Summary
Magsäckspatientderiverade organoider används i allt högre grad inom forskningen, men formella protokoll för att generera mänskliga magorganoider från encelliga digests med standardiserad såddtäthet saknas. Detta protokoll presenterar en detaljerad metod för att på ett tillförlitligt sätt skapa magorganoider från biopsivävnad erhållen under övre endoskopi.
Abstract
Gastriska patientderiverade organoider (PDO) erbjuder ett unikt verktyg för att studera magbiologi och patologi. Följaktligen används dessa skyddade ursprungsbeteckningar i allt högre grad i ett brett spektrum av forskningstillämpningar. Det finns dock en brist på publicerade metoder för att producera magsäcks-PDO från encelliga nedbrytningar samtidigt som en standardiserad initial cellsåddstäthet bibehålls. I detta protokoll ligger tonvikten på initiering av magorganoider från isolerade enskilda celler och tillhandahållande av en metod för att passera organoider genom fragmentering. Viktigt är att protokollet visar att ett standardiserat tillvägagångssätt för den initiala cellsåddstätheten konsekvent ger magorganoider från godartad biopsivävnad och möjliggör standardiserad kvantifiering av organoidtillväxt. Slutligen stöder bevisen den nya observationen att magsäcks-PDO uppvisar varierande bildnings- och tillväxthastigheter baserat på om organoiderna kommer från biopsier av kroppen eller antrala regioner i magen. Specifikt avslöjas det att användningen av antral biopsivävnad för organoidinitiering resulterar i ett större antal bildade organoider och snabbare organoidtillväxt under en 20-dagarsperiod jämfört med organoider som genereras från biopsier av magkroppen. Protokollet som beskrivs här erbjuder utredare en snabb och reproducerbar metod för att framgångsrikt generera och arbeta med magsäcks-PDO.
Introduction
Organoider är miniatyr tredimensionella (3D) cellulära strukturer som liknar arkitekturen och funktionaliteten hos de organ från vilkade härstammar 1,2. Dessa labbodlade modeller skapas genom att odla stamceller eller vävnadsspecifika celler i en kontrollerad miljö som gör det möjligt för dessa celler att självorganisera sig och differentiera till olika celltyper 1,2,3. En av de viktigaste fördelarna med organoider är deras förmåga att rekapitulera mänsklig biologi närmare än traditionella tvådimensionella (2D) cellkulturer 1,2,3. I synnerhet har mänskliga organoider visat sig bibehålla den genetiska mångfalden i sin ursprungsvävnad 3,4,5. Organoider erbjuder en unik möjlighet att studera mänskliga organutveckling, modellera sjukdomar och testa potentiella terapier i en kontrollerad laboratoriemiljö. Dessutom kan organoider härledas från enskilda patientprover, vilket möjliggör personliga medicinska metoder och potentiell utveckling av individualiserade behandlingar 3,6,7.
Forskare har använt mänskliga magorganoider för att undersöka olika aspekter av magbiologi och patologi. Framträdande exempel inkluderar användningen av patient-deriverade organoider (PDO) för att förutsäga kemoterapisvar vid magcancer 8,9,10 och modellera epitelsvaret på Helicobacter pylori-infektion 11,12,13. Humana magorganoider består av olika celltyper som finns i magen, inklusive nackceller, gropceller och andra stödceller11,14. Magorganoider kan antingen genereras från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) eller stamceller som isolerats direkt från magvävnad erhållen via biopsier eller från gastriska resektionsprover11,14. Isolering av magstamceller från magvävnad görs vanligen genom att isolera och odla magkörtlar eller enzymatiskt smälta vävnadsprover för att frigöra enstaka celler 9,13,15. Det är viktigt att notera att differentieringen av celler inom magorganoider som genereras med någon av dessa tekniker har visat sig vara likartad13. Protokollet som beskrivs här fokuserar på en encellsdigest.
Organoider representerar en vetenskaplig innovation som överbryggar klyftan mellan traditionell cellkultur och hela organ. I takt med att forskningen inom området fortsätter att utvecklas är organoider redo att bidra till utvecklingen av mer effektiva behandlingar och terapier för ett brett spektrum av tillämpningar. Med tanke på den ökande användningen av magsäcksskyddade sub finns det ett snabbt behov av ett standardiserat tillvägagångssätt för deras generering. Här beskrivs protokollet för att generera humana magsäcks-PDO:er från enskilda celler isolerade från godartad magbiopsivävnad förvärvad under övre endoskopi. Viktigt och unikt är att ett standardiserat antal enskilda celler bestäms för sådd för att på ett tillförlitligt sätt generera magsäcks-PDO:er och möjliggöra efterföljande karakterisering. Med hjälp av denna teknik påvisas tillförlitliga skillnader i bildning och tillväxt av organoider som genereras från biopsier av antingen magkroppen eller magsäcksantrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All mänsklig vävnad som används i detta protokoll samlades in från individer som gav informerat samtycke till vävnadsinsamling genom en magvävnadsinsamlingsstudie godkänd av University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB #842961). Deltagarna i denna studie var tvungna att genomgå en övre endoskopi som en del av sin rutinvård, vara minst 18 år gamla och kunna ge informerat samtycke. All forskning som genomfördes följde de riktlinjer som fastställts av University of Pennsylvania.
1. Experimentell förberedelse
- Förbered konditionerade L-WRN-medier som tidigare beskrivits16. Även om det inte är obligatoriskt, kan koncentrationerna av Wnt-3A, R-spondin och noggin som finns i det konditionerade mediet kontrolleras med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
- Förbered RPMI-antibiotika (RPMI-ABX), PBS-antibiotika (PBS-ABX), PBS-ditiotreitol (PBS-DTT), matsmältningsbuffert och magorganoidmedier (se tilläggstabell 1 för detaljerad sammansättning). Magorganoidmedia är stabilt i 1 vecka vid 4 °C.
- Autoklavpincett, findissektionssax och 1,5 ml rör.
- Börja tina upp basalmembranmatrisen (Matrigel) på is.
- Börja tina upptiningsbufferten och trypsin-EDTA i ett 37 °C vattenbad.
- Ställ in en orbitalshaker på 37 °C och 200 rpm.
2. Isolering av enstaka celler från biopsivävnaden
- Samla in magbiopsier under en övre endoskopi17 enligt det institutionella kliniska protokollet, sannolikt med användning av jumbopincett. Använd en trubbig nål för att extrahera vävnadsprover från pincetten och placera dem i ett 15 ml koniskt rör som innehåller RPMI-ABX-media. Håll röret på is för snabb överföring till laboratoriet.
OBS: Minst 2-4 biopsier bör samlas in. - Låt biopsivävnaden sätta sig i botten av det koniska röret. Använd en pipett för att aspirera mediet och tvätta biopsierna två gånger med 1 ml PBS-ABX-buffert. Det finns inget behov av centrifugering, eftersom vävnadsbitarna sätter sig naturligt i det koniska röret.
- Överför minst 20 mg biopsivävnad till ett 1,5 ml rör som innehåller 1 ml PBS-DTT.
- Använd en findissektionssax för att klippa vävnaden i bitar som är 1-2 mm eller mindre.
- Använd en minicentrifug på bordsskiva i 15 sekunder för att aggregera vävnadsbitar i rörets botten och aspirera så mycket supernatant som möjligt. En liten restvolym av PBS-DTT är acceptabel.
- Tillsätt 5 ml nyuppvärmd rötningsbuffert till ett 50 ml koniskt rör. För att överföra de små vävnadsbitarna utan att förlora vävnad, ta 500 μL av matsmältningsbufferten och tillsätt den till 1,5 ml röret som innehåller vävnaden. Modifiera sedan spetsen på en 1000 μL pipettspets med en sax för att öka spetsens diameter, vilket möjliggör enkel aspiration och överföring av vävnadsbitar till det 50 ml koniska röret som innehåller matsmältningsbufferten.
- Inkubera rötningsbufferten och vävnadsblandningen vid 37 °C i 30 minuter med orbitalskakning vid 200 varv per minut.
- Tillsätt 5 ml uppvärmt trypsin med 0,25 % EDTA till rötningsbufferten och inkubera i ytterligare 10 minuter vid 37 °C med orbitalskakning vid 200 rpm.
- Neutralisera digestionsbufferten och trypsin genom att tillsätta en lika stor volym Advanced (Adv.) DMEM/F12-media och låt lösningen passera genom en 70 μm cellsil.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 1400 x g i 4 minuter vid 4 °C. Beroende på biopsivävnadens ursprungliga storlek kan en småcellig pellet vara synlig eller inte.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 ml Adv. DMEM/F12-media och räkna antalet livsdugliga celler med hjälp av Trypan Blue och en hemocytometer.
- Pelletera cellerna igen genom centrifugering vid 1400 x g i 4 minuter vid 4 °C och ta bort supernatanten.
OBS: Figur 1 visar en schematisk representation av processen för att isolera enskilda celler från biopsivävnaden.
3. Bädda in enstaka celler i en basalmembranmatris "kupol"
- Baserat på det räknade antalet livskraftiga celler, beräkna volymen av basalmembranmatris som krävs för att uppnå en slutlig koncentration av 105 livskraftiga celler per 50 μL basalmembranmatris.
- Utför följande snabbt för att förhindra att basalmembranmatrisen polymeriseras före plätering. Ta bort den tinade basalmembranmatrisen från isen, tillsätt den tidigare beräknade volymen av basalmembranmatrisen till cellerna och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner i cirka 10 s.
OBS: Det är viktigt att undvika att skapa bubblor under detta steg. Späd inte ut basalmembranmatrisen. - Pipettera snabbt 50 μL alikvoter av basalmembranmatrisen/cellblandningen i mitten av enskilda brunnar i en vävnadsodlingsplatta med 24 brunnar.
- Täck omedelbart över plattan med 24 brunnar och vänd plattan upp och ner i en enda smidig rörelse. Placera den inverterade plattan i en 37 °C vävnadsinkubator i 35 minuter så att basalmembranmatrisen kan polymeriseras.
OBS: Att invertera plattan är viktigt för att förhindra att cellerna sjunker till botten av plattan och för att göra det möjligt för basalmembranmatrisen att polymeriseras till en 3D-"kupol"-form. - Tillsätt 500 μl förvärmda magorganoidmedier till varje brunn och se till att toppen av varje "kupol" är helt nedsänkt i mediet. Fördela mediet längs sidan av varje brunn för att undvika att störa "kupolen".
- Byt media var 2-3:e dag.
4. Rutinmässig passage av organoider via fragmentering
- När organoiderna är redo för passering, ta bort mediet från varje avsedd brunn.
OBS: För att bestämma lämplig tid för passaging, se avsnittet Representativa resultat. - Dosera 1 ml iskallt Adv. DMEM/F12-media direkt på en basalmembranmatris "kupol". Detta bör lätt initiera upplösningen av "kupolen". Fortsätt aspirera och dispensera tills alla fragment av "kupolen" lossnar från plattan.
- Transportera både mediet och den fragmenterade basalmembranmatrisen till nästa brunn och upprepa denna process för alla brunnar som är planerade för passage. Efter demontering av den slutliga basalmembranmatrisen "kupol", fördela mediet och blandningen av organoider och basalmembranmatris i ett 1.5 ml rör.
- Fäst en 1000 μL-spets på en P1000-pipett och sätt sedan in denna spets i en 200 μL-spets. Detta kommer att skapa en pipettspets med en tillräckligt liten diameter för att fragmentera organoiderna samtidigt som det är möjligt att sträva efter en större volym.
- Pipettera kraftigt blandningen av organoider och basalmembranmatris upp och ner cirka 25 gånger för att fragmentera organoiderna i små bitar.
- Centrifugera den fragmenterade organoidblandningen med en bordscentrifug vid 4 °C i 30 s vid 2000 x g. Detta kommer att resultera i en pellet av fragmenterade organoider separerade från basalmembranmatrisen och media. Använd en pipett för att aspirera mediet och basalmembranets matrissupernatant. Använd inte vakuum för att aspirera supernatanten, eftersom pelleten är lös.
- Beräkna volymen av nytinad basalmembranmatris som krävs så att antalet brunnar/kupoler delas i förhållandet 1:2 (50 μL/kupol). Tillsätt den färska basalmembranmatrisen och pipettera försiktigt upp och ner för att blanda, var noga med att undvika att skapa bubblor.
- Alikvant snabbt 50 μl av blandningen av organoidfragment och basalmembranmatris i enskilda brunnar på en 24-hålsplatta.
- Täck plattan, vänd den upp och ner och placera den i en 37 °C vävnadsinkubator i 35 minuter så att basalmembranmatrisen kan polymeriseras.
- Tillsätt 500 μl förvärmda magorganoidmedier till varje brunn.
OBS: Figur 2 visar en schematisk översikt över passagen av ventrikelpatientderiverade organoider genom fragmentering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De efterföljande representativa resultaten härrör från biopsier tagna från det godartade epitelet i både magkroppen och magsäckens antrumregioner i magen hos fem olika patienter som genomgår övre endoskopi. Två till fyra "kupoler"/brunnar pläterades och analyserades per patient för både magkropps- och antrumbiopsier. Organoider genererades framgångsrikt från magkroppen och ventrisk antrumbiopsivävnad från alla fem patienterna. I genomsnitt analyserades 41 organoider per "kupol"/brunn. Alla bilder är z-projektioner tagna med hjälp av ett konfokalmikroskop, och kvantifieringen av organoidstorlek och sfäricitet utfördes med hjälp av kommersiellt tillgänglig bildanalysprogramvara (se materialtabell).
Organoider är i allmänhet identifierbara inom 10 dagar efter sådd av enstaka celler (figur 3A). Vid dag 20 är organoiderna stora och behöver vanligtvis passeras. Även om antalet organoider som bildas efter encellig sådd kan vara något varierande, visas förväntade resultat för antalet organoider som bildas från kropps- och antrala magbiopsier i figur 3B. Antalet kropps- och antralorganoider når sin topp på dag 10 efter sådd. Även om det inte är signifikant, börjar det totala antalet organoider minska från dag 10 till dag 15 och dag 15 till dag 20. Det verkar finnas en subpopulation av små organoider som bildas vid dag 10 och sedan upphör att växa och dör under de följande 10 dagarna, vilket skulle förklara denna trend. Viktigt är att det visas att antalet organoider som bildas från antral biopsivävnad är signifikant högre än biopsivävnad från kroppen vid dag 10, 15 och 20. Antalet antrala organoider som bildades var i genomsnitt 2 gånger högre än antalet organoider som bildades från kroppen.
I figur 3C visas representativa resultat för organoidtillväxt efter encellssådd mellan dag 10 och dag 20. Medan organoider från både antral- och kroppsbiopsier såg stadig tillväxt från dag 10 till 20, visade organoider som genererades från antralbiopsivävnad en högre tillväxthastighet jämfört med organoider som genererades från kroppsbiopsivävnad. I synnerhet hade antralorganoider nästan 4 gånger större area än kroppsorganoider vid dag 20.
Hos olika patienter observeras vanligtvis en mångfald av organoidmorfologi i en enskild "kupol"/brunn (Figur 4A). Vissa organoider är mer runda eller sfäriska medan andra uppvisade en mer oregelbunden morfologi. Men i genomsnitt visade sfäriciteten, ett mått på hur sfärisk en organoid är (där en poäng på 1 = en perfekt sfär)18, liten variation inom och mellan organoider som genererats från kropps- eller antralbiopsivävnad (Figur 4B). Därför, även om det finns olika tillväxthastigheter, finns det vanligtvis inga signifikanta morfologiska skillnader mellan organoider som genereras från biopsivävnad i magkroppen eller antrum.
På dag 20 efter initiering är magorganoiderna vanligtvis redo att passeras. En stor organoidstorlek (≥1500 μm i diameter) eller ett mörkt inre (vilket tyder på omfattande cellomsättning) av organoiden är viktiga tecken på att organoider behöver passera (figur 5A). Organoider som lämnas kvar för att gå bortom denna punkt kan börja brytas ner till 2D-monolager (Figur 5B) som inte på ett tillförlitligt sätt återbildar organoider efter passering, vilket kan tyda på en förlust av livskraft eller stam. Efter att ha passerat och sått om magorganoider med hjälp av fragmenteringsprotokollet som beskrivs häri, kommer "kupolerna" att innehålla många organoidfragment (Figur 5C) som kommer att omorganisera sig till många fler organoider och växa mycket snabbare jämfört med den initiala sådden av enskilda celler (Figur 5D). Om organoidtillväxt fortfarande behöver karakteriseras och/eller standardiseras vid tidpunkten för passagen, kan magorganoider istället spjälkas till enstaka celler, som tidigare beskrivits19.
Figur 1: Generering av organoider som härrör från magsjuka patienter. Schematisk översikt som visar processen för att generera organoider från magpatienter från biopsier av godartat magepitel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Passage av organoider från magsjuka patienter. Schematisk översikt som illustrerar passage av ventrikelpatient-deriverade organoider genom fragmentering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bildning och tillväxt av organoider från magsjuka patienter. (A) Representativa z-projektionsbilder som visar tillväxten av magorganoider vid dag 10, 15 och 20 efter encellssådd. Bilderna är av organoider som genereras från magkroppen och antrumbiopsivävnad från samma patient. Skalstreck = 1 mm. (B) Medelantal (±SD) av ventrikelkroppar och antrumorganoider vid angivna tidpunkter efter encellssådd. (C) Medelarea (±SD) (μm2) för magkroppen och antrumorganoider vid angivna tidpunkter efter encellig sådd. n = 5 patienter per grupp och tidpunkt. * = statistiskt signifikant skillnad (p ≤ 0,05) vid den angivna tidpunkten. n.s. = ingen statistiskt signifikant skillnad vid den angivna tidpunkten. Statistiska jämförelser utförda via 2-vägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Gastrisk organoidmorfologi som härrör från patienter. (A) Representativa z-projektionsbilder av olika gastrisk organoidmorfologier från en individuell "kupol"/brunn av organoider från magkroppen vid dag 15 efter encellssådd. Skalstapel = 200 μm. (B) Medelvärde (±SD) för magkroppen och organoidsfäriciteten (där ett värde på 1 = en perfekt sfär). n = 5 patienter per grupp och tidpunkt. n.s. = ingen statistiskt signifikant skillnad vid någon tidpunkt. Statistiska jämförelser utförda via 2-vägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Gastrisk organoidpassage från patienter. (A) Representativ bild av organoider redo att passera på dag 20 efter encellssådd. (B) Representativ bild av organoider som är försenade för passage på dag 25 efter encellig sådd. (C) Representativ bild av fragmenterade organoider efter omsådd (passage 1 - dag 0). (D) Representativ bild av organoidtillväxt under 5 dagar efter återsådd (passage 1 - dag 5). Alla bilder är z-projektioner. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggstabell 1: Lösningar och medierecept. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri beskrivs ett detaljerat protokoll för att på ett tillförlitligt sätt generera humana magorganoider från enskilda celler isolerade från biopsier av godartat epitel från magkroppen och antrum. Kritiska steg i protokollet kretsar kring timing samt hantering av basalmembranmatrisen. För att bevara livskraften är det viktigt att initiera protokollet så snart som möjligt efter att biopsivävnaden har förvärvats. Målet är att börja smälta biopsivävnaden inom 30 minuter efter att biopsin utförts. Att hantera basalmembranmatrisen kan också vara utmanande. När den tinas på is förblir den en vätska; men vid temperaturer över 4 °C polymeriserar den. Därför måste man snabbt överföra basalmembranmatrisen från is för att blanda med enstaka celler eller organoidfragment för plätering av "kupoler" göras omedelbart, eftersom den börjar polymerisera inom en minut. När den väl har polymeriserats i ett rör kan den inte aspireras in i en pipettspets. Om detta inträffar kan röret placeras på is tills Matrigel depolymeriseras tillbaka till en vätska. När du försiktigt pipetterar upp och ner för att blanda enstaka celler eller organoidfragment med basalmembranmatrisen är det också viktigt att undvika att skapa bubblor. Även om bubblor i en "kupol" av basalmembranmatriser inte verkar hindra organoidbildning och tillväxt, kan de hindra visualisering. Dessutom, efter alikvotering av basalmembranmatrisen/cellblandningen i brunnen/brunnarna på en cellodlingsplatta, måste plattan vändas upp och ner och placeras i en inkubator. Detta steg är avgörande för att basalmembranmatrisen ska kunna polymeriseras till en 3D-"kupol"-form och förhindra att de enskilda cellerna eller organoidfragmenten sjunker till botten av plattan.
Med hjälp av detta protokoll kan magorganoider identifieras inom 10 dagar efter enkelcellssådd. Erfarenheten visar att mycket få nya magorganoider bildas efter dag 10, och i själva verket kan det totala antalet organoider minska något från dag 10-20. Detta gäller för organoider som genereras från både magkroppen och antrum. Det totala antalet organoider som bildas från gastriska antralbiopsier är dock betydligt högre än från magkroppsbiopsier. Dessutom överträffar tillväxten av antrala organoider kraftigt kroppsorganoider mellan dag 10-20 efter enkelcellssådd. Denna skillnad kan tillskrivas variationer i Wnt-känslighet. En nyligen genomförd studie visade att magkroppens PDO:er uppvisar bättre tillväxt med lägre Wnt-aktivering, medan gastric antrum PDO:er trivs med högre Wnt-aktivering20. Placeringen av magbiopsier som används för att generera magsäcks-PDO specificeras vanligtvis inte i litteraturen. Sådana skillnader bör beaktas i framtida studier som använder magsäcks-PDO som genereras från magbiopsier av olika magområden.
En annan viktig aspekt av detta protokoll är upprättandet av ett standardiserat antal enskilda celler att så per "kupol"/brunn för att på ett tillförlitligt sätt generera magsäcks-PDO. Medan en tidigare studie rapporterade ett standardiserat antal magkörtlar att fröa för PDO-generering, har inga tidigare studier med en enda cellnedbrytningsmetod nämnt antalet celler som såddes eller om antalet var konsekvent över olika PDO-linjer. Att misslyckas med att standardisera antalet celler som sås kan resultera i att ett mycket varierande antal stamceller sås per "kupol"/brunn. Eftersom stamceller är den primära källan till bildning av magorganoider kan detta leda till varierande organoidbildning och tillväxt. Att använda ett icke-standardiserat antal enskilda celler kan därför förvirra tolkningar av bildnings- eller tillväxtjämförelser mellan olika ventrikel-PDO-linjer. Här demonstreras att standardisering av antalet celler som sås till 105 celler per "kupol"/brunn på ett tillförlitligt sätt genererar magsäcks-PDO från biopsier av både kroppen och antrala regioner i magsäcken.
Detta protokoll optimerades för användning av färsk magbiopsivävnad. Följaktligen kan framgången för detta protokoll variera vid användning av fryst vävnad eller vävnad som bevarats på annat sätt. Dessutom finns det inga data om hur länge färska biopsier bibehåller livsdugligheten, eftersom biopsivävnaden bearbetas så snart som möjligt efter att den tagits bort från patientens mage. Förmodligen, ju längre den färska vävnaden sitter innan bearbetning, desto färre livskraftiga celler kommer att isoleras.
Passage av ventrikel-PDO via fragmentering, som beskrivs i detta protokoll, ger en enkel metod för rutinmässig passage. Även om magsäcks-PDO framgångsrikt har passerat upp till 4 gånger med denna teknik, har det inte gjorts några försök att avgöra hur många gånger de kan passera med bibehållen stadig tillväxt och livskraft. Vissa rapporter tyder på att tillväxten av magorganoider kan avta efter 5 eller fler passager21,22, medan andra har observerat tillförlitlig tillväxt för upp till 10 passager23.
De gastriska organoidmedier som används i detta protokoll innehåller Wnt-3A, noggin och R-spondin som härrör från konditionerade medier av L-WRN-celler. För att producera det konditionerade mediet används ett protokoll som beskrivs av Miyoshi och Stappenbeck16. Alternativt kan Wnt-3A, noggin och R-spondin köpas separat som rekombinanta proteiner. Att köpa de enskilda komponenterna separat är idealiskt för att undvika potentiella batcheffekter som kan uppstå vid användning av konditionerade medier från L-WRN-celler. Att köpa de rekombinanta proteinerna är dock dyrt och kan vara kostsamt för forskare som ofta arbetar med organoider.
Med tanke på den ökande användningen av magsäcksskyddade sub i olika tillämpningar är det lägligt och nödvändigt att fastställa standardiserade metoder för att generera godartade magsäcksskyddade suboter. Protokollet som beskrivs här erbjuder en tillförlitlig metod för framtida undersökningar med hjälp av magsäcksskyddade sub. Enligt vår erfarenhet har detta protokoll framgångsrikt genererat organoider från biopsier av godartad magslemhinna över 90 % av tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga relevanta upplysningar.
Acknowledgments
University of Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & BRCA-programmet vid Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H.
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S.
- Zhao, Z., et al.
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
