Suivi de l’apprentissage de la motricité fine et associative chez la souris à l’aide de l’échelle Erasmus

Summary

Cet article présente un protocole qui permet une évaluation non invasive et automatisée des performances de motricité fine, ainsi qu’un apprentissage moteur adaptatif et associatif lors de défis, à l’aide d’un dispositif appelé Erasmus Ladder. La difficulté de la tâche peut être titrée pour détecter une déficience motrice allant de degrés majeurs à subtils.

Abstract

Le comportement est façonné par les actions, et les actions nécessitent des habiletés motrices telles que la force, la coordination et l’apprentissage. Aucun des comportements essentiels au maintien de la vie ne serait possible sans la capacité de passer d’une position à une autre. Malheureusement, la motricité peut être compromise dans un large éventail de maladies. Par conséquent, l’étude des mécanismes des fonctions motrices aux niveaux cellulaire, moléculaire et des circuits, ainsi que la compréhension des symptômes, des causes et de la progression des troubles moteurs, sont cruciales pour développer des traitements efficaces. Des modèles de souris sont fréquemment utilisés à cette fin.

Cet article décrit un protocole qui permet de surveiller divers aspects de la performance motrice et de l’apprentissage chez la souris à l’aide d’un outil automatisé appelé l’échelle Erasmus. L’essai comporte deux phases : une phase initiale où les souris sont entraînées à naviguer sur une échelle horizontale construite à partir d’échelons irréguliers (« apprentissage de la motricité fine »), et une deuxième phase où un obstacle est présenté sur le chemin de l’animal en mouvement. La perturbation peut être inattendue (« apprentissage moteur contesté ») ou précédée d’une tonalité auditive (« apprentissage moteur associatif »). La tâche est facile à effectuer et est entièrement prise en charge par un logiciel automatisé.

Ce rapport montre comment les différentes lectures du test, lorsqu’elles sont analysées avec des méthodes statistiques sensibles, permettent un suivi fin de la motricité des souris à l’aide d’une petite cohorte de souris. Nous proposons que la méthode soit très sensible pour évaluer les adaptations motrices induites par des modifications environnementales ainsi que les déficits moteurs subtils à un stade précoce chez des souris mutantes dont les fonctions motrices sont compromises.

Introduction

Divers tests ont été mis au point pour évaluer les phénotypes moteurs chez la souris. Chaque test donne des informations sur un aspect spécifique du comportement moteur¹. Par exemple, le test en champ libre informe sur la locomotion générale et l’état d’anxiété ; les tests de Rotarod et de poutre de marche sur la coordination et l’équilibre ; L’analyse de l’empreinte est une question de démarche ; le tapis roulant ou la roue de course lors d’un exercice physique forcé ou volontaire ; Et la roue complexe concerne l’apprentissage de la motricité. Pour analyser les phénotypes moteurs de souris, les chercheurs doivent effectuer ces tests de manière séquentielle, ce qui implique beaucoup de temps et d’efforts et souvent plusieurs cohortes animales. S’il y a de l’information au niveau cellulaire ou des circuits, l’enquêteur opte normalement pour un test qui surveille un aspect connexe et suit à partir de là. Cependant, il n’existe pas de paradigmes qui discriminent différents aspects du comportement moteur de manière automatisée.

Cet article décrit un protocole d’utilisation de l’échelle Erasmus ^2,3, un système qui permet une évaluation complète d’une variété de caractéristiques d’apprentissage moteur chez la souris. Les principaux avantages sont la reproductibilité et la sensibilité de la méthode, ainsi que la capacité de titrer la difficulté motrice et de séparer les déficits de performance motrice des troubles de l’apprentissage moteur associatif. L’élément principal se compose d’une échelle horizontale avec une alternance d’échelons hauts (H) et bas (L) équipés de capteurs tactiles qui détectent la position de la souris sur l’échelle. L’échelle est composée de 2 x 37 échelons (L, 6 mm ; H, 12 mm) espacés de 15 mm l’un de l’autre et positionnés en alternance gauche-droite avec des intervalles de 30 mm (figure 1A). Les échelons peuvent être déplacés individuellement pour générer différents niveaux de difficulté, c’est-à-dire créer un obstacle (élever les échelons supérieurs de 18 mm). Couplée à un système d’enregistrement automatisé et associant des modifications du motif de l’échelon à des stimuli sensoriels, l’échelle Erasmus teste l’apprentissage de la motricité fine et l’adaptation des performances motrices en réponse à des défis environnementaux (apparition d’un échelon supérieur pour simuler un obstacle, un stimulus inconditionné [US]) ou association avec des stimuli sensoriels (une tonalité, un stimulus conditionné [CS]). Les tests comportent deux phases distinctes, chacune évaluant l’amélioration des performances motrices sur 4 jours, au cours desquelles les souris subissent une session de 42 essais consécutifs par jour. Dans la phase initiale, les souris sont entraînées à naviguer dans l’échelle pour évaluer l’apprentissage moteur « fin » ou « qualifié ». La deuxième phase consiste en des essais entrelacés où un obstacle sous la forme d’un échelon plus élevé est présenté sur la trajectoire de l’animal en mouvement. La perturbation peut être inattendue pour évaluer l’apprentissage moteur « défié » (essais uniquement aux États-Unis) ou annoncée par une tonalité auditive pour évaluer l’apprentissage moteur « associatif » (essais appariés).

L’échelle Erasmus a été développée relativement récemment ^2,3. Il n’a pas été largement utilisé car la mise en place et l’optimisation du protocole ont nécessité un effort ciblé et ont été spécifiquement conçus pour évaluer l’apprentissage associatif cérébelleux sans explorer en détail son potentiel à révéler d’autres déficits moteurs. À ce jour, il a été validé pour sa capacité à dévoiler des déficiences motrices subtiles liées à un dysfonctionnement cérébelleux chez la souris 3,4,5,6,7,8. Par exemple, les souris knock-out connexine36 (Cx36), où les jonctions lacunaires sont altérées dans les neurones olivaires, présentent des déficits de déclenchement dus à l’absence de couplage électrotonique, mais le phénotype moteur était difficile à identifier. Des tests à l’aide de l’échelle Erasmus ont suggéré que le rôle des neurones olivaires inférieurs dans une tâche d’apprentissage moteur cérébelleux est d’encoder un codage temporel précis des stimuli et de faciliter les réponses dépendantes de l’apprentissage à des événements inattendus ^3,4. La souris knock-out de la ribonucléoprotéine 1 messager de l’X fragile (Fmr1), un modèle du syndrome de l’X fragile (FXS), présente une déficience cognitive bien connue ainsi que des défauts plus légers dans la formation de la mémoire procédurale. Les éliminateurs Fmr1 n’ont montré aucune différence significative dans les temps de pas, les faux pas par essai ou l’amélioration des performances motrices au cours des sessions de l’échelle Erasmus, mais n’ont pas réussi à ajuster leur schéma de marche à l’obstacle apparaissant soudainement par rapport à leurs compagnons de portée de type sauvage (WT), confirmant des déficits spécifiques de la mémoire procédurale et associative ^3,5. De plus, des lignées mutantes de souris spécifiques à une cellule présentant des défauts de la fonction cérébelleuse, y compris une altération de la production de cellules de Purkinje, de potentialisation et de sortie d’interneurones de couche moléculaire ou de cellules granulaires, présentaient des problèmes de coordination motrice avec une altération de l’acquisition de schémas de pas efficaces et du nombre de pas effectués pour franchir l’échelle⁶. Les lésions cérébrales néonatales entraînent des déficits d’apprentissage cérébelleux et un dysfonctionnement des cellules de Purkinje qui pourraient également être détectés avec l’échelle Erasmus ^7,8.

Dans cette vidéo, nous présentons un guide complet étape par étape, qui détaille la configuration de la salle comportementale, le protocole de test comportemental et l’analyse des données ultérieure. Ce rapport est conçu pour être accessible et convivial et est conçu spécifiquement pour aider les nouveaux arrivants. Ce protocole donne un aperçu des différentes phases de l’entraînement moteur et des schémas moteurs attendus que les souris adoptent. Enfin, l’article propose un flux de travail systématique pour l’analyse des données à l’aide d’une puissante approche de régression non linéaire, complété par de précieuses recommandations et suggestions pour adapter et appliquer le protocole dans d’autres contextes de recherche.

Protocol

Dans la présente étude, des souris adultes (âgées de 2 à 3 mois) C57BL/6J des deux sexes ont été utilisées. Les animaux ont été logés de deux à cinq par cage avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau dans une unité animale sous observation et maintenus dans un environnement à température contrôlée selon un cycle d’obscurité et de lumière de 12 h. Toutes les procédures ont été menées conformément aux réglementations européennes et espagnoles (2010/63/UE ; RD 53/2013) et ont été approuvés par le Comité d’éthique de la Generalitat Valenciana et le Comité du bien-être animal de l’Université Miguel Hernández.

1. Configuration de la salle comportementale

1. Réservez la salle de test comportemental tous les jours à la même heure et établissez la liste et l’ordre des souris à utiliser, ainsi que les dispositions pour leur hébergement.
2. Gardez les souris expérimentales à l’extérieur de la salle de test afin qu’elles n’entendent pas les sons du compresseur d’air et les tonalités de l’échelle Erasmus lorsqu’elles ne sont pas testées.
3. Vérifiez que tous les composants du système Erasmus Ladder sont en ordre et prêts à l’emploi : le routeur réseau, l’ordinateur avec le logiciel (voir tableau des matériaux), le compresseur d’air, deux boîtes de but et l’échelle avec les barreaux correctement positionnés.
4. Nettoyez abondamment les boîtes de buts, l’échelle et les échelons avec de l’eau après chaque animal et avec de l’eau et de l’éthanol à 70 % à la fin de chaque journée d’entraînement.

2. Protocole de test comportemental

1. Créez une expérience et entrez le protocole dans le logiciel (figure supplémentaire S1).
   1. Mettez le logiciel sous tension.
   2. Pour créer une expérience, choisissez Fichier | Nouvelle expérience | Nouveau ou configuré | Protocole d’expérimentation.
      REMARQUE : Le protocole par défaut, utilisé dans cette étude, est nommé EMC et a été conçu au Centre médical universitaire Erasmus de Rotterdam.
   3. Donnez un nom à l’expérience et cliquez sur OK.
   4. Vérifiez que le protocole EMC par défaut sélectionné se compose de 4 jours de sessions non perturbées (42 essais non perturbés par jour) et de 4 jours de sessions de provocation (42 essais mixtes quotidiens : non perturbés, CS uniquement (tonalité), US uniquement (obstacle), appariés (obstacle annoncé par la tonalité) (voir Figure 1B). Dans le panneau latéral droit, vérifiez également le signal lumineux (durée maximale de 3 s), le signal aérien (durée maximale de 45 s) et le vent arrière (Oui dans tous les types d’essai), utilisés pour encourager la souris à traverser l’échelle, et la tonalité (250 ms, Oui uniquement dans les essais CS uniquement et appariés).
   5. Pour créer un autre protocole, choisissez Configurer | Protocole d’expérience | Nouveau | À partir de zéro ou copier à partir du protocole EMC et le modifier simplement, en éditant les lignes du tableau relatives au nombre de sessions (jours d’expérience) et au nombre et au type d’essais par jour.
      REMARQUE : Le temps de repos, le type et l’activation des repères, la durée, l’intensité et l’intervalle peuvent également être adaptés en fonction des questions expérimentales.
   6. Pour ouvrir la liste des sessions et nommer les sujets, choisissez Configuration | Liste des sessions.
   7. Cliquez sur Ajouter des sujets et des variables.
   8. Entrez chaque identifiant de souris, date de naissance, sexe, génotype et catégories pertinentes, en suivant la liste ordonnée des souris.
2. Démarrez la session (figure supplémentaire S2).
   1. Avant de commencer, vérifiez que le logiciel est ouvert, puis allumez l’échelle.
   2. Vérifiez que le compresseur d’air est connecté et allumé.
   3. Pour ouvrir la fenêtre Acquisition, ouvrez l’expérience créée.
   4. Choisissez l’acquisition | Ouvrir l’acquisition.
   5. Placez la souris avec l’identifiant indiqué par le logiciel dans la case de départ de l’objectif (côté droit de l’échelle).
   6. Sélectionnez l’identifiant de la souris à acquérir lors de la première session.
   7. Cliquez sur Démarrer l’acquisition.
   8. Appuyez 3 fois sur le bouton rouge du menu de l’échelle . Vérifiez que la session démarre et contrôle et enregistre automatiquement les mouvements de la souris jusqu’à la fin de la dernière période d’essai de la session.
3. Mettez fin à la session.
   1. Vérifiez qu’à la fin de la 42^e essai, l’écran affiche les messages Envoi de données et Acquis.
   2. Remettez la souris dans la cage d’accueil.
   3. Nettoyez l’échelle et les boîtes de but.
   4. Placez la souris suivante et répétez à partir de l’étape 2.2.6.
4. Effectuez le type de session sélectionné tous les jours jusqu’à la fin du protocole. Répétez les étapes 2.2 et 2.3 tous les jours selon le protocole sélectionné.
5. Exportez les données (figure supplémentaire S2).
   1. Pour visualiser les données enregistrées, choisissez dans le menu Analyse , Statistiques d’essai, Statistiques de session et Statistiques et graphiques de groupe.
      REMARQUE : Les données peuvent être téléchargées sous forme de feuille de calcul avec les données des essais individuels et les moyennes des mêmes types d’essais au cours d’une session. Les sessions peuvent également être filtrées en fonction des variables choisies pour une analyse spécifique.
   2. Cliquez sur le bouton Exporter dans le coin supérieur droit, en choisissant le format de fichier (feuille de calcul) et l’emplacement du dossier.
   3. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur les graphiques générés automatiquement et sélectionnez Enregistrer dans un fichier au format *.jpg.

3. Analyse des données

REMARQUE : Une liste de paramètres est automatiquement mesurée par l’échelle Erasmus sur la base de l’enregistrement instantané des activités des capteurs tactiles. Pour l’analyse, les paramètres de sortie sélectionnés par l’utilisateur sont organisés et traités dans les feuilles de calcul. En plus des graphiques générés par logiciel, les utilisateurs peuvent générer des graphiques à l’aide du logiciel graphique de leur choix pour visualiser les changements spécifiques de différents paramètres au cours des sessions.

1. Choisissez des paramètres spécifiques pour analyser la motivation de base ou les états d’anxiété, les réponses sensorielles, les performances motrices et l’apprentissage de la motricité fine au cours des 4 premiers jours.
   1. Sélectionnez et tracez les paramètres de contrôle, y compris le temps de repos dans la zone de but et le temps de sortie de la boîte de but après la période de repos en réponse aux signaux de lumière et d’air (Figure 2A).
      REMARQUE : Les temps de repos ou de réponse aux signaux sont relativement constants chez les souris WT. D’autres paramètres tels que la fréquence des sorties sont fondamentalement négligeables chez les souris WT - les animaux quittent rarement la boîte de repos sans les signaux ou reviennent une fois dans l’échelle, ce qui entraîne des fréquences de sortie égales à 1 par essai. Si un animal sort avant que les signaux ne soient appliqués, un flux d’air est activé, forçant la souris à revenir à la boîte de but ; Ceci n’est pas considéré comme une version d’essai par le logiciel.
   2. Sélectionnez et tracez le temps passé sur l’échelle après les repères, mesuré comme le temps passé à traverser l’échelle une fois que la souris a quitté la boîte de but (Figure 2B).
      REMARQUE : Une régression non linéaire de puissance est une méthode robuste d’évaluation de l’apprentissage. Les coefficients de Pearson ou de Spearman (R) permettront de déterminer si l’ajustement des données est bon (valeurs R proches de un lorsque les animaux apprennent/s’améliorent au fil des sessions ; Les valeurs R proches de 0 impliquent que les données sont constantes et que les souris n’apprennent pas).
   3. Sélectionnez et tracez les paramètres du modèle de pas à pas , tels que le pourcentage d’essais avec des faux pas en tant que paramètre d’apprentissage sensible (Figure 2C).
      1. Définissez un pas correct comme un pas d’un échelon haut à un autre échelon haut (H-H), quelle que soit la longueur du pas. Considérez les types de pas qui impliquent un échelon inférieur comme des faux pas.
      2. Divisez les pas corrects et les faux pas en pas courts et longs, en pas en arrière et en sauts en fonction de la longueur et de la directionnalité du pas entre les échelons enfoncés (voir Figure 1A).
2. Sélectionner et tracer des paramètres spécifiques pour évaluer l’apprentissage moteur (essais aux États-Unis uniquement) et l’apprentissage associatif (essais par paires) au cours des 4 derniers jours.
   1. Sélectionnez et tracez l’heure sur l’échelle après les repères (Figure 3).
   2. Sélectionnez et tracez le pourcentage d’essais comportant des faux pas (Figure 4A).
   3. Sélectionnez et tracez les temps de pas avant et après la perturbation, définis comme une différence de précision ms entre l’activation de l’échelon juste avant (étape de contrôle) et après l’obstacle (étape adaptée) du même côté de l’échelle (Figure 4B).
      REMARQUE : Une analyse des temps de pas avant et après la perturbation doit être effectuée pour comparer les données à l’intérieur de chaque type de session. Le paramètre mesure la capacité des souris à prédire et à surmonter les obstacles lors de l’apprentissage associatif.
3. Analysez les données à l’aide d’un logiciel statistique dédié (par exemple, SigmaPlot). Effectuez une analyse de régression non linéaire des données collectées à partir du même type d’essai à travers les sessions pour décrire le processus d’apprentissage plus efficacement et utilisez l’ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles (RM) pour comparer les types d’essais.

Representative Results

Le dispositif Erasmus Ladder, la configuration et le protocole appliqué sont présentés à la figure 1. Le protocole se compose de quatre séances non perturbées et de quatre séances de provocation (42 essais chacune). Chaque essai est une course sur l’échelle entre les boîtes de but de départ et d’arrivée. Au début de la session, une souris est placée dans l’une des cases de départ. Après un temps réglé de 15 ± 5 s (état « repos »), la lumière s’allume (repère 1, pour un maximum de 3 s). Un signal d’air léger (signal 2, 45 s maximum) est ensuite appliqué pour encourager les souris à quitter la boîte et à marcher jusqu’à l’extrémité opposée. Le temps de réponse au signal d’air peut varier d’une souris et d’une session à l’autre et peut être utilisé comme paramètre pour comparer les états de motivation ou d’anxiété entre les groupes. Un nouvel essai est immédiatement lancé une fois que la souris a atteint la boîte d’objectif de fin.

Aucune différence dans le temps de repos et le temps de réponse au signal lumineux n’a été observée chez les souris WT entre les jours 1 à 4, mais le temps de réponse au signal d’air a légèrement diminué entre les jours 1 et 2 (Figure 2A). Les mesures du temps nécessaire pour franchir l’échelle ont donné une courbe d’apprentissage significative des jours 1 à 4 qui a pu être ajustée avec une courbe de régression de puissance (R = 0,50, *p = 0,047, Figure 2B). Un paramètre clé qui détermine le temps nécessaire pour franchir l’échelle est l’occurrence des faux pas. Parallèlement à la réduction du temps passé sur l’échelle, le nombre d’essais où les souris ont fait des faux pas a diminué au cours des sessions non perturbées, car les souris ont appris à marcher sur les échelons supérieurs (marches H-H) et à éviter les échelons inférieurs comme un modèle plus efficace pour traverser l’échelle (R = 0,90, ***p < 0,0001, Figure 2C).

Du 5e au 8e jour, les souris ont été soumises à des séances de défi au cours desquelles un obstacle inattendu (US) a été introduit (un échelon est soulevé au hasard de 18 mm au-dessus de la surface de marche). Dans certains essais, une tonalité (CS, 90 dB, tonalité de 15 kHz d’une durée de 250 ms) est présentée 250 ms avant la perturbation US (voir la figure 1B).

Avec le début des séances de défi le jour 5, les animaux ont eu besoin de plus de temps pour franchir l’échelle lors des essais aux États-Unis uniquement en raison de l’introduction imprévue de l’obstacle (jour 4 : 5,01 s ; Graphique 2B ; Jour 5 : 7.84 s ; Graphique 3 ; test t apparié*paire,*p < 0,039). Les performances de la souris se sont améliorées entre les jours 5 et 8, ce qui a donné lieu à une courbe d’apprentissage significative dans les sessions réservées aux États-Unis (R = 0,50, *p = 0,045, Figure 3, orange). Dans les essais d’apprentissage associatif, où l’obstacle était associé à une tonalité, les animaux ont terminé les séances quotidiennes beaucoup plus rapidement par rapport aux essais aux États-Unis uniquement (R = 0,63, Figure 3, violet ; ANOVA RM à deux facteurs, *p = 0,028). Enfin, dans les essais témoins où la tonalité était présentée seule (CS uniquement), une courbe d’apprentissage significative qui ressemblait à des séances non perturbées a été rapportée (R = 0,82, ***p < 0,001, Figure 3, bleu).

L’analyse des modèles d’étapes a fourni une confirmation supplémentaire et une sensibilité accrue dans la détection des différences entre les essais aux États-Unis et les essais associatifs. La figure 4A montre comment le pourcentage d’essais avec des faux pas est resté constant tout au long des essais aux États-Unis uniquement (R = 0,01, p = 0,90, orange), tandis qu’une diminution significative des essais avec des faux pas a été observée pendant les séances appariées (R = 0,61, *p = 0,01, violet). La figure 4B montre une différence significative entre les temps d’étape avant et après la perturbation dans les essais aux États-Unis uniquement (ANOVA RM à deux facteurs, *p = 0,05), mais pas dans les essais appariés où les souris ont appris plus rapidement à surmonter l’obstacle. Toutes les variables étudiées et les tests statistiques appliqués sont présentés dans le tableau supplémentaire S1.

Figure 1 : Système, protocole et paramètres. (A) L’échelle Erasmus se compose d’une échelle horizontale flanquée de deux boîtes de but. Le dessin animé représente l’échelle avec une alternance d’échelons hauts et bas et les principaux paramètres enregistrés, y compris les types de pas (pas normaux, ligne remplie ; ou faux pas, ligne pointillée) et le temps de pas pré et post perturbation défini comme le temps dont la souris a besoin pour franchir un obstacle (stimulus inconditionné ; échelon supérieur) annoncé ou non par une tonalité (stimulus conditionné). (B) Le protocole se compose de quatre séances non perturbées et de quatre séances de provocation (une séance/jour, 42 essais/séance) qui permettent d’analyser séparément l’apprentissage de la motricité fine (non perturbé et CS uniquement en bleu), l’apprentissage moteur défié (États-Unis uniquement, en orange) et l’apprentissage moteur associatif (CS + US appariés, en violet). Abréviations : H = élevé ; L = faible ; CS = stimulus conditionné ; États-Unis = relance inconditionnée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Performances motrices des souris WT pendant des sessions non perturbées. (A) Temps de repos dans la zone de but (constante, 15 s), temps de réponse aux signaux : lumière (constante, 3 s) et air (variable) ; au cours des jours 1 à 4 de séances non perturbées. (B) Temps de traverser l’échelle après le signal (lumière et air) pendant les sessions non perturbées. (C) Pourcentage d’essais au cours de chaque session sans perturbation où l’animal a manqué une étape. Une analyse de régression de puissance a été utilisée pour étudier les progrès de l’apprentissage (R = 0,50 : *p = 0,047, R = 0,90 ***p < 0,0001, respectivement, n = 4 souris). Abréviation : WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Performances des souris WT pendant les séances de provocation. Temps moyen passé sur l’échelle après les signaux au cours des jours 5 à 8 pour les essais aux États-Unis uniquement (orange), appariés (violet) et CS uniquement (bleu clair). Une analyse de régression non linéaire de puissance a été utilisée pour étudier les progrès de l’apprentissage (*p = 0,047, **p = 0,0093, ***p < 0,001, n=4 souris). ANOVA RM bidirectionnelle pour comparer les types d’essais (*p = 0,028, **p = 0,008, n = 4 souris, deux mâles et deux femelles, moyenne ± SEM). Abréviations : CS = stimulus conditionné ; États-Unis = relance inconditionnée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Changements dans les modèles de pas de la souris au cours des sessions de défi. (A) Pourcentage d’essais par session où l’animal a manqué une étape pendant les sessions aux États-Unis uniquement et en binôme. Une analyse de régression de puissance a été utilisée pour étudier le processus d’apprentissage (*p = 0,013) et une ANOVA RM bidirectionnelle pour la comparaison entre les types d’essais (*p = 0,032, n = 4 souris). (B) Temps de pas avant et après la perturbation dans les sessions aux États-Unis uniquement et en binôme tout au long des sessions. ANOVA à mesures répétées à deux facteurs, *p < 0,05, n = 4 souris, deux mâles et deux femelles, moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Interface logicielle : comment créer une expérience et sélectionner un protocole. Captures d’écran du logiciel illustrant le flux de travail décrit à l’étape 2.1 du protocole, couvrant les étapes 2.1.4 à 2.1.8. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Interface du logiciel : comment démarrer la session et exporter les données. Captures d’écran du logiciel illustrant le flux de travail décrit dans les étapes 2.2 et 2.5 du protocole, couvrant les étapes 2.2.4 à 2.2.7 et 2.5.1 à 2.5.3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Tableau statistique. Description de toutes les variables étudiées et des tests statistiques appliqués, présentés à la figure 2B, C, à la figure 3 et à la figure 4A, B. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’échelle Erasmus présente des avantages majeurs pour l’évaluation du phénotype moteur au-delà des approches actuelles. Les tests sont faciles à réaliser, automatisés, reproductibles et permettent aux chercheurs d’évaluer divers aspects du comportement moteur séparément à l’aide d’une seule cohorte de souris. Dans la présente étude, la reproductibilité a permis de générer des données robustes avec un petit nombre de souris WT tirant parti des caractéristiques du dispositif, de la conception expérimentale et des méthodes d’analyse. Par exemple, par rapport aux essais traditionnels de marche en faisceau, l’ajout d’indices de motivation (air et lumière) pour entrer dans le chemin de l’échelle et le vent arrière pour terminer l’essai augmente la cohérence et évite la nécessité de l’intervention de l’expérimentateur qui est une source majeure de variabilité.

Un système de compresseur d’air est nécessaire pour générer un flux d’air qui peut être ajusté à la direction et à la position de la souris. Le flux d’air crée un vent de face de 30 km/h dans la direction opposée lorsqu’une souris tente de quitter la boîte de but avant le début de l’essai prévu, ce qui fait que les souris retournent dans la boîte de but. Il génère également un vent arrière constant (1 à 16 km/h) pendant l’essai jusqu’à ce que la souris traverse complètement l’échelle et entre dans la zone de but opposée. Sans l’air sous pression comme incitation à traverser l’échelle, les souris s’arrêtent fréquemment sur les barreaux et inversent les directions à un rythme tranquille, ce qui introduit une variable exploratoire contre-productive pour l’analyse.

Le protocole standard décrit ici fournit des mesures de la coordination et de l’apprentissage de base de la motricité fine (séances non perturbées), ainsi que de l’adaptation aux défis et de l’apprentissage moteur associatif (séances de provocation) sur une période de 8 jours. La tâche est facile pour les souches de souris WT généralement utilisées pour les études de neurosciences telles que les souris C57Bl6J utilisées ici, et est sûre, aucune blessure n’ayant été observée dans aucune des sessions de test. De plus, nous n’avons pas détecté de signes de fatigue par rapport à d’autres tests moteurs tels que le rotarod ou le tapis roulant.

Au cours de la phase initiale de 4 jours, les souris WT maîtrisent la compétence et franchissent l’échelle en apprenant à adopter le schéma de course le plus efficace (étapes H-H) et les faux pas se produisent rarement au jour 4 (Figure 2B, C). Au jour 5 de la deuxième phase, les souris sont plus lentes lorsqu’elles rencontrent l’obstacle pour la première fois, mais s’adaptent rapidement (Figure 3, États-Unis uniquement). Le couplage de l’obstacle avec un stimulus conditionnant (tonalité) facilite l’apprentissage dans la mesure où la durée de l’essai est égale à celle des essais où l’obstacle n’est pas présenté (Figure 3, apparié). Il convient de noter que le nombre d’essais avec faux pas est demeuré constant tout au long des essais aux États-Unis uniquement (Figure 4A), tandis qu’une diminution significative a été observée dans les séances en binôme (Figure 4A), confirmant l’efficacité du processus d’apprentissage associatif.

Nous proposons un workflow pour l’analyse des paramètres représentatifs fournis par le logiciel Erasmus Ladder. L’analyse de régression de puissance nous a permis d’enregistrer des courbes d’apprentissage significatives et de détecter des différences entre l’apprentissage contesté et l’apprentissage associatif en utilisant quatre souris WT. Sur la base d’une littérature supplémentaire et d’expériences pilotes, les plans expérimentaux impliquant des souris mutantes ou traitées pourraient nécessiter une augmentation du nombre de souris à 7-10 souris ^4,5,6. Entre nos mains, 42 essais par session était un nombre optimal pour obtenir des données robustes avec une petite cohorte de souris, car la moyenne de plusieurs essais diminue la variabilité. Bien que le nombre puisse sembler élevé, chaque session d’essai de 42 prend entre 15 et 35 minutes, et 12 à 16 souris peuvent être raisonnablement testées par jour. La durée de l’essai (y compris le temps de repos et la réponse aux signaux ainsi que le temps nécessaire pour traverser l’échelle) varie entre 20 s et 50 s, selon le jour de l’entraînement et le type d’essai.

Néanmoins, la polyvalence du système permettra aux chercheurs de concevoir des protocoles personnalisés en ajustant divers paramètres, notamment le nombre de séances et d’essais par jour, l’intensité et la durée des signaux et des CS, ainsi que la nature des États-Unis. Par exemple, nos données ont montré une courbe d’apprentissage rapide chez les souris WT, en particulier entre le jour 1 et le jour 2 après que les performances aient atteint un plateau (figures 2B, C). Cela suggère que les 2 jours supplémentaires pourraient ne pas être strictement nécessaires pour tester l’apprentissage moteur de base dans des sessions non perturbées, et que des modifications du protocole standard peuvent être mises en œuvre en réduisant la durée de l’entraînement à seulement 2 jours. Pourtant, cette adaptation pourrait ne pas convenir à la deuxième phase du protocole, qui comprend des essais entrelacés non perturbés, aux États-Unis uniquement, CS uniquement et appariés. Les stimuli sont présentés de manière aléatoire et inattendue pour évaluer des comportements spécifiques, et la nécessité de diviser les essais expérimentaux en ces quatre catégories fait de 42 un nombre approprié d’essais requis pour la puissance statistique. Par conséquent, une réorganisation du protocole devrait permettre d’évaluer la faisabilité de réduire le nombre d’essais non perturbés ou d’augmenter le nombre d’essais de provocation spécifiques. L’intervalle inter-stimulus (ISI) entre CS (tonalité de 90 dB, 15 kHz) et US, fixé ici à 250 ms, peut également être modifié pour étudier l’association stimulus-réponse. Ce type d’ajustement permettrait aux chercheurs de titrer le niveau de difficulté ou de se concentrer sur différents comportements en fonction de la question scientifique.

Jusqu’à présent, l’échelle Erasmus a surtout été utilisée pour détecter des défauts subtils de coordination motrice d’origine cérébelleuse. Par exemple, les faux pas sont une mesure de la coordination locomotrice de l’ensemble du corps. Dans cette étude, de jeunes souris adultes ont été utilisées, mais des souris aussi jeunes que P23 ont été utilisées par d’autres pour étudier la maturation des fonctions locomotrices ^7,8. Les pathologies ipsilatérales d’origine centrale ont pu être étudiées par une analyse discriminative de la position des pattes droite et gauche de la souris. Enfin, la maîtrise de la motricité dans l’échelle Erasmus engage probablement d’autres circuits de contrôle moteur, impliquant les ganglions de la base, le cortex moteur et les voies de connexion, y compris le corps calleux. La combinaison de ce paradigme comportemental avec des techniques cellulaires, moléculaires et de circuits sera utile pour étudier les mécanismes de circuit qui interviennent dans l’adaptation motrice et peuvent être exploités pour stimuler l’apprentissage moteur. Un tel exemple serait d’étudier l’influence sur la myélinisation axonale, qui est très sensible à l’acquisition de la motricité fine dans des modèles murins de démyélinisation ^9,10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.