Overvåking av fin og assosiativ motorisk læring hos mus ved hjelp av Erasmus-stigen

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll som tillater en ikke-invasiv og automatisert vurdering av finmotorisk ytelse, samt adaptiv og assosiativ motorisk læring ved utfordringer, ved hjelp av en enhet kalt Erasmus Ladder. Oppgaveproblemer kan titreres for å oppdage motorisk svekkelse fra store til subtile grader.

Abstract

Atferd er formet av handlinger, og handlinger krever motoriske ferdigheter som styrke, koordinering og læring. Ingen av atferdene som er avgjørende for å opprettholde livet, ville være mulige uten evnen til å overgå fra en posisjon til en annen. Dessverre kan motoriske ferdigheter bli kompromittert i et bredt spekter av sykdommer. Derfor er det avgjørende å undersøke mekanismene for motorfunksjoner på cellulært, molekylært og kretsnivå, samt å forstå symptomene, årsakene og progresjonen av motoriske lidelser. Musemodeller brukes ofte til dette formålet.

Denne artikkelen beskriver en protokoll som tillater overvåking av ulike aspekter av motorisk ytelse og læring hos mus ved hjelp av et automatisert verktøy kalt Erasmus Ladder. Analysen innebærer to faser: en innledende fase hvor mus er opplært til å navigere i en horisontal stige bygget av uregelmessige trinn ("finmotorisk læring"), og en andre fase hvor et hinder presenteres i banen til det bevegelige dyret. Forstyrrelsen kan være uventet ("utfordret motorisk læring") eller innledes med en auditiv tone ("assosiativ motorisk læring"). Oppgaven er enkel å utføre og støttes fullt ut av automatisert programvare.

Denne rapporten viser hvordan forskjellige avlesninger fra testen, når de analyseres med sensitive statistiske metoder, tillater fin overvåking av musemotoriske ferdigheter ved hjelp av en liten kohorte mus. Vi foreslår at metoden vil være svært følsom for å evaluere motortilpasninger drevet av miljømodifikasjoner, samt subtile motoriske underskudd i mutante mus med kompromitterte motorfunksjoner.

Introduction

En rekke tester er utviklet for å vurdere motoriske fenotyper hos mus. Hver test gir informasjon om et bestemt aspekt av motorisk oppførsel¹. For eksempel informerer åpen felttest om generell bevegelse og angsttilstand; rotarod og gangstråletester på koordinering og balanse; fotavtrykksanalyse handler om ganglag; tredemølle eller løpehjul på tvungen eller frivillig fysisk trening; Og det komplekse hjulet handler om læring av motoriske ferdigheter. For å analysere musemotorfenotyper må etterforskerne utføre disse testene sekvensielt, noe som innebærer mye tid og krefter og ofte flere dyrekohorter. Hvis det er informasjon på mobil- eller kretsnivå, velger etterforskeren normalt en test som overvåker et relatert aspekt og følger derfra. Imidlertid mangler paradigmer som diskriminerer ulike aspekter av motorisk oppførsel på en automatisert måte.

Denne artikkelen beskriver en protokoll for å bruke Erasmus Ladder ^2,3, et system som tillater omfattende vurdering av en rekke motoriske læringsfunksjoner hos mus. De viktigste fordelene er reproduserbarheten og følsomheten til metoden, sammen med evnen til å titrere motoriske vanskeligheter og å skille underskudd i motorisk ytelse fra nedsatt assosiativ motorlæring. Hovedkomponenten består av en horisontal stige med alternative høye (H) og lave (L) trinn utstyrt med berøringsfølsomme sensorer som oppdager musens posisjon på stigen. Stigen er laget av 2 x 37 trinn (L, 6 mm; H, 12 mm) fordelt 15 mm fra hverandre og plassert i et vekslende mønster mellom venstre og høyre med 30 mm mellomrom (figur 1A). Rungs kan flyttes individuelt for å generere ulike vanskelighetsgrader, det vil si å skape et hinder (heve de høye trinnene med 18 mm). Sammen med et automatisert opptakssystem og assosiere modifikasjoner av trinnmønsteret med sensoriske stimuli, tester Erasmus-stigen for finmotorisk læring og tilpasning av motorisk ytelse som svar på miljøutfordringer (utseende av et høyere trinn for å simulere et hinder, en ubetinget stimulus [US]) eller tilknytning til sensoriske stimuli (en tone, en betinget stimulus [CS]). Testing involverer to forskjellige faser, som hver vurderer forbedring i motorisk ytelse over 4 dager, hvor mus gjennomgår en økt på 42 påfølgende forsøk per dag. I den innledende fasen trenes mus til å navigere stigen for å vurdere "fin" eller "dyktig" motorisk læring. Den andre fasen består av sammenflettede forsøk hvor et hinder i form av et høyere trinn presenteres i banen til det bevegelige dyret. Forstyrrelsen kan være uventet for å vurdere "utfordret" motorisk læring (amerikanske bare forsøk) eller annonsert av en auditiv tone for å vurdere "assosiativ" motorisk læring (parvise studier).

Erasmus-stigen har blitt utviklet relativt nylig ^2,3. Det har ikke blitt mye brukt fordi oppsett og optimalisering av protokollen krevde fokusert innsats og ble spesielt designet for å vurdere cerebellaravhengig assosiativ læring uten å utforske i detalj potensialet for å avsløre andre motoriske underskudd. Hittil har det blitt validert for sin evne til å avdekke subtile motoriske funksjonsnedsettelser knyttet til cerebellar dysfunksjon hos mus 3,4,5,6,7,8. For eksempel viser connexin36 (Cx36) knockoutmus, hvor gapskryss er svekket i ovarienevroner, avfyringsunderskudd på grunn av mangel på elektrotonisk kobling, men den motoriske fenotypen hadde vært vanskelig å finne. Testing ved hjelp av Erasmus-stigen antydet at rollen til dårligere ovarienevroner i en cerebellar motorisk læringsoppgave er å kode presis tidsmessig koding av stimuli og legge til rette for læringsavhengige responser på uventede hendelser ^3,4. Fragilt X Messenger ribonukleoprotein 1 (Fmr1) knockoutmus, en modell for Fragile-X-syndrom (FXS), viser en velkjent kognitiv svekkelse sammen med mildere defekter i prosessuell minnedannelse. Fmr1 knockouts viste ingen signifikante forskjeller i trinntider, feiltrinn per forsøk eller motorisk ytelsesforbedring over økter i Erasmus-stigen, men klarte ikke å justere gangmønsteret til det plutselig synlige hinderet sammenlignet med deres villtype (WT) kullkamerater, og bekreftet spesifikke prosessuelle og assosiative minneunderskudd ^3,5. Videre viste cellespesifikke musemutantlinjer med defekter i cerebellar funksjon, inkludert nedsatt Purkinje-celleutgang, potensering og molekylære lag interneuron eller granulatcelleutganger, problemer i motorisk koordinering med endret oppkjøp av effektive trinnmønstre og i antall trinn som ble tatt for å krysse stigen⁶. Neonatal hjerneskade forårsaker cerebellar læringsunderskudd og Purkinje celledysfunksjon som også kan oppdages med Erasmus Ladder ^7,8.

I denne videoen presenterer vi en omfattende trinnvis veiledning, som beskriver oppsettet av atferdsrommet, atferdstestprotokollen og påfølgende dataanalyse. Denne rapporten er laget for å være tilgjengelig og brukervennlig og er designet spesielt for å hjelpe nykommere. Denne protokollen gir innsikt i ulike faser av motorisk trening og forventede motoriske mønstre som mus adopterer. Til slutt foreslår artikkelen en systematisk arbeidsflyt for dataanalyse ved hjelp av en kraftig ikke-lineær regresjonstilnærming, komplett med verdifulle anbefalinger og forslag til tilpasning og anvendelse av protokollen i andre forskningssammenhenger.

Protocol

I den nåværende studien ble voksne (2-3 måneder gamle) C57BL/6J-mus av begge kjønn brukt. Dyrene ble plassert to til fem per bur med ad libitum tilgang til mat og vann i en dyreenhet under observasjon og opprettholdt i et temperaturkontrollert miljø på en 12 timers mørk / lys syklus. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med europeiske og spanske forskrifter (2010/63/UE; RD 53/2013) og ble godkjent av den etiske komiteen for Generalitat Valenciana og dyrevelferdskomiteen ved Universidad Miguel Hernández.

1. Oppsett av atferdsrom

1. Reserver atferdstestrommet hver dag på samme tid og opprett listen og rekkefølgen på mus som skal brukes, samt ordninger for deres hosting.
2. Hold eksperimentmusene utenfor testrommet slik at de ikke hører lydene fra luftkompressoren og Erasmus Ladder-tonene når de ikke testes.
3. Kontroller at alle komponentene i Erasmus Ladder-systemet er i orden og klare til bruk: nettverksruteren, datamaskinen med programvaren (se materialfortegnelse), luftkompressoren, to målbokser og stigen med trinnene riktig plassert.
4. Rengjør målboksene, stigen og trinnene grundig med vann etter hvert dyr og med vann og 70 % etanol på slutten av hver treningsdag.

2. Protokoll for atferdstest

1. Opprett et eksperiment og skriv protokollen inn i programvaren (tilleggsfigur S1).
   1. Slå på programvaren.
   2. Hvis du vil opprette et eksperiment, velger du Fil | Nytt eksperiment | Ny eller satt opp | Eksperiment protokoll.
      MERK: Standardprotokollen, som brukes i denne studien, heter EMC og ble designet ved Erasmus University Medical Center, Rotterdam.
   3. Gi eksperimentet et navn, og klikk OK.
   4. Kontroller at standard EMC-protokoll som er valgt, består av 4 dager med uforstyrrede økter (42 uforstyrrede forsøk per dag) og 4 dager med utfordringsøkter (42 daglige blandede forsøk: uforstyrret, bare CS-(tone), kun USA (hinder), paret (hinder annonsert etter tone) (se figur 1B). I høyre sidepanel kontrollerer du også lyssignalet (3 s maksimal varighet), luftsignalet (45 s maksimal varighet) og medvind (Ja i alle prøvetypene), som brukes til å oppmuntre musen til å krysse stigen, og tonen (250 ms, Ja bare i CS-only og Parede prøveversjoner).
   5. Hvis du vil opprette en annen protokoll, velger du Konfigurer | Eksperiment protokoll | Nytt | Fra bunnen av eller Kopier fra EMC-protokollen og bare endre den, rediger tabelllinjene relatert til antall økter (dager med eksperiment) og antall og type forsøk per dag.
      MERK: Hviletid, signaltype og aktivering, varighet, intensitet og intervall kan også tilpasses i henhold til de eksperimentelle spørsmålene.
   6. Hvis du vil åpne øktlisten og gi navn til emnene, velger du Oppsett | Øktliste.
   7. Klikk på Legg til emner og variabler.
   8. Skriv inn hver spesifikke museidentifikator, fødselsdato, kjønn, genotype og relevante kategorier, etter den bestilte listen over mus.
2. Start økten (tilleggsfigur S2).
   1. Før du starter, må du kontrollere at programvaren er åpen, og deretter slå på stigen.
   2. Kontroller at luftkompressoren er koblet til og slått på.
   3. Du åpner Brukeranskaffelse-vinduet ved å åpne Eksperiment opprettet.
   4. Velg anskaffelse | Åpent oppkjøp.
   5. Plasser musen med identifikatoren indikert av programvaren i startmålboksen (høyre side av stigen).
   6. Velg museidentifikatoren du vil hente i den første økten.
   7. Klikk på Start anskaffelse.
   8. Trykk på den røde stigemenyknappen 3x. Kontroller at økten starter og automatisk kontrollerer og registrerer musebevegelser til slutten av den siste prøveversjonen av økten.
3. Avslutt økten.
   1. Sjekk at på slutten^{av den} 42. prøveperioden viser displayet meldingene Sende data og Innhentet.
   2. Sett musen tilbake til hjemmeburet.
   3. Rengjør stigen og målboksene.
   4. Plasser neste mus og gjenta fra trinn 2.2.6 og utover.
4. Utfør den valgte typen økt hver dag til slutten av protokollen. Gjenta trinn 2.2 og 2.3 hver dag i henhold til den valgte protokollen.
5. Eksporter dataene (tilleggsfigur S2).
   1. Hvis du vil visualisere de registrerte dataene, velger du fra Analyse-menyen, Prøvestatistikk, Øktstatistikk og Gruppestatistikk og diagrammer.
      MERK: Data kan lastes ned som et regneark med data for individuelle forsøk og midlene til de samme prøvetypene i en økt. Økter kan også filtreres etter variabler valgt for spesifikk analyse.
   2. Klikk på Eksporter-knappen øverst til høyre, og velg filformat (regneark) og mappeplassering.
   3. Høyreklikk på de automatisk genererte diagrammene og velg Lagre i fil som *.jpg.

3. Dataanalyse

MERK: En liste over parametere måles automatisk av Erasmus-stigen basert på øyeblikkelig registrering av aktivitetene til de berøringsfølsomme sensorene. For analyse blir utgangsparametere valgt av brukeren organisert og behandlet i regnearkene. Sammen med de programvaregenererte grafene kan brukerne generere grafer ved hjelp av den valgte grafprogramvaren for å visualisere spesifikke endringer i forskjellige parametere over økter.

1. Velg spesifikke parametere for å analysere basal motivasjon eller angsttilstander, sensoriske responser, motorisk ytelse og finmotorisk læring i løpet av de første 4 dagene.
   1. Velg og plott kontrollparametere, inkludert hviletid i målboksen og tid for å gå ut av målboksen etter hvileperioden som svar på lys- og luftsignaler (figur 2A).
      MERK: Hviletider eller respons på signaler er relativt konstante i WT-mus. Andre parametere som frekvens av utganger er i utgangspunktet ubetydelige i WT-mus - dyrene forlater sjelden hvileboksen uten signaler eller kommer tilbake en gang i stigen, noe som resulterer i frekvenser av utgang lik 1 per forsøk. Hvis et dyr går ut før signaler påføres, aktiveres en luftstrøm som tvinger musen til å gå tilbake til målboksen; Dette regnes ikke som en prøveversjon av programvaren.
   2. Velg og plott tiden på stigen etter signaler, målt som tiden du bruker på å krysse stigen når musen forlater målboksen (figur 2B).
      MERK: En ikke-lineær regresjon er en robust metode for å evaluere læring. Pearson- eller Spearman-koeffisientene (R) vil gi et mål på om datatilpasningen er god (R-verdier nær en når dyrene lærer/forbedrer seg over økter; R-verdier nær 0 innebærer at dataene er konstante og mus ikke lærer).
   3. Velg og plott trinnvise mønsterparametere , for eksempel prosentandelen av forsøk med feiltrinn som sensitiv læringsparameter (figur 2C).
      1. Definer et riktig trinn som et trinn fra et høyt trinn til et annet høyt trinn (H-H), uavhengig av lengden på trinnet. Vurder trinntyper som involverer et lavere trinn, som feiltrinn.
      2. Del riktige trinn og feiltrinn inn i korte og lange trinn, tilbaketrinn og hopp avhengig av lengden og retningen på trinnet mellom trinnene som trykkes (se figur 1A).
2. Velg og plott spesifikke parametere for å evaluere utfordret motorisk læring (kun USA-studier) og assosiativ læring (parvise studier) i løpet av de siste 4 dagene.
   1. Velg og plott tiden på stigen etter signaler (figur 3).
   2. Velg og plott prosentandelen av forsøk med feiltrinn (figur 4A).
   3. Velg og plott trinntidene før og etter forstyrrelser, definert som en ms-presisjonsforskjell mellom trinnaktivering like før (kontrolltrinn) og etter hindringen (tilpasset trinn) på samme side av stigen (figur 4B).
      MERK: Pre vs post-perturbation trinn ganger analyse bør utføres for å sammenligne data innenfor hver type økt. Parameteren måler musens evne til å forutsi og overvinne hindringene under assosiativ læring.
3. Analysere dataene med dedikert statistisk programvare (f.eks. Utfør en ikke-lineær regresjonsanalyse av data samlet inn fra samme studietype på tvers av økter for å beskrive læringsprosessen mer effektivt og bruk toveis gjentatte tiltak (RM) ANOVA for å sammenligne mellom studietyper.

Representative Results

Erasmus Ladder-enheten, oppsettet og protokollen som er brukt, er presentert i figur 1. Protokollen består av fire uforstyrrede og fire utfordringsøkter (42 forsøk hver). Hvert forsøk er ett løp på stigen mellom start- og sluttmålsboksene. I begynnelsen av økten plasseres en mus i en av startboksene. Etter en innstilt tid på 15 ± 5 s ("hvilende" tilstand), slås lyset på (cue 1, for maksimalt 3 s). En lett luftkø (kø 2, maksimalt 45 s) påføres deretter for å oppmuntre musene til å forlate boksen og gå til motsatt ende. Tiden for å reagere på luftsignalet kan variere mellom mus og økter og kan brukes som en parameter for å sammenligne motivasjons- eller angsttilstander mellom grupper. En ny prøveversjon startes umiddelbart etter at musen når sluttmålboksen.

Ingen forskjeller i hviletid og tid for å reagere på lyssignalet ble observert hos WT-mus på dag 1-4, men tiden for å reagere på luftsignalet ble noe redusert mellom dag 1 og 2 (figur 2A). Målinger av tid for å krysse stigen ga en signifikant læringskurve fra dag 1 til 4 som kunne utstyres med en potensregresjonskurve (R = 0,50, *p = 0,047, figur 2B). En nøkkelparameter som bestemmer tiden det tar å krysse stigen, er forekomsten av feiltrinn. I tråd med forkortelsen av tidene på stigen, ble antall forsøk der mus gjorde feiltrinn redusert over uforstyrrede økter da mus lærte å gå på de øvre trinnene (H-H-trinn) og unngå de nedre som et mer effektivt mønster for å krysse stigen (R = 0,90, ***p < 0,0001, figur 2C).

Fra dag 5 til 8 ble musene utsatt for utfordringsøkter der en uventet hindring (US) ble introdusert (ett trinn er tilfeldig hevet med 18 mm over trinnflaten). I noen forsøk presenteres en tone (CS, 90 dB, 15 kHz tone som varer 250 ms) 250 ms før den amerikanske forstyrrelsen (se figur 1B).

Med begynnelsen av utfordringsøktene på dag 5, trengte dyrene mer tid til å krysse stigen under forsøk bare i USA på grunn av den uforutsette introduksjonen av hindringen (dag 4: 5.01 s; Figur 2B; Dag 5: 7,84 S; Figur 3; Paret t-test,*p < 0,039). Museytelsen ble forbedret fra dag 5 til 8, noe som ga en betydelig læringskurve på tvers av økter som bare var i USA (R = 0,50, *p = 0,045, figur 3, oransje). I assosiative læringsforsøk, hvor hindringen ble parret med en tone, fullførte dyrene de daglige øktene betydelig raskere i forhold til amerikanske forsøk (R = 0,63, figur 3, lilla; toveis RM ANOVA, *p = 0,028). Til slutt, i kontrollforsøk når tonen ble presentert alene (kun CS), ble det rapportert en signifikant læringskurve som lignet uforstyrrede økter (R = 0,82, ***p < 0,001, figur 3, blå).

Analyse av trinnmønstrene ga ytterligere bekreftelse og forbedret følsomhet for å oppdage forskjeller mellom amerikanske og assosiative studier. Figur 4A viser hvordan prosentandelen av forsøk med feiltrinn holdt seg konstant gjennom studier kun i USA (R = 0,01, p = 0,90, oransje), mens en signifikant reduksjon i studier med feiltrinn ble observert under parvise økter (R = 0,61, *p = 0,01, lilla). Figur 4B viser en signifikant forskjell mellom trinntider før og etter forstyrrelser i amerikanske forsøk (toveis RM ANOVA, *p = 0,05), men ikke i parvise forsøk der mus lærte raskere for å overvinne hindringen. Alle undersøkte variabler og anvendte statistiske tester er rapportert i tilleggstabell S1.

Figur 1: System, protokoll og parametere. (A) Erasmusstigen består av en horisontal stige flankert av to målbokser. Tegneserien representerer stigen med vekslende høye og lave trinn og hovedparametrene registrert, inkludert trinntyper (normale trinn, fylt linje, eller feiltrinn, stiplet linje) og trinntid før og etter forstyrrelse definert som tiden musen trenger for å overvinne et hinder (ubetinget stimulus, høyere trinn) annonsert eller ikke av en tone (betinget stimulus). (B) Protokollen består av fire uforstyrrede og fire utfordringsøkter (en økt/dag, 42 forsøk/økt) som gjør det mulig å analysere finmotorisk læring separat (uforstyrret og CS-only i blått), utfordret motorisk læring (kun USA, i oransje) og assosiativ motorisk læring (sammenkoblet CS + US, i lilla). Forkortelser: H = høy; L = lav; CS = betinget stimulus; US = ubetinget stimulus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Motorisk ytelse hos WT-mus under uforstyrrede økter. (A) Hviletid i målboksen (konstant, 15 s), tid til å svare på signaler: lys (konstant, 3 s) og luft (variabel); over dag 1-4 med uforstyrrede økter. (B) Tid til å krysse stigen etter kø (lys og luft) under uforstyrrede økter. (C) Prosentandel av forsøk i hver uforstyrret økt der dyret bommet på et trinn. En styrkeregresjonsanalyse ble brukt til å studere læringsprogresjonen (R = 0,50: *p = 0,047, R = 0,90 ***p < 0,0001, henholdsvis n = 4 mus). Forkortelse: WT = vill type. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Ytelse av WT-mus under utfordringsøkter. Gjennomsnittlig tid på stigen etter signaler i løpet av dagene 5–8 for prøver med bare USA (oransje), paret (lilla) og CS-only (lyseblå). En ikke-lineær regresjonsanalyse ble brukt til å studere læringsprogresjonen (*p = 0,047, **p = 0,0093, ***p < 0,001, n = 4 mus). Toveis RM ANOVA for å sammenligne forsøkstyper (*p = 0,028, **p = 0,008, n = 4 mus, to hanner og to hunner, gjennomsnitt ± SEM). Forkortelser: CS = betinget stimulus; US = ubetinget stimulus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Endringer i musetrinnmønstre over utfordringsøkter. (A) Prosentandel av forsøk per økt der dyret gikk glipp av et trinn under økter kun i USA og parøkter. En styrkeregresjonsanalyse ble brukt for å studere læringsprosessen (*p = 0,013) og en toveis RM ANOVA for sammenligning mellom studietyper (*p = 0,032, n = 4 mus). (B) Trinntid før og etter forstyrrelser i økter bare i USA og parede økter gjennom øktene. Toveis gjentatte mål ANOVA, *p < 0,05, n = 4 mus, to hanner og to hunner, betyr ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Programvaregrensesnitt: hvordan lage et eksperiment og velge en protokoll. Skjermbilder fra programvaren som illustrerer arbeidsflyten beskrevet i protokolltrinn 2.1, som dekker trinn 2.1.4 til 2.1.8. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S2: Programvaregrensesnitt: hvordan du starter økten og eksporterer dataene. Skjermbilder fra programvaren som illustrerer arbeidsflyten beskrevet i protokolltrinn 2.2 og 2.5, som dekker trinnene 2.2.4 til 2.2.7 og 2.5.1 til 2.5.3. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S1: Statistisk tabell. Beskrivelse av alle de undersøkte variablene og de statistiske testene som er brukt, rapportert i figur 2B,C, figur 3 og figur 4A,B. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Erasmus-stigen gir store fordeler for vurdering av motorfenotype utover dagens tilnærminger. Testing er enkel å utføre, automatisert, reproduserbar, og lar forskere vurdere ulike aspekter av motorisk oppførsel separat ved hjelp av en enkelt musekohort. I den nåværende studien tillot reproduserbarhet generering av robuste data med et lite antall WT-mus som utnyttet funksjonene til enheten, eksperimentell design og analysemetoder. For eksempel, sammenlignet med tradisjonelle stråleganganalyser, øker tillegg av motiverende signaler (luft og lys) for å komme inn i stigebanen og medvinden for å fullføre forsøket konsistensen og hopper over behovet for eksperimentintervensjon som er en viktig kilde til variabilitet.

En luftkompressor system er nødvendig for å generere en luftstrøm som kan justeres til retning og posisjon av musen. Luftstrømmen skaper en 30 km/t motvind fra motsatt retning når en mus forsøker å forlate målboksen før den planlagte prøvestarten, noe som gjør at musene kommer tilbake til målboksen. Det genererer også en konstant medvind (1 til 16 km / t) under forsøket til musen krysser stigen helt og går inn i motsatt målboks. Uten trykkluft som et insentiv til å krysse stigen, stopper mus ofte på trinnene og reverserer retninger i rolig tempo, noe som introduserer en utforskende variabel kontraproduktiv for analysen.

Standardprotokollen beskrevet her gir målinger av grunnleggende finmotorisk koordinasjon og læring (uforstyrrede økter), samt tilpasning til utfordringer og assosiativ motorisk læring (utfordringsøkter) over et tidsrom på 8 dager. Oppgaven er enkel for WT-musestammer som vanligvis brukes til nevrovitenskapsstudier som C57Bl6J-musene som brukes her, og er trygg, uten skader observert i noen av testøktene. I tillegg oppdaget vi ikke tegn på tretthet sammenlignet med andre motortester som rotarod eller tredemølle.

I løpet av den 4 dagers innledende fasen mestrer WT-mus ferdigheten og krysser stigen ved å lære å ta i bruk det mest effektive løpsmønsteret (H-H-trinn) og feiltrinn forekommer sjelden innen dag 4 (figur 2B,C). På dag 5 i den andre fasen er musene tregere når de først møter hindringen, men tilpasser seg raskt (figur 3, kun USA). Kobling av hindringen med en kondisjonsstimulus (tone) letter læringen i den grad at prøvevarighet er lik forsøk der hindringen ikke er presentert (figur 3, paret). Det er verdt å merke seg at antallet forsøk med feiltrinn forble konstant gjennom studier kun i USA (figur 4A), mens en signifikant reduksjon ble observert i parvise økter (figur 4A), noe som bekrefter effektiviteten av den assosiative læringsprosessen.

Vi foreslår en arbeidsflyt for analyse av representative parametere levert av Erasmus Ladder-programvaren. Styrkeregresjonsanalysen tillot oss å registrere signifikante læringskurver og oppdage forskjeller i utfordret versus assosiativ læring ved hjelp av fire WT-mus. Basert på tilleggslitteratur og piloteksperimenter, kan eksperimentelle design som involverer mutante eller behandlede mus kreve økende antall mus til 7-10 mus ^4,5,6. I våre hender var 42 forsøk per økt et optimalt tall for å oppnå robuste data med en liten musekohort fordi gjennomsnitt av flere forsøk reduserer variabiliteten. Selv om tallet kan virke høyt, tar hver 42 prøveøkt mellom 15 min og 35 min, og 12-16 mus kan med rimelighet testes per dag. Prøvevarigheten (inkludert hviletid og respons på signaler pluss tid til å krysse stigen) varierer mellom 20 s og 50s, avhengig av treningsdag og type prøve.

Likevel vil allsidigheten til systemet tillate forskere å designe tilpassede protokoller ved å justere ulike innstillinger, inkludert antall økter og forsøk per dag, intensiteten og varigheten av signaler og CS, samt USAs natur. For eksempel viste dataene våre en rask læringskurve hos WT-mus, spesielt mellom dag 1 og dag 2 etter at ytelsen når et platå (figur 2B,C). Dette antydet at de ekstra 2 dagene kanskje ikke er strengt nødvendige for å teste grunnleggende motorisk læring i uforstyrrede økter, og endringer i standardprotokollen kan implementeres ved å redusere treningsvarigheten til bare 2 dager. Likevel er denne tilpasningen kanskje ikke egnet for den andre fasen av protokollen, som inkorporerer sammenflettede uforstyrrede, bare USA, CS-bare og parede forsøk. Stimuliene presenteres tilfeldig og uventet for å vurdere spesifikk atferd, og behovet for å dele eksperimentelle forsøk i disse fire kategoriene gjør 42 til et passende antall forsøk som kreves for statistisk styrke. En omorganisering av protokollen vil derfor måtte vurdere muligheten for å redusere antall uforstyrrede forsøk eller øke spesifikke utfordringsforsøk. Interstimulusintervallet (ISI) mellom CS (90 dB, 15 kHz tone) og US, her satt til 250 ms, kan også varieres for å studere stimulus-respons-assosiasjonen. Denne typen justering vil tillate forskere å titrere vanskelighetsgraden eller fokusere på forskjellig atferd i henhold til det vitenskapelige spørsmålet.

Hittil har Erasmus-stigen mest blitt brukt til å oppdage subtile feil i motorisk koordinering av cerebellar opprinnelse. For eksempel er feiltrinn et mål på lokomotorisk koordinering for hele kroppen. I denne studien ble unge voksne mus brukt, men mus så unge som P23 har blitt brukt av andre for å studere modningen av lokomotoriske funksjoner ^7,8. Ipsilaterale patologier av sentral opprinnelse kan studeres gjennom diskriminerende analyse av posisjonen til musens høyre og venstre poter. Til slutt involverer mestring av motoriske ferdigheter i Erasmus-stigen sannsynligvis andre motorstyringskretser, som involverer basalganglia, motorcortex og forbindelsesveier, inkludert corpus callosum. Kombinere dette atferdsparadigmet med cellulære, molekylære og kretsteknikker vil være nyttig for å undersøke kretsmekanismer som formidler motorisk tilpasning og kan utnyttes for å øke motorisk læring. Et slikt eksempel ville være å studere innflytelsen på aksonal myelinisering, som er svært følsom for tilegnelse av finmotoriske ferdigheter i musemodeller av demyelinisering ^9,10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.