Summary
Bu makale, Erasmus Merdiveni adı verilen bir cihaz kullanılarak, ince motor performansın non-invaziv ve otomatik bir değerlendirmesinin yanı sıra zorluklar üzerine uyarlanabilir ve çağrışımsal motor öğrenmeye izin veren bir protokol sunmaktadır. Görev zorluğu, majörden ince derecelere kadar değişen motor bozukluğunu tespit etmek için titre edilebilir.
Abstract
Davranış, eylemlerle şekillenir ve eylemler güç, koordinasyon ve öğrenme gibi motor becerileri gerektirir. Yaşamı sürdürmek için gerekli olan davranışların hiçbiri, bir pozisyondan diğerine geçiş yeteneği olmadan mümkün olmazdı. Ne yazık ki, motor beceriler çok çeşitli hastalıklarda tehlikeye girebilir. Bu nedenle, hücresel, moleküler ve devre seviyelerinde motor fonksiyonların mekanizmalarını araştırmak ve motor bozuklukların semptomlarını, nedenlerini ve ilerlemesini anlamak, etkili tedaviler geliştirmek için çok önemlidir. Fare modelleri bu amaçla sıklıkla kullanılır.
Bu makale, Erasmus Merdiveni adı verilen otomatik bir araç kullanılarak farelerde motor performansın ve öğrenmenin çeşitli yönlerinin izlenmesine izin veren bir protokolü açıklamaktadır. Tahlil iki aşamadan oluşur: farelerin düzensiz basamaklardan oluşan yatay bir merdivende ("ince motor öğrenme") gezinmek için eğitildiği bir başlangıç aşaması ve hareket eden hayvanın yolunda bir engelin sunulduğu ikinci bir aşama. Tedirginlik beklenmedik olabilir ("zorlu motor öğrenme") veya öncesinde işitsel bir ton ("çağrışımsal motor öğrenme") olabilir. Görevin yürütülmesi kolaydır ve otomatik yazılım tarafından tam olarak desteklenir.
Bu rapor, hassas istatistiksel yöntemlerle analiz edildiğinde, testten elde edilen farklı okumaların, küçük bir fare kohortu kullanılarak fare motor becerilerinin iyi izlenmesine nasıl izin verdiğini göstermektedir. Yöntemin, çevresel modifikasyonların neden olduğu motor adaptasyonlarının yanı sıra, motor fonksiyonlarından ödün veren mutant farelerde erken evre ince motor eksikliklerini değerlendirmek için oldukça hassas olacağını öneriyoruz.
Introduction
Farelerde motor fenotipleri değerlendirmek için çeşitli testler geliştirilmiştir. Her test, motor davranışın belirli bir yönü hakkında bilgi verir1. Örneğin, açık alan testi genel hareket ve kaygı durumu hakkında bilgi verir; rotarod ve yürüyen kiriş koordinasyon ve denge testleri; Ayak izi analizi yürüyüşle ilgilidir; zorla veya gönüllü fiziksel egzersizde koşu bandı veya koşu tekerleği; Ve karmaşık tekerlek, motor beceri öğrenimi ile ilgilidir. Fare motor fenotiplerini analiz etmek için, araştırmacılar bu testleri sırayla yapmalıdır, bu da çok fazla zaman ve çaba ve genellikle birkaç hayvan kohortu gerektirir. Hücresel veya devre düzeyinde bilgi varsa, araştırmacı normalde ilgili bir yönü izleyen ve oradan takip eden bir testi tercih eder. Bununla birlikte, motor davranışın farklı yönlerini otomatik bir şekilde ayırt eden paradigmalar eksiktir.
Bu makale, farelerde çeşitli motor öğrenme özelliklerinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesine izin veren bir sistem olan Erasmus Ladder 2,3'ü kullanmak için bir protokolü açıklamaktadır. Başlıca avantajları, yöntemin tekrarlanabilirliği ve duyarlılığının yanı sıra motor zorluğu titre etme ve motor performanstaki eksiklikleri bozulmuş ilişkisel motor öğrenmeden ayırma yeteneğidir. Ana bileşen, farenin merdiven üzerindeki konumunu algılayan dokunmaya duyarlı sensörlerle donatılmış, alternatif yüksek (H) ve alçak (L) basamaklara sahip yatay bir merdivenden oluşur. Merdiven 2 x 37 basamaktan (L, 6 mm; H, 12 mm) birbirinden 15 mm aralıklı ve 30 mm boşluklu sol-sağ dönüşümlü olarak konumlandırılmıştır (Şekil 1A). Basamaklar, çeşitli zorluk seviyeleri oluşturmak, yani bir engel oluşturmak (yüksek basamakları 18 mm yükseltmek) için ayrı ayrı hareket ettirilebilir. Otomatik bir kayıt sistemi ve basamak modelinin modifikasyonlarını duyusal uyaranlarla ilişkilendiren Erasmus merdiveni, çevresel zorluklara yanıt olarak ince motor öğrenme ve motor performansın adaptasyonunu test eder (bir engeli simüle etmek için daha yüksek bir basamağın görünümü, koşulsuz bir uyaran [US]) veya duyusal uyaranlarla ilişki (bir ton, koşullu bir uyaran [CS]). Test, her biri 4 gün boyunca motor performansındaki iyileşmeyi değerlendiren iki farklı aşamadan oluşur ve bu süre zarfında fareler günde 42 ardışık denemeden oluşan bir seansa tabi tutulur. İlk aşamada, fareler "ince" veya "yetenekli" motor öğrenmeyi değerlendirmek için merdivende gezinmek üzere eğitilir. İkinci aşama, hareket eden hayvanın yolunda daha yüksek bir basamak şeklinde bir engelin sunulduğu aralıklı denemelerden oluşur. Tedirginlik, "zorlu" motor öğrenmeyi (yalnızca ABD'de yapılan denemeler) değerlendirmek için beklenmedik olabilir veya "çağrışımsal" motor öğrenmeyi değerlendirmek için işitsel bir tonla duyurulabilir (Eşleştirilmiş denemeler).
Erasmus merdiveni nispeten yakın zamanda geliştirilmiştir 2,3. Protokolün kurulması ve optimize edilmesi odaklanmış çaba gerektirdiğinden ve diğer motor eksiklikleri ortaya çıkarma potansiyelini ayrıntılı olarak araştırmadan serebellara bağımlı ilişkisel öğrenmeyi değerlendirmek için özel olarak tasarlandığından yaygın olarak kullanılmamıştır. Bugüne kadar, farelerde serebellar disfonksiyona bağlı ince motor bozuklukları ortaya çıkarma kabiliyeti ile doğrulanmıştır 3,4,5,6,7,8. Örneğin, olivary nöronlarında boşluk bağlantılarının bozulduğu connexin36 (Cx36) nakavt fareleri, elektrotonik eşleşme eksikliği nedeniyle ateşleme açıkları gösterir, ancak motor fenotipinin tam olarak belirlenmesi zordu. Erasmus merdiveni kullanılarak yapılan testler, serebellar motor öğrenme görevinde inferior olivary nöronlarının rolünün, uyaranların kesin zamansal kodlamasını kodlamak ve beklenmedik olaylara öğrenmeye bağlı tepkileri kolaylaştırmak olduğunu göstermiştir 3,4. Frajil X Sendromu (FXS) için bir model olan Frajil X Messenger Ribonükleoprotein 1 (Fmr1) nakavt faresi, prosedürel bellek oluşumunda daha hafif kusurlarla birlikte iyi bilinen bir bilişsel bozukluk sergiler. Fmr1 nakavtları, Erasmus Merdiveni'ndeki seanslara göre adım sürelerinde, deneme başına yanlış adımlarda veya motor performans iyileşmesinde önemli bir fark göstermedi, ancak yürüme düzenlerini vahşi tip (WT) yavrularına kıyasla aniden ortaya çıkan engele göre ayarlayamadıve bu da belirli prosedürel ve çağrışımsal bellek eksikliklerini doğruladı 3,5. Ayrıca, bozulmuş Purkinje hücre çıkışı, potansiyasyon ve moleküler tabaka internöron veya granül hücre çıktıları dahil olmak üzere serebellar fonksiyonda kusurları olan hücreye özgü fare mutant hatları, verimli adım modellerinin değişmiş edinimi ile motor koordinasyonda ve merdiveni geçmek için atılan adım sayısında problemler sergiledi6. Yenidoğan beyin hasarı, serebellar öğrenme eksikliklerine ve Erasmus Merdiveni 7,8 ile de tespit edilebilen Purkinje hücre disfonksiyonuna neden olur.
Bu videoda, davranış odasının kurulumunu, davranışsal test protokolünü ve sonraki veri analizini ayrıntılarıyla anlatan kapsamlı bir adım adım kılavuz sunuyoruz. Bu rapor, erişilebilir ve kullanıcı dostu olacak şekilde hazırlanmıştır ve özellikle yeni gelenlere yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Bu protokol, motor eğitiminin farklı aşamaları ve farelerin benimsediği beklenen motor kalıpları hakkında fikir verir. Son olarak, makale, protokolün diğer araştırma bağlamlarına uyarlanması ve uygulanması için değerli öneriler ve önerilerle tamamlanmış, güçlü bir doğrusal olmayan regresyon yaklaşımı kullanarak veri analizi için sistematik bir iş akışı önermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada, her iki cinsiyetten yetişkin (2-3 aylık) C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Hayvanlar, gözlem altındaki bir hayvan ünitesinde yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan kafes başına iki ila beş barındırıldı ve 12 saatlik bir karanlık/aydınlık döngüsünde sıcaklık kontrollü bir ortamda tutuldu. Tüm prosedürler Avrupa ve İspanyol yönetmeliklerine (2010/63/UE; RD 53/2013) ve Generalitat Valenciana Etik Komitesi ve Universidad Miguel Hernández'in hayvan refahı komitesi tarafından onaylandı.
1. Davranışsal oda kurulumu
- Davranışsal test odasını her gün aynı saatte rezerve edin ve kullanılacak farelerin listesini ve sırasını ve bunların barındırılması için düzenlemeleri belirleyin.
- Deney farelerini test odasının dışında tutun, böylece test edilmediklerinde hava kompresörünün ve Erasmus Merdiveni seslerini duymazlar.
- Erasmus Ladder sisteminin tüm bileşenlerinin düzenli ve kullanıma hazır olup olmadığını kontrol edin: ağ yönlendiricisi, yazılımın bulunduğu bilgisayar (Malzeme Tablosuna bakınız), hava kompresörü, iki hedef kutusu ve basamakları uygun şekilde yerleştirilmiş merdiven.
- Kale kutularını, merdiveni ve basamakları her hayvandan sonra suyla ve her antrenman gününün sonunda su ve% 70 etanol ile kapsamlı bir şekilde temizleyin.
2. Davranışsal test protokolü
- Bir deney oluşturun ve protokolü yazılıma girin (Ek Şekil S1).
- Yazılımı açın.
- Deneme oluşturmak için Dosya | Yeni deney | Yeni veya Kurulum | Deney protokolü.
NOT: Bu çalışmada kullanılan varsayılan protokol EMC olarak adlandırılmıştır ve Rotterdam'daki Erasmus Üniversitesi Tıp Merkezi'nde tasarlanmıştır. - Denemeye bir ad verin ve Tamam'ı tıklatın.
- Seçilen varsayılan EMC protokolünün 4 günlük kesintisiz oturumlardan (günde 42 kesintisiz deneme) ve 4 günlük meydan okuma oturumlarından (42 günlük karma deneme: bozulmamış, yalnızca CS (ton), yalnızca ABD (engel), Eşleştirilmiş (tonla duyurulan engel) oluştuğunu kontrol edin (bkz. Şekil 1B). Sağ taraftaki panelde, fareyi merdiveni geçmeye teşvik etmek için kullanılan ışık işaretini (maksimum 3 sn süre), hava işaretini (maksimum 45 sn maksimum süre) ve arka rüzgarı (tüm deneme türlerinde Evet) ve tonu (250 ms, Yalnızca CS ve Eşleştirilmiş denemelerde Evet) kontrol edin.
- Farklı bir protokol oluşturmak için Kurulum | Deney protokolü | Yeni | Sıfırdan veya EMC protokolünden kopyalayın ve basitçe değiştirin, oturum sayısı (deney günleri) ve günlük deneme sayısı ve türü ile ilgili tablo satırlarını düzenleyin.
NOT: Dinlenme süresi, ipucu tipi ve aktivasyonu, süre, yoğunluk ve aralık da deneysel sorulara göre uyarlanabilir. - Oturum listesini açmak ve konuları adlandırmak için Kurulum | Oturum Listesi.
- Konu ve değişken ekle'ye tıklayın.
- Sıralı fare listesini takip ederek her bir Fare Tanımlayıcısını, Doğum Tarihini, Cinsiyeti, Genotipi ve ilgili kategorileri girin.
- Oturumu başlatın (Ek Şekil S2).
- Başlamadan önce yazılımın açık olup olmadığını kontrol edin, ardından Merdiveni açın.
- Hava kompresörünün bağlı ve açık olduğunu kontrol edin.
- Edinme penceresini açmak için Oluşturulan Deneme'yi açın.
- Satın Alma Seçin | Açık Satın Alma.
- Fareyi, yazılım tarafından belirtilen tanımlayıcı ile başlangıç hedefi kutusuna (merdivenin sağ tarafı) yerleştirin.
- İlk oturumda alınacak fare tanımlayıcısını seçin.
- Edinmeyi Başlat'a tıklayın.
- Kırmızı merdiven menü düğmesine 3x basın. Oturumun başladığını kontrol edin ve oturumun son denemesinin sonuna kadar fare hareketlerini otomatik olarak kontrol eder ve kaydeder.
- Oturumu sonlandırın.
- 42. denemenin sonunda, ekranın Veri Gönderiliyor ve Alındı mesajlarının gösterildiğini kontrol edin.
- Fareyi ev kafesine geri koyun.
- Merdiveni ve gol kutularını temizleyin.
- Sonraki fareyi yerleştirin ve 2.2.6 adımından itibaren tekrarlayın.
- Protokolün sonuna kadar her gün seçilen oturum türünü gerçekleştirin. Seçilen protokole göre her gün 2.2 ve 2.3 adımlarını tekrarlayın.
- Verileri dışa aktarın (Ek Şekil S2).
- Kaydedilen verileri görselleştirmek için Analiz menüsünden, Deneme İstatistikleri'nden, Oturum istatistiklerinden ve Grup İstatistikleri ve Grafikler'den seçim yapın.
NOT: Veriler, bireysel denemeler için verileri ve bir oturum içindeki aynı deneme türlerinin araçlarını içeren bir elektronik tablo olarak indirilebilir. Oturumlar, belirli analizler için seçilen değişkenlere göre de filtrelenebilir. - Dosya biçimini (elektronik tablo) ve klasör konumunu seçerek sağ üst köşedeki Dışa Aktar düğmesine tıklayın.
- Otomatik olarak oluşturulan grafiklere sağ tıklayın ve Dosyaya Farklı Kaydet'i *.jpg.
- Kaydedilen verileri görselleştirmek için Analiz menüsünden, Deneme İstatistikleri'nden, Oturum istatistiklerinden ve Grup İstatistikleri ve Grafikler'den seçim yapın.
3. Veri analizi
NOT: Dokunmaya duyarlı sensörlerin faaliyetlerinin anlık kaydına dayalı olarak Erasmus Merdiveni tarafından bir parametre listesi otomatik olarak ölçülür. Analiz için, kullanıcı tarafından seçilen çıktı parametreleri elektronik tablolarda düzenlenir ve işlenir. Yazılım tarafından oluşturulan grafiklerin yanı sıra, kullanıcılar, oturumlar boyunca farklı parametrelerdeki belirli değişiklikleri görselleştirmek için tercih ettikleri grafik yazılımını kullanarak grafikler oluşturabilir.
- İlk 4 gün boyunca bazal motivasyon veya kaygı durumlarını, duyusal tepkileri, motor performansı ve ince motor öğrenmeyi analiz etmek için belirli parametreleri seçin.
- Işık ve hava ipuçlarına yanıt olarak kale kutusundaki dinlenme süresi ve dinlenme süresinden sonra kale kutusundan çıkma süresi dahil olmak üzere kontrol parametrelerini seçin ve çizin (Şekil 2A).
NOT: WT farelerinde dinlenme süreleri veya ipuçlarına verilen yanıt nispeten sabittir. Çıkış sıklığı gibi diğer parametreler, WT farelerinde temel olarak ihmal edilebilir düzeydedir - hayvanlar nadiren dinlenme kutusunu ipuçları olmadan terk eder veya merdivende bir kez geri gelir, bu da çıkış frekanslarının deneme başına 1'e eşit olmasına neden olur. İşaretler uygulanmadan önce bir hayvan dışarı çıkarsa, fareyi kale kutusuna dönmeye zorlayan bir hava akımı etkinleştirilir; Bu, yazılım tarafından deneme olarak sayılmaz. - Fare hedef kutusundan ayrıldıktan sonra merdiveni geçmek için harcanan süre olarak ölçülen, ipuçlarından sonra merdivende geçirilen süreyi seçin ve çizin (Şekil 2B).
NOT: Doğrusal olmayan bir güç regresyon, öğrenmeyi değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir. Pearson veya Spearman katsayıları (R), veri uyumunun iyi olup olmadığının bir ölçüsünü sağlayacaktır (hayvanlar seanslar boyunca öğrendiğinde/geliştiğinde R değerleri bire yakındır; 0'a yakın R değerleri, verilerin sabit olduğunu ve farelerin öğrenmediğini gösterir). - Hassas bir öğrenme parametresi olarak yanlış adımlarla denemelerin yüzdesi gibi adım paterni parametrelerini seçin ve çizin (Şekil 2C).
- Doğru adımı, adımın uzunluğundan bağımsız olarak, yüksek bir basamaktan başka bir yüksek basamağa (H) adım olarak tanımlayın. Daha düşük bir basamak içeren adım türlerini yanlış adımlar olarak düşünün.
- Doğru adımları ve yanlış adımları, basılan basamaklar arasındaki adımın uzunluğuna ve yönlülüğüne bağlı olarak kısa ve uzun adımlara, geri adımlara ve sıçramalara bölün (bkz. Şekil 1A).
- Işık ve hava ipuçlarına yanıt olarak kale kutusundaki dinlenme süresi ve dinlenme süresinden sonra kale kutusundan çıkma süresi dahil olmak üzere kontrol parametrelerini seçin ve çizin (Şekil 2A).
- Son 4 gün içinde zorlanan motor öğrenmeyi (yalnızca ABD denemeleri) ve ilişkisel öğrenmeyi (eşleştirilmiş denemeler) değerlendirmek için belirli parametreleri seçin ve çizin.
- İpuçlarından sonra merdivendeki zamanı seçin ve çizin (Şekil 3).
- Yanlış adımlarla denemelerin yüzdesini seçin ve çizin (Şekil 4A).
- Merdivenin aynı tarafındaki engelden hemen önce (kontrol adımı) ve sonra (uyarlanmış adım) basamak aktivasyonu arasındaki ms hassasiyet farkı olarak tanımlanan pertürbasyon öncesi ve sonrası adım sürelerini seçin ve çizin (Şekil 4B).
NOT: Her bir oturum türündeki verileri karşılaştırmak için pertürbasyon öncesi ve sonrası adım süreleri analizi yapılmalıdır. Parametre, farelerin ilişkisel öğrenme sırasındaki engelleri tahmin etme ve üstesinden gelme yeteneğini ölçer.
- Verileri özel istatistiksel yazılımla (örneğin, SigmaPlot) analiz edin. Öğrenme sürecini daha verimli bir şekilde tanımlamak için oturumlar arasında aynı deneme türünden toplanan verilerin doğrusal olmayan bir regresyon analizini gerçekleştirin ve deneme türleri arasında karşılaştırma yapmak için İki Yönlü Tekrarlanan Ölçümler (RM) ANOVA'sını kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erasmus Ladder cihazı, kurulumu ve uygulanan protokol Şekil 1'de sunulmuştur. Protokol, dört kesintisiz ve dört meydan okuma oturumundan (her biri 42 deneme) oluşur. Her deneme, başlangıç ve bitiş hedef kutuları arasındaki merdivende bir koşudur. Oturumun başlangıcında, başlangıç kutularından birine bir fare yerleştirilir. 15 ± 5 sn ("dinlenme" durumu) ayarlanan bir süreden sonra ışık yanar (işaret 1, maksimum 3 sn için). Daha sonra fareleri kutudan çıkmaya ve karşı uca yürümeye teşvik etmek için hafif bir hava işareti (işaret 2, maksimum 45 s) uygulanır. Hava işaretine yanıt verme süresi fareler ve seanslar arasında değişebilir ve gruplar arasındaki motivasyon veya kaygı durumlarını karşılaştırmak için bir parametre olarak kullanılabilir. Fare bitiş hedef kutusuna ulaştıktan hemen sonra yeni bir deneme başlatılır.
WT farelerinde 1-4. günler boyunca dinlenme süresi ve ışık işaretine yanıt verme süresinde hiçbir fark gözlenmedi, ancak hava işaretine yanıt verme süresi 1. ve 2. günler arasında biraz azaldı (Şekil 2A). Merdiveni geçme süresinin ölçümleri, 1'den 4'e kadar olan günler arasında bir güç regresyon eğrisi ile donatılabilecek önemli bir öğrenme eğrisi verdi (R = 0.50, *p = 0.047, Şekil 2B). Merdiveni geçmek için geçen süreyi belirleyen önemli bir parametre, yanlış adımların ortaya çıkmasıdır. Merdivendeki sürelerin kısalmasına paralel olarak, fareler üst basamaklarda yürümeyi (H-H basamakları) ve merdiveni geçmek için daha etkili bir model olarak alt basamaklardan kaçınmayı öğrendikçe, farelerin yanlış adım attığı denemelerin sayısı bozulmamış seanslarda azalmıştır (R = 0.90, ***p < 0,0001, Şekil 2C).
5. günden 8. güne kadar, fareler beklenmedik bir engelin (ABD) ortaya çıktığı meydan okuma seanslarına tabi tutuldu (bir basamak, basamak yüzeyinin 18 mm yukarısına rastgele yükseltilir). Bazı denemelerde, ABD pertürbasyonundan 250 ms önce bir ton (CS, 90 dB, 250 ms süren 15 kHz ton) sunulur (bkz. Şekil 1B).
5. günde meydan okuma seanslarının başlamasıyla birlikte, engelin öngörülemeyen bir şekilde ortaya çıkması nedeniyle hayvanlar, yalnızca ABD'deki denemeler sırasında merdiveni geçmek için daha fazla zamana ihtiyaç duydu (4. gün: 5.01 s; Şekil 2B; 5. Gün: 7.84 sn; Şekil 3; eşleştirilmiş t-testi,*p < 0.039). Fare performansı 5. günden 8. güne kadar iyileşti ve yalnızca ABD oturumlarında önemli bir öğrenme eğrisi sağladı (R = 0.50, *p = 0.045, Şekil 3, turuncu). Engelin bir tonla eşleştirildiği ilişkisel öğrenme denemelerinde, hayvanlar günlük seansları yalnızca ABD denemelerine göre önemli ölçüde daha hızlı tamamladılar (R = 0.63, Şekil 3, mor; iki yönlü RM ANOVA, *p = 0.028). Son olarak, tonun tek başına sunulduğu kontrol denemelerinde (yalnızca CS), bozulmamış oturumlara benzeyen önemli bir öğrenme eğrisi bildirilmiştir (R = 0.82, ***p < 0.001, Şekil 3, mavi).
Adım modellerinin analizi, yalnızca ABD ve ilişkisel çalışmalar arasındaki farkları tespit etmede ek doğrulama ve gelişmiş hassasiyet sağladı. Şekil 4A , yalnızca ABD'deki denemeler boyunca yanlış adımlarla yapılan denemelerin yüzdesinin nasıl sabit kaldığını gösterirken (R = 0.01, p = 0.90, turuncu), eşleştirilmiş oturumlar sırasında yanlış adımlarla yapılan denemelerde önemli bir azalma gözlenmiştir (R = 0.61, *p = 0.01, mor). Şekil 4B , yalnızca ABD'deki denemelerde (iki yönlü RM ANOVA, *p = 0.05) pertürbasyon öncesi ve sonrası adım süreleri arasında anlamlı bir fark göstermektedir, ancak farelerin engelin üstesinden gelmek için daha hızlı öğrendiği eşleştirilmiş çalışmalarda değildir. İncelenen tüm değişkenler ve uygulanan istatistiksel testler Ek Tablo S1'de rapor edilmiştir.
Şekil 1: Sistem, protokol ve parametreler. (A) Erasmus Merdiveni, iki hedef kutusu ile çevrili yatay bir merdivenden oluşur. Karikatür, alternatif yüksek ve alçak basamaklara sahip merdiveni ve adım türleri (normal adımlar, doldurulmuş çizgi; veya yanlış adımlar, kesikli çizgi) ve farenin bir engeli aşması gereken süre olarak tanımlanan pertürbasyon öncesi ve sonrası adım süresi dahil olmak üzere kaydedilen ana parametreleri temsil eder (koşulsuz uyaran; daha yüksek basamak) bir tonla (koşullu uyaran) duyurulan veya duyurulmayan adım. (B) Protokol, ince motor öğrenmenin (bozulmamış ve yalnızca CS mavi renkte), meydan okumalı motor öğrenmenin (yalnızca ABD, turuncu renkte) ve ilişkisel motor öğrenmenin (eşleştirilmiş CS + US, mor renkte) ayrı ayrı analiz edilmesine olanak tanıyan dört kesintisiz ve dört meydan okuma oturumundan (bir oturum/gün, 42 deneme/oturum) oluşur. Kısaltmalar: H = yüksek; L = düşük; CS = koşullu uyaran; US = koşulsuz uyaran. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Rahatsız edilmeyen seanslar sırasında WT farelerinin motor performansı. (A) Kale kutusunda dinlenme süresi (sabit, 15 sn), ipuçlarına yanıt verme süresi: ışık (sabit, 3 sn) ve hava (değişken); 1-4 gün boyunca rahatsız edilmemiş seanslar. (B) Rahatsız edilmeyen seanslar sırasında işaretten sonra (ışık ve hava) merdiveni geçme süresi. (C) Hayvanın bir adımı kaçırdığı her rahatsız edilmemiş seanstaki denemelerin yüzdesi. Öğrenme sürecini incelemek için bir güç regresyon analizi kullanıldı (sırasıyla R= 0.50: *p = 0.047, R= 0.90 ***p < 0.0001, n = 4 fare). Kısaltma: WT = vahşi tip. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Meydan okuma oturumları sırasında WT farelerinin performansı. Yalnızca ABD (turuncu), eşleştirilmiş (mor) ve yalnızca CS (açık mavi) denemeleri için 5-8. günlerde ipuçlarından sonra merdivende geçirilen ortalama süre. Öğrenme ilerlemesini incelemek için doğrusal olmayan bir regresyon analizi kullanıldı (*p = 0.047, **p = 0.0093, ***p < 0.001, n=4 fare). Deneme türlerini karşılaştırmak için iki yönlü RM ANOVA (*p = 0.028, **p = 0.008, n=4 fare, iki erkek ve iki dişi, ortalama ± SEM). Kısaltmalar: CS = koşullu uyaran; US = koşulsuz uyaran. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sınama oturumları sırasında fare adım desenlerindeki değişiklikler. (A) Hayvanın yalnızca ABD ve eşleştirilmiş oturumlar sırasında bir adımı kaçırdığı oturum başına denemelerin yüzdesi. Öğrenme sürecini incelemek için bir güç regresyon analizi (*p = 0.013) ve deneme türleri arasında karşılaştırma yapmak için İki yönlü RM ANOVA (*p = 0.032, n = 4 fare) kullanıldı. (B) Yalnızca ABD'de ve seanslar boyunca eşleştirilmiş oturumlarda pertürbasyon öncesi ve sonrası adım süre(ler)i. İki Yönlü Tekrarlanan Ölçümler ANOVA, *p < 0.05, n = 4 fare, iki erkek ve iki dişi, ortalama ± SEM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Yazılım arayüzü: bir deney nasıl oluşturulur ve bir protokol nasıl seçilir. Protokol adımı 2.1'de açıklanan ve 2.1.4 ile 2.1.8 arasındaki adımları kapsayan iş akışını gösteren yazılımdan ekran görüntüleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S2: Yazılım arayüzü: oturumun nasıl başlatılacağı ve verilerin nasıl dışa aktarılacağı. 2.2.4 - 2.2.7 ve 2.5.1 - 2.5.3 adımlarını kapsayan protokol adımları 2.2 ve 2.5'te açıklanan iş akışını gösteren yazılımdan ekran görüntüleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S1: İstatistiksel tablo. İncelenen tüm değişkenlerin ve uygulanan istatistiksel testlerin açıklaması, Şekil 2B, Şekil 3 ve Şekil 4A,B'de rapor edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Erasmus Merdiveni, motor fenotip değerlendirmesi için mevcut yaklaşımların ötesinde büyük avantajlar sunmaktadır. Testin yapılması kolaydır, otomatikleştirilir, tekrarlanabilir ve araştırmacıların tek bir fare kohortu kullanarak motor davranışın çeşitli yönlerini ayrı ayrı değerlendirmesine olanak tanır. Mevcut çalışmada, tekrarlanabilirlik, cihazın özelliklerinden, deneysel tasarımdan ve analiz yöntemlerinden yararlanan az sayıda WT faresi ile sağlam verilerin üretilmesine izin verdi. Örneğin, geleneksel ışın yürüyüşü tahlilleriyle karşılaştırıldığında, merdiven yoluna girmek için motivasyonel ipuçlarının (hava ve ışık) ve denemeyi tamamlamak için arka rüzgarın eklenmesi tutarlılığı artırır ve önemli bir değişkenlik kaynağı olan deneyci müdahalesi ihtiyacını atlar.
Farenin yönüne ve konumuna göre ayarlanabilen bir hava akışı oluşturmak için bir hava kompresörü sistemi gereklidir. Hava akımı, bir fare planlanan deneme başlangıcından önce kale kutusundan ayrılmaya çalıştığında ters yönden 30 km/s'lik bir karşı rüzgar oluşturur ve farelerin kale kutusuna geri dönmesini sağlar. Ayrıca, deneme sırasında fare merdiveni tamamen geçip karşı kale kutusuna girene kadar sabit bir arka rüzgar (1 ila 16 km/s) üretir. Merdiveni geçmek için bir teşvik olarak basınçlı hava olmadan, fareler sık sık basamaklarda durur ve yavaş bir hızda yönleri tersine çevirir, bu da analiz için ters etki yaratan bir keşif değişkeni sunar.
Burada açıklanan standart protokol, 8 günlük bir zaman dilimi boyunca temel ince motor koordinasyon ve öğrenmenin (bozulmamış seanslar) yanı sıra zorluklara adaptasyon ve ilişkisel motor öğrenme (meydan okuma seansları) ölçümlerini sağlar. Görev, burada kullanılan C57Bl6J fareleri gibi sinirbilim çalışmaları için tipik olarak kullanılan WT fare suşları için kolaydır ve test oturumlarının hiçbirinde herhangi bir yaralanma gözlenmeden güvenlidir. Ek olarak, rotarod veya koşu bandı gibi diğer motor testleriyle karşılaştırıldığında yorgunluk belirtileri tespit etmedik.
4 günlük başlangıç aşamasında, WT fareleri beceride ustalaşır ve en verimli koşu düzenini (HH adımları) benimsemeyi öğrenerek merdiveni geçer ve 4. günde nadiren yanlış adımlar meydana gelir (Şekil 2B, C). İkinci aşamanın 5. gününde, fareler engelle ilk karşılaştıklarında daha yavaştırlar, ancak hızlı bir şekilde adapte olurlar (Şekil 3, yalnızca ABD). Engeli bir koşullandırma uyarıcısı (ton) ile birleştirmek, deneme süresinin, engelin sunulmadığı denemelere eşit olduğu ölçüde öğrenmeyi kolaylaştırır (Şekil 3, eşleştirilmiş). Dikkat çekici bir şekilde, yalnızca ABD'de yapılan denemeler boyunca yanlış adımlar içeren denemelerin sayısı sabit kalırken (Şekil 4A), eşli oturumlarda önemli bir azalma gözlenmiştir (Şekil 4A), bu da ilişkisel öğrenme sürecinin etkinliğini doğrulamaktadır.
Erasmus Ladder yazılımı tarafından sağlanan temsili parametrelerin analizi için bir iş akışı öneriyoruz. Güç regresyon analizi, önemli öğrenme eğrilerini kaydetmemize ve dört WT faresi kullanarak zorlu ve ilişkisel öğrenmedeki farklılıkları tespit etmemize izin verdi. Ek literatüre ve pilot deneylere dayanarak, mutant veya tedavi edilmiş fareleri içeren deneysel tasarımlar, fare sayısının 7-10 fareyeçıkarılmasını gerektirebilir 4,5,6. Elimizde, oturum başına 42 deneme, küçük bir fare kohortu ile sağlam veriler elde etmek için en uygun sayıydı, çünkü birkaç denemenin ortalaması değişkenliği azaltır. Sayı yüksek görünse de, her 42 deneme oturumu 15 dakika ile 35 dakika arasında sürer ve günde 12-16 fare makul bir şekilde test edilebilir. Deneme süresi (dinlenme süresi ve ipuçlarına verilen yanıt artı merdiveni geçme süresi dahil), eğitim gününe ve denemenin türüne bağlı olarak 20 saniye ile 50 saniye arasında değişir.
Bununla birlikte, sistemin çok yönlülüğü, araştırmacıların günlük seans ve deneme sayısı, ipuçlarının ve CS'nin yoğunluğu ve süresi ile ABD'nin doğası dahil olmak üzere çeşitli ayarları ayarlayarak özelleştirilmiş protokoller tasarlamasına olanak tanıyacaktır. Örneğin, verilerimiz WT farelerinde, özellikle performans bir platoya ulaştıktan sonra 1. gün ile 2. gün arasında hızlı bir öğrenme eğrisi gösterdi (Şekil 2B, C). Bu, ek 2 günün, kesintisiz oturumlarda temel motor öğrenmeyi test etmek için kesinlikle gerekli olmayabileceğini ve eğitim süresinin sadece 2 güne düşürülmesiyle standart protokolde değişikliklerin uygulanabileceğini öne sürdü. Yine de bu uyarlama, protokolün ara serpiştirilmiş, bozulmamış, yalnızca ABD, yalnızca CS ve eşleştirilmiş denemeleri içeren ikinci aşaması için uygun olmayabilir. Uyaranlar, belirli davranışları değerlendirmek için rastgele ve beklenmedik bir şekilde sunulur ve deneysel denemeleri bu dört kategoriye ayırma ihtiyacı, 42'yi istatistiksel güç için gerekli olan uygun sayıda deneme yapar. Bu nedenle, protokolün yeniden düzenlenmesi, bozulmamış denemelerin sayısını azaltmanın veya belirli meydan okuma denemelerini artırmanın fizibilitesini değerlendirmek zorunda kalacaktır. Burada 250 ms olarak ayarlanan CS (90 dB, 15 kHz ton) ve US arasındaki uyaranlar arası aralık (ISI) da uyaran-tepki ilişkisini incelemek için değiştirilebilir. Bu tür bir ayarlama, araştırmacıların zorluk seviyesini titre etmelerine veya bilimsel soruya göre farklı davranışlara odaklanmalarına olanak tanır.
Bugüne kadar, Erasmus merdiveni çoğunlukla serebellar kökenli motor koordinasyondaki ince kusurları tespit etmek için kullanılmıştır. Örneğin, yanlış adımlar tüm vücut lokomotor koordinasyonunun bir ölçüsüdür. Bu çalışmada genç yetişkin fareler kullanıldı, ancak P23 kadar genç fareler başkaları tarafından lokomotor fonksiyonların olgunlaşmasını incelemek için kullanıldı 7,8. Merkezi kökenli ipsilateral patolojiler, farenin sağ ve sol pençelerinin pozisyonunun ayrımcı analizi yoluyla incelenebilir. Son olarak, Erasmus merdiveninde motor becerilerde ustalaşmak, muhtemelen bazal gangliyonları, motor korteksleri ve korpus kallozum dahil olmak üzere bağlantı yollarını içeren diğer motor kontrol devrelerini devreye sokar. Bu davranışsal paradigmayı hücresel, moleküler ve devre teknikleriyle birleştirmek, motor adaptasyona aracılık eden ve motor öğrenmeyi artırmak için kullanılabilecek devre mekanizmalarını araştırmak için faydalı olacaktır. Böyle bir örnek, demiyelinizasyonun fare modellerinde ince motor becerilerin kazanılmasına oldukça duyarlı olan aksonal miyelinasyon üzerindeki etkiyi incelemek olacaktır 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Görsel-işitsel teknisyen ve video yapımcısı Rebeca De las Heras Ponce'nin yanı sıra baş veteriner hekim Gonzalo Moreno del Val'e fare deneyleri sırasında iyi uygulamaların denetlenmesi için teşekkür ederiz. Çalışma, GVA Mükemmellik Programı (2022/8) ve İspanyol Araştırma Ajansı'ndan (PID2022143237OB-I00) Isabel Pérez-Otaño'ya verilen hibelerle finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat. Rev. Neurosci. 10 (7), 519-529 (2009).
- Noldus. , https://www.noldus.com/erasmusladder (2023).
- Cupido, A., et al. Detecting cerebellar phenotypes with the Erasmus ladder[dissertation]. , Erasmus University Rotterdam PhD dissertation. (2009).
- Van Der Giessen, R. S. Role of olivary electrical coupling in cerebellar motor learning. Neuron. 58 (4), 599-612 (2008).
- Vinueza Veloz, M. F. The effect of an mGluR5 inhibitor on procedural memory and avoidance discrimination impairments in Fmr1 KO mice. Genes Brain Behav. 11 (3), 325-331 (2012).
- Vinueza Veloz, M. F. Cerebellar control of gait and interlimb coordination. Brain Struct. Funct. 220 (6), 3513-3536 (2015).
- Sathyanesan, A., Kundu, S., Abbah, J., Gallo, V. Neonatal brain injury causes cerebellar learning deficits and Purkinje cell dysfunction. Nat. Commun. 9 (1), 3235 (2018).
- Sathyanesan, A., Gallo, V. Cerebellar contribution to locomotor behavior: A neurodevelopmental perspective. Neurobiol. Learn Mem. 165, 106861 (2019).
- McKenzie, I. A. Motor skill learning requires active central myelination. Science. 346 (6207), 318-322 (2014).
- Xiao, L. Rapid production of new oligodendrocytes is required in the earliest stages of motor-skill learning. Nat. Neurosci. 19 (9), 1210-1217 (2016).
