra experiencia, este protocolo ha generado con éxito organoides a partir de biopsias de mucosa gástrica benigna más del 90% de las veces.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones relevantes.
Acknowledgments
Medicina Genómica de la Universidad de Pensilvania T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Programa de Hombres y BRCA en el Centro Basser para BRCA (KHB, BWK), Premio de Subvención de la Fundación de la Familia DeGregorio (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H.
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S.
- Zhao, Z., et al.
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
